專利名稱：應(yīng)用真菌誘導(dǎo)白木香樹產(chǎn)生沉香的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種利用真菌誘導(dǎo)白木香樹產(chǎn)生沉
香的方法。
背景技術(shù)：
沉香(Agarwood)為瑞香科(Thymelaeceae)沉香屬(Aquilaria)植物白木香 [Aquilariasinensis(Lour. )Gilg.]含樹脂的木材，稱為國(guó)產(chǎn)沉香、土沉香、沉水香。從16 世紀(jì)沉香已作為中藥開始使用，其味辛、苦，性微溫，具行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘的功 效，用治胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急等癥。白木香含樹脂的木材為國(guó)產(chǎn)中 藥沉香的正品來(lái)源，也是我國(guó)生產(chǎn)中藥沉香的唯一植物資源，其功用與進(jìn)口沉香[同屬植 物沉香(Aquilariaagallocha Roxb.)]的含樹脂的木材相同。中藥沉香乃是中國(guó)、日本、印 度以及其他東南亞國(guó)家的傳統(tǒng)名貴藥材和名貴的天然香料。 白木香又名土沉香、香材、牙香樹、女兒香、棧香、青桂香、崖香和芫香，是一種熱帶 亞熱帶常綠喬木，為我國(guó)特有的珍貴藥用植物，主要分布在廣東、海南、廣西和福建等省，喜 生于低海拔的山地、丘陵以及路邊陽(yáng)處疏林中。近年來(lái)，對(duì)沉香的需求量劇增，使得白木香 野生資源的蘊(yùn)藏量急劇下降，1987年被列為國(guó)家珍稀瀕危三級(jí)保護(hù)植物，1999年又被國(guó)務(wù) 院批準(zhǔn)為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物。因此廣辟生產(chǎn)途徑，解決沉香資源貧乏問(wèn)題變得十 分迫切。 沉香是白木香在自然環(huán)境條件下，經(jīng)機(jī)械損傷、真菌、昆蟲等的作用下，長(zhǎng)期分泌 積累產(chǎn)生。目前，生產(chǎn)上多采用機(jī)械損傷，但存在產(chǎn)量低，品質(zhì)差，而且生產(chǎn)周期長(zhǎng)的缺陷。 利用微生物來(lái)提高沉香產(chǎn)量，改善品質(zhì)，縮短生產(chǎn)周期，是最有應(yīng)用前景的途徑之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供2株能夠誘導(dǎo)白木香樹產(chǎn)生沉香的真菌，這2株真菌都是 從白木香樹的莖部分離得到的，它們能誘導(dǎo)活體白木香樹樹干和離體白木香樹樹干分泌產(chǎn) 生與沉香化學(xué)成分相似的黃褐色物質(zhì)。 本發(fā)明的又一目的在于提供一種應(yīng)用真菌誘導(dǎo)白木香樹產(chǎn)生沉香的方法，該方法 工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低廉，生產(chǎn)周期短，充分地利用和保護(hù)了白木香樹資源，便于推廣應(yīng)用， 解決沉香藥用資源緊張的問(wèn)題。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)步驟是先培養(yǎng)真菌，再將真菌接種到白木 香樹的樹干上。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，在接種部位的周圍會(huì)產(chǎn)生與沉香化學(xué)成分相似的黃 褐色物質(zhì)，該物質(zhì)燃燒時(shí)能產(chǎn)生沉香燃燒時(shí)特有的香氣。本發(fā)明采用的2株真菌經(jīng)鑒 定分別為鐮孢屬真菌A-ll(Fusarium sp.)，保藏編號(hào)CGMCC No. 2596，和頭孢霉屬真菌 A-17(C印halosporium sp.)，保藏編號(hào)CGMCC No. 2597。這2株真菌于2008年7月16日在 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏單位地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯 路甲3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。菌株的保藏和存活證明見附件。
真菌A-ll的培養(yǎng)特性為在PDA培養(yǎng)基上菌落為粉紅色，氣生菌絲為繩索 狀，菌落背面為杏黃色，分泌橘紅色物質(zhì)，生長(zhǎng)1周菌落直徑為7. 9cm ;小型分生孢子單 孢，橢圓形或長(zhǎng)圓形，稍彎曲，5-12. 5X3-6. 5 ym;大型分生孢子雙胞，長(zhǎng)圓形，稍彎曲， 1. 5-18. 5X5-6. 7 iim。 真菌A-17的培養(yǎng)特性為在PDA培養(yǎng)基上菌落為粉紅色，分泌紅色物質(zhì)，表面絮 狀，有同心環(huán)，生長(zhǎng)1周菌落直徑為5. 5cm ;分生孢子梗簡(jiǎn)單，從菌絲直接長(zhǎng)出，單生；分生孢 子單孢，無(wú)色，卵圓形或長(zhǎng)圓形，5-11. 5 X 2. 5-5 m，常聚生于分生孢子梗頂端的液滴內(nèi)。
具體地說(shuō)，本發(fā)明所述的技術(shù)步驟方法如下
1.真菌的培養(yǎng) 將由白木香樹莖部分離得到的保藏編號(hào)為CGMCC No. 2596的真菌A_ll和保藏 編號(hào)為CGMCC No. 2597的真菌A_17分別自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于PDA 培養(yǎng)基的平皿中，恒溫培養(yǎng)15-20天；或轉(zhuǎn)接于PDA液體培養(yǎng)基或麥麩液體培養(yǎng)基中，恒 溫震蕩培養(yǎng)5-15天，或轉(zhuǎn)接于鋸末麥麩固體培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)20-50天；培養(yǎng)溫度均為 22-28 °C。 將上述培養(yǎng)的菌種接種到含有鋸末、樹葉和麥麩的鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培 養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基后直接使用。鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基中鋸末、樹葉和麥麩的重量比為
2 : i : o. 5。 2.真菌的接種 選取樹齡5年以上的白木香樹的樹干或離體樹干，通過(guò)鉆孔的方式在樹干形成直 徑0. 5-3cm，深2-15cm的接種孔，或通過(guò)橫向切割、或縱向切割、或從上向下斜向切割的方 式，在樹干形成長(zhǎng)l-6cm，寬l-6cm，深l-6cm的接種槽。接種孔或接種槽的間隔是縱向間隔 5-15cm，橫向間隔3-10cm。在接種孔或接種槽中接入鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌種，接種 后用聚丙烯薄膜包扎接種孔或接種槽。經(jīng)過(guò)3-10個(gè)月后，在接種部位周圍能產(chǎn)生與沉香化 學(xué)成分相似的黃褐色物質(zhì)。當(dāng)觀察到接種部位周圍有黃褐色物質(zhì)形成的時(shí)候，可以在黃褐 色物質(zhì)形成的區(qū)域中用上述方法重復(fù)接種真菌。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例 PDA培養(yǎng)基平皿中培養(yǎng)的真菌A-ll和A-17分別接種在鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基上生 長(zhǎng)30天，備用。 選取樹齡為5年的白木香樹，用直徑為lcm的鉆頭在樹干上鉆孔9個(gè)，孔深為 4-6cm，各個(gè)孔洞間的間隔均為10cm，其中3個(gè)孔洞中接入2克滅菌后的鋸末復(fù)合固體培養(yǎng) 基作為對(duì)照，3個(gè)孔洞接入2克上述培養(yǎng)30天的真菌A-11，3個(gè)孔洞接入2克上述培養(yǎng)30 天的真菌A-17，聚丙烯薄膜包扎接菌孔。 接種8個(gè)月后進(jìn)行觀察對(duì)照的孔洞周圍均無(wú)黃褐色物質(zhì)分泌產(chǎn)生，接入真菌 A-ll的孔洞周圍均有黃褐色物質(zhì)分泌產(chǎn)生，平均樹脂形成面積9. 8cm2 ;接入真菌A-17的孔 洞周圍均有黃褐色物質(zhì)分泌產(chǎn)生，平均樹脂形成面積8. 7cm2。從孔洞周圍取下木料燃燒時(shí)， 能產(chǎn)生獨(dú)特的沉香香味。觀察后在原接種部位再次分別接入真菌All和A17。
比較例1
4
麥麩液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的真菌A-11接種在鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)30天，備用。
選取樹齡為8年的白木香樹，在樹干上采用以下4種方式形成接種孔或接菌槽 (1)鉆孔，接種孔直徑lcm，深6cm ; (2)橫向切割，形成長(zhǎng)5cm，寬2cm，深3cm的凹槽；(3)縱 向切割，形成長(zhǎng)2cm，寬5cm，深3cm的凹槽；(4)從上向下斜向切割，形成長(zhǎng)5cm，寬0. 5cm， 深3cm的凹槽；(5)穿透樹干鉆孔，孔直徑lcm。每個(gè)接種孔或接種槽的間隔均為10cm。在 方式(1)_(4)的接種孔或接種槽中接入3g上述培養(yǎng)30天的真菌All，聚丙烯薄膜包扎接菌 部位。方式(5)形成的穿孔中未接入真菌或滅菌后的鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基，作為機(jī)械損傷 處理的對(duì)照。以上每種方式重復(fù)3次。
6個(gè)月后進(jìn)行觀察方式(5)的穿孔周圍無(wú)黃褐色物質(zhì)分泌產(chǎn)生；方式(1)_(4)的
各接種部位周圍均有黃褐色物質(zhì)分泌產(chǎn)生，平均樹脂形成面積見表1。從接種部位周圍取下
木料燃燒時(shí)，能產(chǎn)生獨(dú)特的沉香香味。 表1不同方式接種真菌A-ll的樹脂形成面積
接種方式平均樹脂形成面積(cm2)
(1)鉆 孑L9.6
(2)橫向切割10.5
(3)縱向切割8.6
(4)斜向切割12.3
(5)穿 孔- 比較例2 鋸末麥麩固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的真菌A-ll和真菌A-17分別在鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基上 生長(zhǎng)30天，備用。 選取直徑為15-40cm的白木香樹木段，對(duì)木段進(jìn)行滅活處理。用直徑為lcm的鉆頭 在木段上鉆孔9個(gè)，孔深為4-6cm，各個(gè)孔洞間的間隔均為10cm。其中3個(gè)孔洞中接入滅菌 后的鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基作為對(duì)照，3個(gè)孔洞接入2g上述培養(yǎng)30天的真菌A-ll， 3個(gè)孔洞 接入2g上述培養(yǎng)30天的真菌A-17，聚丙烯薄膜包扎接菌孔。另外，用直徑為lcm的鉆頭在 木段上穿孔3個(gè)，未接入真菌或滅菌后的鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基，作為機(jī)械損傷處理的對(duì)照。
木段于24-26t:環(huán)境中放置8個(gè)月后進(jìn)行觀察，接入滅菌后的鋸末復(fù)合固體培養(yǎng) 基的孔洞和未接入真菌或滅菌后的鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基的穿孔周圍均無(wú)黃褐色物質(zhì)分泌 產(chǎn)生；接入真菌A-ll和真菌A-17的孔洞周圍均有黃褐色物質(zhì)分泌產(chǎn)生。從孔洞周圍取下 木料燃燒時(shí)，能產(chǎn)生獨(dú)特的沉香香味。
權(quán)利要求
一種應(yīng)用真菌誘導(dǎo)白木香樹產(chǎn)生沉香的方法，包括步驟(1)真菌的培養(yǎng)將由白木香樹分離得到的保藏編號(hào)為CGMCC No.2596的真菌A-11和保藏編號(hào)為CGMCCNo.2597的真菌A-17分別自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基的平皿中，恒溫培養(yǎng)15-20天，或轉(zhuǎn)接于PDA液體培養(yǎng)基或麥麩液體培養(yǎng)基中，恒溫震蕩培養(yǎng)5-15天，或轉(zhuǎn)接于鋸末麥麩固體培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)20-50天；將上述培養(yǎng)的菌種接種到鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基后直接使用；鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基含有鋸末、樹葉和麥麩，它們的重量比為2∶1∶0.5；(2)真菌的培養(yǎng)特性保藏編號(hào)為CGMCC No.2596的菌株A-11為鐮孢屬(Fusarium sp.)真菌，在PDA培養(yǎng)基上菌落為粉紅色，氣生菌絲為繩索狀，菌落背面為杏黃色，分泌橘紅色物質(zhì)，生長(zhǎng)1周菌落直徑為7.9cm；小型分生孢子單孢，橢圓形或長(zhǎng)圓形，稍彎曲，5-12.5×3-6.5μm；大型分生孢子雙胞，長(zhǎng)圓形，稍彎曲，1.5-18.5×5-6.7μm；保藏編號(hào)為CGMCC No.2597的菌株A-17為頭孢霉屬(Cephalosporium sp.)真菌，在PDA培養(yǎng)基上菌落為粉紅色，分泌紅色物質(zhì)，表面絮狀，有同心環(huán)，生長(zhǎng)1周菌落直徑為5.5cm；分生孢子梗簡(jiǎn)單，從菌絲直接長(zhǎng)出，單生；分生孢子單孢，無(wú)色，卵圓形或長(zhǎng)圓形，5-11.5×2.5-5μm，常聚生于分生孢子梗頂端的液滴內(nèi)；(3)真菌的接種接種真菌的方法為選取樹齡5年以上的白木香樹樹干，通過(guò)鉆孔或挖槽的方式在樹干形成接種孔或接種槽；在接種孔或接種槽中接入鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌種；接種后用聚丙烯薄膜包扎接種孔或接種槽；用上述方法在白木香樹的樹干上接種真菌一次，或在第一次接種真菌后，在接種孔或接種槽的周圍形成沉香樣黃褐色物質(zhì)的初期或中期，在原接種部位或在黃褐色物質(zhì)形成區(qū)域中，用上述方法重復(fù)接種真菌。
2 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于用于鉆孔或挖槽，接種真菌A-ll和A-17 的白木香樹樹干為樹齡5年以上的活體白木香樹干或樹齡5年以上的離體白木香樹干。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于通過(guò)鉆孔的方式在樹干形成直徑 0. 5-3cm，深2-15cm的接種孔；或通過(guò)挖槽的方式在樹干形成長(zhǎng)l_6cm，寬l-6cm，深l_6cm 的接種槽。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在樹干挖接種槽的方式包括橫向切割形 成凹槽，縱向切割形成凹槽，或從上向下斜向形成凹槽。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于白木香樹樹干上接種孔或接種槽的間隔 是縱向間隔5-15cm，橫向間隔3-10cm。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于接種真菌A-ll或A-17后，在白木香樹樹 干的接種孔或接種槽周圍能產(chǎn)生與沉香化學(xué)成分相似的黃褐色物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用真菌誘導(dǎo)白木香樹產(chǎn)生沉香的技術(shù)方法，所用的2株真菌為鐮孢屬(Fusarium sp.)真菌A-11和頭孢霉屬(Cephalosporium sp.)真菌A-17，內(nèi)容包括真菌的培養(yǎng)方法和真菌的接種方法。應(yīng)用該項(xiàng)技術(shù)，可以誘導(dǎo)白木香樹的樹干分泌產(chǎn)生與沉香化學(xué)成分相似的黃褐色物質(zhì)。該項(xiàng)技術(shù)工藝簡(jiǎn)便，生產(chǎn)成本低，周期短，充分地利用和保護(hù)了白木香樹資源，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12R1/745GK101781623SQ200910000258
公開日2010年7月21日 申請(qǐng)日期2009年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月15日
發(fā)明者孟志霞, 王春蘭, 郭順星, 陳曉梅, 龔利娟 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所