專利名稱：一種高分子γ-聚谷氨酸的生產(chǎn)方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物發(fā)酵生產(chǎn)天然高分子產(chǎn)物的領域，具體地涉及一 種高分子量的Y -聚谷氨酸的生產(chǎn)方法。
背景技術：
在資源短缺與環(huán)境污染日趨嚴重的當今社會，進行"綠色化學產(chǎn) 品"的開發(fā)已成為世界化工產(chǎn)業(yè)的新趨向。順應于這一發(fā)展趨勢與社 會需求，Y-聚谷氨酸(Poly glutamicacid， ^ .^.4)成為了目前國內(nèi) 外正在興起且廣受生產(chǎn)者與消費者注目的新型"綠色生物高分子材 料"之一。
Y-聚谷氨酸是由D-谷氨酸或L-谷氨酸的？羧基與氨基通過酰胺 鍵連接聚合而成的氨基酸化合物。作為一種水溶性的生物高分子材料， y-PGA具有良好的生物可降解性和生物相容性，并且具有可食、對人 體和環(huán)境無毒害、吸水性與保濕性強等優(yōu)異特性，在化妝品、農(nóng)業(yè)、 醫(yī)藥和食品等領域具有廣闊的應用潛力。
關于y-PGA的制造方法，近年來國內(nèi)外主要以枯草芽孢桿菌來發(fā) 酵生產(chǎn)。例如Kubota曾從土壤中成功的分離得到一株產(chǎn)y-PGA的菌株 5ac/〃船sw6"/^ F201 (Biosci. Biotech. Biochem.， 61， 1684-1687, 1997)。 Ogawa等利用萬a"7/w w^'fc MR 141生產(chǎn)？PGA，產(chǎn)量達35g/L
(Biotechnol Lett, 22, 585-588， 2002)。李木目樺等對5a"7/M "c/zem/c^mz; ATCC9945a采用補加糖高密度培養(yǎng)的方法，使，PGA的產(chǎn)量達到55g/L (專利號，00819560.9)。但這些菌都是谷氨酸底物依存菌，生產(chǎn)時需添 加谷氨酸作為營養(yǎng)原料，因此，原料成本相對較高。近年來，我國有 研究報道經(jīng)過誘變選育的非谷氨酸底物依賴菌(萬""7/1^^&/&)在適 當?shù)呐囵B(yǎng)條件下y-PGA產(chǎn)量達18 30g/L,有望成為生產(chǎn)用菌株(施慶珊 等，專利號200610122640.5;疏秀林等，專利號200810027184.5)。但
目前生產(chǎn)上所用的這些菌株均沒有在食品工業(yè)上應用的實例。也就是說，這些產(chǎn)品在食品、醫(yī)藥品與化妝品等的直接應用于人體上的安全 性方面還有待進一步的考證。同時其發(fā)酵原料的成本與生產(chǎn)效率也有 待于進一步的改善。
到目前為止，在眾多的y-PGA的產(chǎn)生菌中，納豆菌(^c/〃w 是人類唯一具有長年的食用經(jīng)驗的菌種，其對人體的安全 性是無容置疑的。同時，由納豆菌生產(chǎn)的"PGA的分子量一般在300 萬以上，遠遠的高于其他菌種生產(chǎn)的y-PGA的分子量(分子量一般在 100萬以下)，這也意味著由納豆菌生產(chǎn)的y-PGA具有更強的粘性以及 更高的吸收與保水性能。但是，用納豆菌生產(chǎn)y-PGA時，由于固體發(fā) 酵難以實現(xiàn)規(guī)?；纳a(chǎn)，而液體發(fā)酵中由于其高粘性所帶來的供氧 的難度以及發(fā)酵體系中y-PGA分解酶的存在對，PGA產(chǎn)生的裂解作 用，使得y-PGA在大量生產(chǎn)中存在著產(chǎn)量的不穩(wěn)定性等問題。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種Y-聚谷氨酸的生產(chǎn)方法。通 過市售的納豆菌及一般公認的培養(yǎng)基為原料，通過營養(yǎng)枯竭和環(huán)境壓 力的脅迫作用來得到高產(chǎn)量的，PGA。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是 一種高分子Y-聚 谷氨酸的生產(chǎn)方法，工藝步驟如下
1) 菌種的活化將納豆菌，接種于活化培養(yǎng)基中，活化培養(yǎng)基的
組成為葡萄糖5-20g/L，蛋白凍5-20g/L，酵母粉5-20g/L，氯化鈉1-5 g/L，瓊脂15-20g/L;于35 38。C，培養(yǎng)40 55小時；
2) 種子培養(yǎng)經(jīng)活化的菌種接入裝有200ml培養(yǎng)基的500ml三角 瓶中，在35 38。C、 150 250轉/分鐘的轉速下，培養(yǎng)20 24小時， 培養(yǎng)基組成為葡萄糖5-20g/L，蛋白凍5-20g/L，酵母粉5-20g/L，氯 化鈉1-5 g/L;
3) 發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子液按10000 cfiz/ml的比例接種到3.5 L發(fā)酵培養(yǎng)液中進行發(fā)酵罐培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)液組成為葡萄糖5-20 g/L， 玉米淀粉5-20 g/L，大豆蛋白5-20 g/L，氯化鈉1-5 g/L，碳酸鈣0.05-0.4g/L，硫酸鎂0.05-0.5 g/L，磷酸二氫鉀0.5-2.0 g/L;培養(yǎng)溫度35 38。C， 攪拌速度150 250轉/分鐘，通氣量1.0 VVM，調(diào)節(jié)罐壓0.05 0.1 MPa 下，培養(yǎng)30 40小時后，補料1.0 1.7L，繼續(xù)培養(yǎng)40 50小時；
4)發(fā)酵完畢，經(jīng)提取工藝得到產(chǎn)物Y-聚谷氨酸。
提取工藝按照常規(guī)的回收方法，發(fā)酵液經(jīng)除菌、有機溶劑(低級 醇)沉淀回收、透析等過程精制后凍結干燥，得到產(chǎn)物y-PGA。產(chǎn)物 經(jīng)GPC分析(色譜柱ZorbaxGF-250，流動相0.1 M磷酸鈉緩沖液) 分子量300萬以上。
所述的納豆菌可以是市售的商業(yè)性菌種，也可以是以這些菌株為 出發(fā)菌，通過常規(guī)的化學或生物技術的手段誘導而得的菌種。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明采用廉價易得的原料，通過外界環(huán) 境脅迫的方法提高了 y-PGA的產(chǎn)率，抑制了 Y-PGA的分解，增加了 Y-PGA生產(chǎn)的穩(wěn)定性與大分子量的高粘度特性。采用本發(fā)明的方法， ，PGA產(chǎn)率可達到31.8g/L。由于采用的納豆菌是人類唯一具有長年的 食用經(jīng)驗的菌種，因此其產(chǎn)品在食品、醫(yī)藥品與化妝品等的直接應用 上，具有安全性，可直接應用于此領域產(chǎn)品的生產(chǎn)之中。
具體實施例方式
實施例l
1、 菌種的選擇將市購的納豆菌，經(jīng)平板稀釋培養(yǎng)后，選擇拉絲 豐富、抗拉伸力強的菌落，進行分離。
2、 菌種的活化將分離得到的納豆菌，接種于活化培養(yǎng)基中，活
化培養(yǎng)基的組成為葡萄糖13g/L，蛋白凍13g/L，酵母粉13g/L，氯 化鈉3g/L，瓊脂18g/L;于37'C，培養(yǎng)48小時；
3、 種子培養(yǎng)經(jīng)活化的菌種一環(huán)接入裝有200ml培養(yǎng)基的500ml 的三角瓶中，在37-C、 200轉/分鐘的轉速下，培養(yǎng)24小時，培養(yǎng)基組 成為葡萄糖13g/L，蛋白凍13g/L，酵母粉13g/L，氯化鈉3g/L;
4、 發(fā)酵培養(yǎng)將上述培養(yǎng)好的種子液按10000 cfb/ml的比例接種 到3.5L發(fā)酵培養(yǎng)液中進行發(fā)酵罐培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)液組成為葡萄糖13g/L，玉米淀粉13 g/L，大豆蛋白13 g/L,氯化鈉3 g/L,碳酸鈣0.27g/L， 硫酸鎂0.5g/L，磷酸二氫鉀1.0g/L;培養(yǎng)溫度37"C,攪拌速度200轉 /分鐘，通氣量1.0WM，調(diào)節(jié)罐壓0.08MPa，培養(yǎng)36小時后，pH急 劇上升、營養(yǎng)出現(xiàn)枯竭時，補料1.5L，繼續(xù)培養(yǎng)48小時；
5、 Y-聚谷氨酸的回收發(fā)酵完畢，按照常規(guī)的提取工藝(Vardet al.， Biotechnology and Bioengineering, 41, 1963)回收？PGA:發(fā)酵液 經(jīng)離心除菌、乙醇沉淀回收后，將沉淀物溶解于蒸餾水中、再次用乙 醇沉淀回收，此操作重復3—4次后將沉淀物溶解于水，流水中透析24 小時后，冷凍干燥即得Y-PGA產(chǎn)品，產(chǎn)率31.8g/L。
此產(chǎn)品用1.0N的鹽酸IO(TC分解24小時后，用薄層層析檢測到其 分解產(chǎn)物為谷氨酸，說明所得到的產(chǎn)物為目的產(chǎn)物Y-PGA。所用展開 液為正丁醇/冰醋酸/水=4/1/3，發(fā)色劑為茚三酮。此y-PGA產(chǎn)品經(jīng)液 相色譜分析(色譜柱ZorbaxGF-250，流動相0.1 M磷酸鈉緩沖液)， 分子量300萬以上，純度90%以上。
實施例2
1、 菌種的選擇將市購的納豆菌，經(jīng)平板稀釋培養(yǎng)后，選擇拉絲 豐富、抗拉伸力強的菌落，進行分離。
2、 菌種的活化將分離得到的納豆菌，接種于活化培養(yǎng)基中，活
化培養(yǎng)基的組成為葡萄糖5g/L，蛋白凍5g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉 lg/L，瓊脂15g/L;于35'C，培養(yǎng)55小時；
3、 種子培養(yǎng)經(jīng)活化的菌種一環(huán)接入裝有200ml培養(yǎng)基的500ml 的三角瓶中，在35t、 150轉/分鐘的轉速下，培養(yǎng)24小時，培養(yǎng)基組 成為葡萄糖5g/L,蛋白凍5g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉lg/L;
4、 發(fā)酵培養(yǎng)將上述培養(yǎng)好的種子液按10000 cfii/ml的比例接種 到3.5L發(fā)酵培養(yǎng)液中進行發(fā)酵罐培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)液組成為葡萄糖5 g/L，玉米淀粉5g/L，大豆蛋白5g/L，氯化鈉lg/L，碳酸鈣0.05g/L, 硫酸鎂0.05g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L;培養(yǎng)溫度35。C，攪拌速度150轉 /分鐘，通氣量1.0 VVM，調(diào)節(jié)罐壓0.1 MPa，培養(yǎng)40小時后，補料l.OL，繼續(xù)培養(yǎng)50小時；
5、 Y-聚谷氨酸的回收發(fā)酵完畢，按照常規(guī)提取工藝回收，PGA。 產(chǎn)率30.1g/L。
此產(chǎn)品用l.ON的鹽酸IO(TC分解24小時后，用薄層層析檢測到其 分解產(chǎn)物為谷氨酸，說明所得到的產(chǎn)物為目的產(chǎn)物y-PGA。所用展開 液為正丁醇/冰醋酸/水=4/1/3，發(fā)色劑為茚三酮。此y-PGA產(chǎn)品經(jīng)液 相色譜分析(色譜柱ZorbaxGF-250，流動相0.1 M磷酸鈉緩沖液)， 分子量300萬以上，純度90%以上。
實施例3
1、 菌種的活化將市購的納豆菌，接種于活化培養(yǎng)基中，活化培 養(yǎng)基的組成為葡萄糖20g/L，蛋白凍20g/L，酵母粉20g/L，氯化鈉 5g/L，瓊脂20g/L;于38"C，培養(yǎng)40小時；
2、 種子培養(yǎng)經(jīng)活化的菌種一環(huán)接入裝有200ml培養(yǎng)基的500ml 的三角瓶中，在38。C、 250轉/分鐘的轉速下，培養(yǎng)20小時，培養(yǎng)基組 成為葡萄糖20g/L，蛋白凍20g/L，酵母粉20g/L，氯化鈉5g/L;
3、 發(fā)酵培養(yǎng)將上述培養(yǎng)好的種子液按10000 cfU/ml的比例接種 到3.5 L發(fā)酵培養(yǎng)液中進行發(fā)酵罐培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)液組成為葡萄糖 20g/L，玉米淀粉20 g/L，大豆蛋白20 g/L，氯化鈉5g/L，碳酸鈣0.4g/L， 硫酸鎂0.2g/L，磷酸二氫鉀2.0g/L;培養(yǎng)溫度38"C，攪拌速度250轉 /分鐘，通氣量1.0VVM，調(diào)節(jié)罐壓0.05MPa，培養(yǎng)30小時后，補料 1.7L，繼續(xù)培養(yǎng)50小時；
4、 Y-聚谷氨酸的回收發(fā)酵完畢，按照常規(guī)的提取工藝回收 ，PGA。產(chǎn)率28.7g/L。
此產(chǎn)品用l.ON的鹽酸IO(TC分解24小時后，用薄層層析檢測到其 分解產(chǎn)物為谷氨酸，說明所得到的產(chǎn)物為目的產(chǎn)物Y-PGA。所用展開 液為正丁醇/冰醋酸/水二4/1/3，發(fā)色劑為茚三酮。此，PGA產(chǎn)品經(jīng)液 相色譜分析(色譜柱ZorbaxGF-250，流動相0.1 M磷酸鈉緩沖液)， 分子量300萬以上，純度90%以上。實施例4
1、 菌種的選擇取5 — 10粒市售的納豆，放入10(TC的開水中攪 拌，制成孢子懸浮液。取此孢子懸浮液用梯度稀釋的方法接種到平板 培養(yǎng)基上，于37。C，培養(yǎng)24小時后，按照專利3822773 (日本)的簡 易方法，選擇Y-PGA蓄積量高的菌落。即選擇數(shù)十個多量的蓄積了 Y-PGA、表面不規(guī)則隆起的菌落，用玻璃移液管吸取其中的粘質(zhì)物，通 過比較其粘質(zhì)物的重量來判斷"PGA產(chǎn)量的高低。選擇產(chǎn)量高的菌落 進一步用IO(TC的開水制成孢子懸浮液。取此孢子懸浮液用梯度稀釋的 方法接種到平板培養(yǎng)基上，于37t:，培養(yǎng)24小時后選擇拉絲豐富、抗 拉伸力強的菌落，進行分離。培養(yǎng)基的組成為葡萄糖10g/L，蛋白凍 10g/L，酵母粉15g/L，氯化鈉5 g/L，磷酸二氫鈉2 g/L，磷酸氫二鈉 4g/L，硫酸鎂0.5g/L。
2、 菌種的活化將分離得到的納豆菌，接種于活化培養(yǎng)基中，活 化培養(yǎng)基的組成為葡萄糖15g/L，蛋白凍15g/L，酵母粉15g/L，氯 化鈉2g/L，瓊脂16g/L;于36'C，培養(yǎng)45小時；
3、 種子培養(yǎng)經(jīng)活化的菌種一環(huán)接入裝有200ml培養(yǎng)基的500ml 的三角瓶中，在36。C、 200轉/分鐘的轉速下，培養(yǎng)22小時，培養(yǎng)基組 成為葡萄糖15g/L，蛋白凍15g/L，酵母粉15g/L，氯化鈉2g/L;
4、 發(fā)酵培養(yǎng)將上述培養(yǎng)好的種子液按10000 cfu/ml的比例接種 到3.5 L發(fā)酵培養(yǎng)液中進行發(fā)酵罐培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)液組成為葡萄糖 15g/L，玉米淀粉15 g/L，大豆蛋白15 g/L,氯化鈉2 g/L，碳酸鈣0.15g/L， 硫酸鎂0.1g/L，磷酸二氫鉀1.5 g/L;培養(yǎng)溫度36°C,攪拌速度200轉/ 分鐘，通氣量1.0 VVM，調(diào)節(jié)罐壓0.07 MPa,培養(yǎng)36小時后，補料 1.6L，繼續(xù)培養(yǎng)47小時；
5、 Y-聚谷氨酸的回收發(fā)酵完畢，按照常規(guī)的提取工藝回收 Y-PGA。產(chǎn)率28.1g/L。
此產(chǎn)品用l.ON的鹽酸IO(TC分解24小時后，用薄層層析檢測到其 分解產(chǎn)物為谷氨酸，說明所得到的產(chǎn)物為目的產(chǎn)物Y-PGA。所用展開液為正丁醇/冰醋酸/水=4/1/3，發(fā)色劑為茚三酮。此y-PGA產(chǎn)品經(jīng)液 相色譜分析(色譜柱ZorbaxGF-250，流動相0.1 M磷酸鈉緩沖液)， 分子量300萬以上，純度90%以上。
對比例
取實施例l的納豆菌，選擇不同的發(fā)酵培養(yǎng)工藝，得到的Y-聚谷 氨酸的產(chǎn)率如表l。
表1
對比例1對比例2對比例3對比例4實施例1
(搖瓶發(fā)酵)(搖瓶發(fā)酵)(發(fā)酵罐發(fā)酵)(發(fā)酵罐發(fā)酵)
妾種量1%1%10000 cfu/ml10000 cfu/ml10000 cfu/ml
發(fā)葡萄糖1313131313
酵玉米淀粉g/L1313131313
培大豆蛋白g/L13131313
養(yǎng)蛋白凍叭13
基氯化鈉33
碳酸鈣0.270,270.270.270.27
硫酸鎂1.01.01.01.01.0
磷酸二氫鉀g/L1.01.01.01.01.0
發(fā) 酵 工 藝37 °C ， 200卬m轉 速下，培養(yǎng) %小時37 °C ， 200rpm轉 速下，培養(yǎng) 96小時37°C， 200rpm 轉速下，通氣 量l.OVVM， 罐壓為常壓 下，培養(yǎng)96 小時。37 °C , 200rpm 轉速下，通氣 量l.OVVM， 罐壓為常壓 下，培養(yǎng)36 小時后，再補 料1.5 L,繼 續(xù)培養(yǎng)48小 時37°C， 200rpm 轉速下，通氣 量l.OVVM， 罐壓為 0.08Mpa下， 培養(yǎng)36小時 后，再補料 1.5 L，繼續(xù) 培養(yǎng)48小時。
產(chǎn) 率4.8g/L6.7g/L13.1g/L。20.5g/L31.8g/L
從表1可見，采用本發(fā)明的發(fā)酵工藝，通過環(huán)境脅迫，產(chǎn)率可達31.8g/L。
9
權利要求
1、一種高分子γ-聚谷氨酸的生產(chǎn)方法，其特征在于包括如下步驟1)菌種的活化將納豆菌，接種于活化培養(yǎng)基中，活化培養(yǎng)基的組成為葡萄糖5-20g/L，蛋白凍5-20g/L，酵母粉5-20g/L，氯化鈉1-5g/L，瓊脂15-20g/L；于35～38℃，培養(yǎng)40～55小時；2)種子培養(yǎng)經(jīng)活化的菌種接入裝有200ml培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，在35～38℃、150～250轉/分鐘的轉速下，培養(yǎng)20～24小時，培養(yǎng)基組成為葡萄糖5-20g/L，蛋白凍5-20g/L，酵母粉5-20g/L，氯化鈉1-5g/L；3)發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子液按10000cfu/ml的比例接種到3.5L發(fā)酵培養(yǎng)液中進行發(fā)酵罐培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)液組成為葡萄糖5-20g/L，玉米淀粉5-20g/L，大豆蛋白5-20g/L，氯化鈉1-5g/L，碳酸鈣0.05-0.4g/L，硫酸鎂0.05-0.5g/L，磷酸二氫鉀0.5-2.0g/L；培養(yǎng)溫度35～38℃，攪拌速度150～250轉/分鐘，通氣量1.0VVM，調(diào)節(jié)罐壓0.05～0.1MPa下，培養(yǎng)30～40小時后，補料1.0～1.7L，繼續(xù)培養(yǎng)40～50小時；4)發(fā)酵完畢，經(jīng)提取工藝得到產(chǎn)物γ-聚谷氨酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高分子γ-聚谷氨酸的生產(chǎn)方法。采用的技術方案是納豆菌接種于活化培養(yǎng)基中活化；活化的菌種接入裝有200ml培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，在37℃、200轉/分鐘轉速下，培養(yǎng)24小時；培養(yǎng)好的種子液按10000cfu/ml的比例接種到3.5L發(fā)酵培養(yǎng)液中進行發(fā)酵罐培養(yǎng)；在35～38℃，150～250轉/分鐘轉速，通氣量1.0VVM下，調(diào)節(jié)罐壓0.05～0.1MPa，培養(yǎng)30～40小時后，補料1.0～1.7L，繼續(xù)培養(yǎng)40～50小時；發(fā)酵完畢，經(jīng)提取工藝得到產(chǎn)物γ-聚谷氨酸。所制得的γ-聚合谷氨酸的分子量達300以上，產(chǎn)率高，在食品、化妝品、醫(yī)藥品等的開發(fā)領域具有良好的用途。
文檔編號C12P13/00GK101597627SQ20091001239
公開日2009年12月9日 申請日期2009年7月7日 優(yōu)先權日2009年7月7日
發(fā)明者李拖平, 李蘇紅 申請人:李拖平