專利名稱：：放射性核素標(biāo)記的腺病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及放射性核素標(biāo)記的腺病毒，涉及腫瘤治療領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：腺病毒是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，基因組長約36kb，核心由雙股DNA鏈，核蛋白TP和DNA多聚酶構(gòu)成，衣殼呈規(guī)則的20面體結(jié)構(gòu)，直徑約80-110nm。衣殼含有240個(gè)六聯(lián)體、12個(gè)五聯(lián)體及12根纖毛，除此之外還有其他一些小蛋白，如VI、VIII、IX等。六聯(lián)體是形成病毒衣殼20個(gè)三角形面的主要蛋白，12個(gè)頂端是5個(gè)五聯(lián)體亞單位和3個(gè)纖毛蛋白構(gòu)成的復(fù)合物，12根纖毛以五聯(lián)體蛋白為基底由衣殼表面伸出，纖毛頂端形成頭節(jié)區(qū)。五聯(lián)體和纖毛的頭節(jié)區(qū)可與細(xì)胞表面的病毒受體結(jié)合，在病毒感染細(xì)胞過程中起著非常重要的作用。近年來還有很多將腺病毒運(yùn)用在腫瘤生物治療中的報(bào)道，如使用復(fù)制缺陷型腺病毒作為載體搭載一些抗腫瘤因子的編碼基因，進(jìn)入體內(nèi)后再表達(dá)這些因子，期望能起到長效的抗腫瘤作用，以克服直接輸注這些抗腫瘤因子的缺陷。溶瘤性腺病毒作為治療腫瘤的一種新型手段，目前，其研究已經(jīng)取得了令人可喜的成績1—2，由于可在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制、裂解腫瘤細(xì)胞，成為本領(lǐng)域一大熱點(diǎn)。同時(shí)也有人開發(fā)能在體內(nèi)表達(dá)抗腫瘤因子的溶瘤性腺病毒，以發(fā)揮雙重功效。比如中國ZL200410046237.x中公開了一種特異性的溶瘤腺病毒，命名為腺病毒KH901，同時(shí)還公開了其制備方法其基因序列。腺病毒KH901既可在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制、裂解腫瘤細(xì)胞，而且可在腫瘤部位表達(dá)GM-CSF，刺激機(jī)體的抗腫瘤作用。目前，目前該產(chǎn)品已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段。一般認(rèn)為在傳統(tǒng)的腫瘤放化療之外，可以使用基因治療手段作為有效的補(bǔ)充，期望兩者能在通過不同的機(jī)理和途徑共同作用以達(dá)到抗腫瘤的目的。如Spear2等的研究表明電離輻射可以不改變病毒復(fù)制能力而增強(qiáng)病毒hrR3的抗瘤活性。也有實(shí)驗(yàn)證實(shí)采用腺病毒載體感染Y射線照射后的小鼠肺癌細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)lu基因編碼產(chǎn)物呈劑量依賴性擴(kuò)增，腫瘤細(xì)胞生長明顯受到抑制3。Bradley4等證實(shí)了放療聯(lián)合刪除ICP34.5的R3616進(jìn)行治療，可以更好地抑制腫瘤生長，從而提高患者的生存率。國內(nèi)外均未見放射性核素標(biāo)記腺病毒及其應(yīng)用的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的主要技術(shù)問題是改善腺病毒體內(nèi)抗腫瘤活性。解決該技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供一種由放射性核素修飾的腺病毒，該腺病毒的衣殼蛋白上修飾有放射性核素。其中，上述的放射性核素為""I、"11、"P、188Re、18bRe、9中的至少一種。其中，上述的腺病毒為溶瘤性腺病毒。優(yōu)選的，上述的溶瘤性腺病毒為腺病毒KH901。其中，上述每個(gè)腺病毒上修飾的放射性核素為5.0X10—32.0X10—2Bq。優(yōu)選的，上述每個(gè)腺病毒上修飾的放射性核素為8.3X10—39.3X10—3Bq。本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供了一種制備上述放射性核素修飾的腺病毒的方法。該方法包括以下步驟準(zhǔn)備濃度為lX1081X101()VP/ml的腺病毒溶液，然后每IOOyl腺病毒溶液中加入lX1051X107Bq的放射性核素，再每IOOU1加入N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)1100yg，室溫下加入磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH值至77.6。反應(yīng)25分鐘，再加入2%的人血清白蛋白(HSA)溶液終止反應(yīng)。優(yōu)選的方法為準(zhǔn)備濃度為8X109VP/ml的腺病毒KH901，然后每100yl腺病毒溶液加入7.4MBq1311/1251和25ygNBS，再加入pH值為7.5的0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液120yl，室溫下反應(yīng)3min，再加入IOy12。/。的HSA溶液終止反應(yīng)。本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供了上述放射性核素修飾的腺病毒在制備抗腫瘤藥物組合物中的用途。本發(fā)明所要解決的第四個(gè)技術(shù)問題是提供了一種抗腫瘤藥物組合物。該抗腫瘤藥物組合物是由上述的放射性核素修飾的腺病毒作為主要活性成分添加藥學(xué)上可接受的輔助性成分制備而成。根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，可以用放射性核素對(duì)腺病毒的衣殼蛋白進(jìn)行修飾，如共價(jià)修飾或鰲合。標(biāo)記后能使每個(gè)腺病毒的衣殼標(biāo)記上一定量的放射性核素，以達(dá)到能在體內(nèi)抑制腫瘤生長的作用。根據(jù)具體的腫瘤種類和要使用的腺病毒的量可以對(duì)每個(gè)腺病毒上的標(biāo)記量可以有一個(gè)較大的浮動(dòng)范圍，以達(dá)到腺病毒的作用與放射性核素的作用的較好的結(jié)合。對(duì)于溶瘤性腺病毒，每個(gè)腺病毒上修飾的放射性核素為5.0X10—32.0X10—2Bq是一個(gè)較好的范圍。放射性核素可通過化學(xué)鍵共價(jià)連接或者螯合到多肽或蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上進(jìn)行標(biāo)記。但是要使標(biāo)記量達(dá)到本發(fā)明的要求并且不能破壞腺病毒的結(jié)構(gòu)和活性(標(biāo)記量可根據(jù)所加入的病毒的量及通過y計(jì)數(shù)儀所測(cè)得的放射性核素的量計(jì)算得出)。螯合可以使用腺病毒衣殼蛋白氨基酸巰基鰲合金屬放射性核素，方法是用還原劑(如SnCl2、連二亞硫酸鈉、酒石酸亞錫)將腺病毒衣殼蛋白氨基酸的雙硫鍵還原為可鰲合金屬放射性核素的巰基，以完成標(biāo)記;或者通過在氨基酸殘基偶聯(lián)的雙功能鰲合劑鰲合上金屬放射性核素。雙功能螯合劑的特定立體化學(xué)結(jié)構(gòu)的螯合基團(tuán)能牢固結(jié)合核素離子，含有的活性官能基團(tuán)能借助共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)的氨基酸片段連接，這樣間接將放射性核素連在蛋白分子上，此方法對(duì)標(biāo)記物的活性影響也比較小，且體內(nèi)穩(wěn)定性也比較好。碘修飾的方法可以使用現(xiàn)有的碘標(biāo)記蛋白質(zhì)的方法(如氯胺T法，NBS法)，共價(jià)修飾的位點(diǎn)主要為衣殼蛋白上的酪氨基酸殘基，主要的修飾位點(diǎn)是取代酪氨酸苯環(huán)上的氫原子。當(dāng)然，在本發(fā)明中提供了一種放射性碘修飾溶瘤腺病毒的方法，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明能夠達(dá)到要求。放射性核素是指原子核能自發(fā)地發(fā)射出某些特殊射線而轉(zhuǎn)變成另一種核素的不穩(wěn)定核素?？梢允褂玫某Ｒ姺派湫院怂氐姆N類為1251、mI、32P、188Re、186Re、9Gy中的至少一種，本發(fā)明以1251/1311為模型作為研究的實(shí)例。本發(fā)明放射性核素標(biāo)記的腺病毒中被修飾的腺病毒可以是普通的腺病毒，也可以是溶瘤性腺病毒?？梢詫⒎派湫院怂貙?duì)腫瘤的抑制作用和溶瘤性腺病毒的抗腫瘤作用結(jié)合起來，達(dá)到更好的作用。另外也可以單獨(dú)對(duì)攜帶有抗腫瘤多肽基因的腺病毒載體進(jìn)行修飾，這樣就能將抗腫瘤多肽的作用和放射性核素的作用結(jié)合起來，起到更好的抗腫瘤效果。優(yōu)選腺病毒KH901這種能在體內(nèi)表達(dá)抗腫瘤因子的溶瘤性腺病毒。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明射性核素1311共價(jià)修飾的腺病毒不僅病毒的自身活性沒有受到影響，可以正常復(fù)制腺病毒溶瘤并分泌表達(dá)抗腫瘤因子，而且體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示:病毒溶瘤治療與放射性核素的作用相結(jié)合，可大大提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，能夠更好地抑制體內(nèi)的腫瘤生長，很好的起到了協(xié)同作用。既能起到更好的作用，同時(shí)減少了病人反復(fù)注射和反復(fù)進(jìn)行放療的痛苦與不便，減少了治療成本，提高了生活質(zhì)量，還使治療程序更簡便，提高了治療效率。為腫瘤治療開辟了新的方式。圖1為添加PBS的體積與標(biāo)記率關(guān)系圖2為荷瘤裸鼠1311-KH901顯像(前位，2h、6h、12h、24h)。圖3為荷瘤裸鼠^1311顯像(前位，2h、6h、12h、24h)。以下結(jié)合附圖通過具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明具體實(shí)施例方式實(shí)施例一本發(fā)明放射性核素修飾的腺病毒的制備一般而言，制備本發(fā)明放射性核素修飾的腺病毒的過程可簡要表示如下腺病毒-衣殼蛋白+n放射性核素^^腺病毒-衣殼蛋白一(放射性核素)n其中的放射性核素可以通過化學(xué)鍵共價(jià)連接(如1251/1311取代酪氨基酸殘基苯環(huán)的氫原子)或者通過巰基螯合金屬放射性核素或者通過偶聯(lián)在腺病毒衣殼蛋白的雙功能螯合劑螯合金屬放射性核素，這樣將放射性核素連接到腺病毒表面衣殼蛋白上。上述的n為正數(shù)，表示每個(gè)腺病毒上標(biāo)記的放射性核素的原子數(shù)，其值為使每個(gè)腺病毒上修飾的放射性核素量達(dá)到要求。由于現(xiàn)有技術(shù)難以直接檢測(cè)放射性核素的數(shù)量，故使用通用的以放射性的量來表示放射性核素?cái)?shù)量的方式。本發(fā)明中比較優(yōu)選的范圍的為使每個(gè)腺病毒上放射性核素為5.0X10—32.0X10—2Bq。更優(yōu)選的，使每個(gè)腺病毒上修飾的放射性核素為8.3X10—39.3X10—3Bq。1、材料準(zhǔn)備用BALB/c小鼠24只，體重約20g，雌雄不限，分為8組，每組3只(四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。腺病毒KH901由成都康弘生物科技有限公司提供(其其制備方法及基因序列見中國專利ZL200410046237.x);Na1251/Na1311由成都中核高通同位素股份有限公司生產(chǎn)(無載體、無還原劑、放射化學(xué)純度》96%，pH值7.08.0，y雜質(zhì)〈0.1%)，S印hadexG-10為pharmacia公司生產(chǎn)(瑞士)；N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)為sigma產(chǎn)品(USA)，人血清白蛋白HSA(上海)，分析純；丙酮(成都新川化學(xué)試劑有限責(zé)任公司)，分析純；y計(jì)數(shù)儀(國營二六二廠)，ESJ120-4電子分析天平(沈陽)，漩渦混合器XW-80A(上海醫(yī)科大學(xué))，分布收集器(上海)。2、制備方法采用N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)作為氧化劑，NBS以三蒸水溶解，濃度為O.5mg/ml;調(diào)整腿901液體為8X109VP/ml;固定1251/1311的用量，改變腿901及NBS的用量，以篩選得最佳修飾條件。各反應(yīng)管內(nèi)先加入腿901100U1，然后加入1251/1311溶液0.5yl(約7.4MBq)，最后分別加入NBS溶液30、50、70、100y1，室溫下分別加入適量的O.05mol/L的磷酸鹽緩沖液，蓋緊管口。使用漩渦混合器混勻。反應(yīng)約3分鐘后，再每管加入IOyl2。/。的HSA溶液終止反應(yīng)。保持其它條件不變，再分別考察1251/1311的用量、反應(yīng)時(shí)間、pH值、反應(yīng)體積對(duì)1251/1311-腿901標(biāo)記率的影響。標(biāo)記率(標(biāo)記產(chǎn)物與加入的總放射核素的比值)的紙層析法檢測(cè)固定相為新華I號(hào)紙，展開劑為丙酮生理鹽水=1:1(體積比)，1251/1311-KH901的Rf=0.00.1，游離lM^m工的Rf=0.9L0。采用相同方法，固定1251/1311及朋3的用量，改變腿901的量分別為25、50、75、100、130、150y1，反應(yīng)3分鐘后，取樣測(cè)標(biāo)記率。3、制備方法的優(yōu)化方法的優(yōu)化及確定a、1251/1311用量、腿901量及NBS用量與標(biāo)記率的關(guān)系1251/1311用量為7.4MBq時(shí)標(biāo)記率較高；NBS用量達(dá)到25Ug時(shí)標(biāo)記率達(dá)到最高，再增加無明顯變化，因此，反應(yīng)最佳條件為:每100ylKH901(8X10VP/mL)、7.4MBq1/1、25ygNBS。標(biāo)記率可達(dá)到78%b、反應(yīng)時(shí)間對(duì)標(biāo)記率的影響標(biāo)記率在2min內(nèi)隨時(shí)間延長快速提高，3min以后隨時(shí)間延長標(biāo)記率無明顯變化，反應(yīng)310min標(biāo)記率都能達(dá)到75。/。以上，確定反應(yīng)時(shí)間為310miruc、pH值對(duì)標(biāo)記率的影響保持其它條件不變時(shí)，pH在6.57.5時(shí)標(biāo)記率隨pH值增大而提高，到pH值7.5時(shí)標(biāo)記率最高，再增大pH值標(biāo)記率反而有所下降，確定本實(shí)驗(yàn)的最佳pH值為7.5。d、反應(yīng)體積對(duì)標(biāo)記率的影響本次實(shí)驗(yàn)通過往反應(yīng)體系中加入一定量的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)反應(yīng)體積及pH值，發(fā)現(xiàn)當(dāng)反應(yīng)體積過小時(shí)標(biāo)記率不高，可能由于溶液的緩沖能力不夠，pH值未調(diào)節(jié)到有利于反應(yīng)的范圍；隨反應(yīng)體積的增大標(biāo)記率也隨之增大，之后隨反應(yīng)體積增大，標(biāo)記率反而下降，如圖l。可能由于體積過度增大時(shí)，反應(yīng)物的有效濃度降低，分子間相互作用減弱，標(biāo)記率降低。本實(shí)驗(yàn)選擇磷酸鹽緩沖液加入體積為每IOOul反應(yīng)體系加入80y1160yl，最佳為120yl。本發(fā)明以Mather^報(bào)道的N—溴代琥珀酰亞胺(NBS)方法作為基礎(chǔ)，開發(fā)適合對(duì)腿901進(jìn)行1251/1311修飾的方法，最后確定的方法如下準(zhǔn)備濃度為1X1081X1010VP/mL的腺病毒溶液，然后每100yl腺病毒溶液中加入lX1051X107Bq的放射性核素，再每100yl加入NBS1100yg，室溫下加入磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH值至77.6。反應(yīng)25分鐘，再加入2%的人血清白蛋白(HSA)溶液終止反應(yīng)。優(yōu)選的方法為當(dāng)取IOOy1濃度為8X109VP/mL的腺病毒腿901時(shí)，加入7.4MBq1311/1251和25ygNBS，再加入pH值為7.5的0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液120y1，室溫下反應(yīng)3min，再加入IOyl2。/。的HSA溶液終止反應(yīng)。標(biāo)記率可達(dá)到78%以上。經(jīng)純化后標(biāo)記物的放化純度可達(dá)到95%以上。該方法主要針對(duì)1311和1251標(biāo)記腺病毒，反應(yīng)體系簡單，步驟簡便，標(biāo)記率高，是一種比較理想的放射性碘標(biāo)記腺病毒的方法。實(shí)施例二本發(fā)明放射性核素標(biāo)記的腺病毒的純化制備和體外穩(wěn)定性采用S印hadexG-10(0.5cmX30cm)凝膠柱層析法，使用實(shí)施例一的修飾方法制備1251/1311標(biāo)記的腺病毒(分別制備1251、1311標(biāo)記的腺病毒)，得到了標(biāo)記率高的反應(yīng)溶液后進(jìn)行分離純化。上樣前先往柱內(nèi)加入一定量的白蛋白飽和，以消除層析柱對(duì)腺病毒KH901的非特異性吸附。上樣并將樣本量定容至O.5ml，采用部分收集器連續(xù)收集淋洗液50管，1ml/管(約15滴)，每管洗脫液分別取出IOul測(cè)定各管的放射性計(jì)數(shù)(min—。，確定標(biāo)記物和游離碘的峰位，取第一峰(第一峰為1251/1311-腿901)，經(jīng)0.22um微孔濾膜過濾除菌，置于4。C保存?zhèn)溆?。?biāo)記物純化后用紙層析法測(cè)得放化純度達(dá)到95%以上，1251/1311-101901修飾產(chǎn)物中每個(gè)腿901腺病毒上修飾的1251/1311約為8.329.25X10—3Bq。將實(shí)施例二制備的腺病毒放置在4'C冰箱，用紙層析法測(cè)定標(biāo)記物于標(biāo)記后l、2、3、4、5、6、7天內(nèi)不同時(shí)間的放射化學(xué)純度。結(jié)果表明1251/1311-腿901在4。C冰箱放置7天其放化純度基本穩(wěn)定，保持在93%95%，表明其在體外具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。為了使該產(chǎn)品便于以后在臨床中使用更方便安全，可將該產(chǎn)品存儲(chǔ)在-S(TC條件下。實(shí)施例三本發(fā)明放射性核素修飾的腺病毒體內(nèi)生物學(xué)分布及穩(wěn)定性檢測(cè)目前，放射性核素用于腫瘤治療既可以直接在腫瘤局部應(yīng)用，也可以通過抗體靶向治療。為了更好地將腫瘤的病毒溶瘤治療和放射性核素治療有機(jī)結(jié)合，利用病毒溶瘤和核素協(xié)同殺傷、殺死腫瘤細(xì)胞；同時(shí)，為了探討腿901的體內(nèi)生物學(xué)特點(diǎn)，本發(fā)明進(jìn)行1251-腿901正常小鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布實(shí)驗(yàn)，既研究了1251-腿901的體內(nèi)穩(wěn)定性，也為KH901的溶瘤治療的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)準(zhǔn)備8組小鼠，每組5只，每只小鼠經(jīng)尾靜脈注射O.1ml放化純度為94%的1251-腿901。另取兩個(gè)O.lml1251-KH901作為標(biāo)準(zhǔn)源。分別于注射后15min、30min、lh、2h、4h、8h、12h、24h各取出一組小鼠斷頭取血，解剖取出各主要臟器，稱重并測(cè)定其放射性計(jì)數(shù)。結(jié)果以每克組織放射性攝取百分比(％ID/g)表示。1251-腿901標(biāo)記物在正常小鼠體內(nèi)的生物分布列于表1。結(jié)果顯示1251-腿901主要分布在肝臟中，其次在腎臟、脾臟中含量也較高，除肝臟及腎臟外24h內(nèi)各個(gè)臟器的放射性攝取隨時(shí)間的延長不斷下降，24h后肝臟及腎臟的放射性分布仍較高，腸道的放射性分布一直較低表一<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>用放射性核素"3l對(duì)特異性溶瘤重組腺病毒KH901進(jìn)行標(biāo)記及標(biāo)記物在正常小鼠體內(nèi)生物學(xué)分布試驗(yàn)，結(jié)果顯示01901可以被1251進(jìn)行修飾，修飾物經(jīng)純化后體外穩(wěn)定性好，在4'C體外放置7天后放化純可保持在93%95%。標(biāo)記物在正常小鼠體內(nèi)主要分布在肝臟，其次在腎臟、脾臟中含量也較高。24h內(nèi)各臟器的放射性攝取隨時(shí)間的延長不斷下降，24h后肝臟及腎臟的放射性分布仍較高，腸道的放射性分布一直較低。體內(nèi)生物學(xué)分布實(shí)驗(yàn)表明1251-KH901在肝中攝取較高，且滯留時(shí)間較長，提示標(biāo)記物可能對(duì)肝臟的毒副作用較大，另一方面，也提示可以進(jìn)一步研究標(biāo)記物對(duì)肝癌細(xì)胞的作用。在血液中放射性較低且清除較快，說明其顯像時(shí)本底可能較低，有作為顯像劑的潛在應(yīng)用價(jià)值。甲狀腺內(nèi)的放射性較高，可能由于沒有封閉甲狀腺，攝取游離的1251所致。各臟器的放射性分布隨著時(shí)間的延長總體呈下降趨勢(shì)，24小時(shí)后肝臟及腎臟的放射性分布仍較高，腸道的放射性分布一直較低。實(shí)施例四放射性核素標(biāo)記后KH901的生物學(xué)活性檢測(cè)該實(shí)驗(yàn)及結(jié)果如下由于KH901的E3區(qū)安插有GM-CSF的cDNA，可在腫瘤部位表達(dá)GM-CSF因子，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤作用。沈富兵等已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)KH901在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)高水平的粒細(xì)胞一單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，而在正常細(xì)胞中只有少量GM-CSF產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)通過以MOI二IOPPC和MOI二lPPC的1311-KH901感染人腫瘤細(xì)胞，24小時(shí)后采用ELISA法測(cè)定GM-CSF的免疫活性?？砷g接反映1311-腿901標(biāo)記物的生物學(xué)活性。1311-KH901在體外腫瘤細(xì)胞中表達(dá)GM-CSF的檢測(cè)將人腫瘤細(xì)胞H印G2按1X10V孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長滿孔底時(shí)，分別以MOI二IOPPC和M0I二1PPC的mi-KH901感染培養(yǎng)板各孔細(xì)胞，然后在37'C、5%C02培養(yǎng)箱中分別孵育24小時(shí)，分別收集細(xì)胞上清培養(yǎng)液，用ELISA法(按試劑盒說明書操作，試劑盒為BPBBiomedicals,Inc，測(cè)定GM-CSF免疫活性。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(；±s)表示，釆用SPSSIS.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，P值小于0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩種方法的比較用成組設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)。表2不同感染復(fù)數(shù)的l"I-KH%1在體外腫瘤細(xì)胞中GM^SF的表達(dá)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>結(jié)果列于表2?？梢姡琈0I=10PPC和M0I二1PPC的"4一KH901感染人腫瘤細(xì)胞H印G2時(shí)，可表達(dá)大量的GM-CSF，P〉0.05，兩者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明放射性標(biāo)記處理對(duì)腺病毒的生物活性無影響。實(shí)施例五本發(fā)明1311—腿901對(duì)荷人肝癌的裸鼠的治療實(shí)驗(yàn)腺病毒KH901的體外特異性抗腫瘤作用研究表明6KH901可選擇性的在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，而在正常細(xì)胞中復(fù)制能力差。沈富兵^等已經(jīng)證實(shí)KH901在荷瘤鼠體內(nèi)具有抗腫瘤作用，并表達(dá)高水平的GM-CSF。以上KH901體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均表明其會(huì)成為一種很有前途的臨床基因治療藥物。但是，KH901在體內(nèi)的生物學(xué)行為還不清楚，采用一般的藥物代謝研究方法無法了解。故本發(fā)明125I/131I-KH901的體內(nèi)功效就更加難以預(yù)測(cè)。H印G2裸鼠移植瘤模型構(gòu)建選擇指數(shù)期生長細(xì)胞計(jì)數(shù)達(dá)106107cells/ml的H印G2細(xì)胞，1000r/min離心5min，棄去上清，用PBS將細(xì)胞重懸為濃度5X1061X107cells/ml的單細(xì)胞懸液，備用。取20只裸鼠，按0.2ml/只快速將單細(xì)胞懸液接種于裸鼠右前肢內(nèi)側(cè)腋窩皮下。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格遵循無菌原則，在華西醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。2周左右，腫瘤長至約0.8cmXl.Ocm，用于實(shí)驗(yàn)。肝癌裸鼠的治療實(shí)驗(yàn)分組取20只荷人肝癌裸鼠，按體重、腫瘤大小的等級(jí)分成4個(gè)組，每組5只，再將每個(gè)組中的荷瘤裸鼠隨機(jī)分配到各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，每組4只，分別接受不同處理。a、陰性對(duì)照組(A組)每只荷瘤裸鼠經(jīng)尾靜脈注射0.2ml生理鹽水；b、陽性對(duì)照組(B組)每只荷瘤裸鼠經(jīng)尾靜脈注射O.1mg/0.2ml表阿霉素；c、1311-01901瘤體注射組(C組)每只荷瘤裸鼠經(jīng)腫瘤中心部位直接緩慢注射0.2ml1311-腿901(1.52MBq1311，1.6X109VP/每鼠)；d、1311組(D組)每只荷瘤裸鼠經(jīng)尾靜脈注射0.2mlNa1311(1.52MBq);e、KH901瘤體注射組(E組)每只荷瘤裸鼠經(jīng)腫瘤中心部位直接緩慢注射O.2mlKH901(1.6X109VP/每鼠)實(shí)施方案接受不同處理的各組動(dòng)物均在相同SPF級(jí)華西動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，并在給藥前3d至實(shí)驗(yàn)結(jié)束口服O.1XKI溶液以保護(hù)甲狀腺，陽性對(duì)照組，隔3周重復(fù)給藥一次；A組、C組、D組及E組均間隔2天重復(fù)給藥一次，共給藥3次。腫瘤生長情況檢測(cè)實(shí)驗(yàn)期間每隔3d定時(shí)專人觀察腫瘤生長情況(表面有無漬瘍、壞死等)，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的大小(長徑a、短徑b)，連續(xù)觀察各組腫瘤大小，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，觀察期為1月。按公式計(jì)算腫瘤體積及腫瘤生長抑制率腫瘤體積(cm3)V二ab2/2腫瘤抑制率(％)=〔l一(治療組開始平均瘤重-治療組結(jié)束平均瘤重)/(對(duì)照組開始平均瘤重-對(duì)照組結(jié)束平均瘤重)〕xioo%統(tǒng)計(jì)學(xué)分析全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(；±s)表示，釆用SPSSIS.O統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，P值小于0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩種方法的比較用配對(duì)t檢驗(yàn)，各荷瘤裸鼠處理組間的比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析，各組間各變量比較采用方差分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各組腫瘤生長情況見表3。_表3給藥前后腫瘤體枳的變化〔n=4,;±0<table>complextableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>可見，給藥前各處理組腫瘤體積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性，"4-KH901通過瘤內(nèi)注射給藥，與1311尾靜脈給藥組及腿901瘤內(nèi)給藥組比較，抑瘤率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；1311組、KH901瘤內(nèi)給藥組抑瘤率與陽性對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與陰性對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？梢钥闯?，1311-腿901對(duì)荷人肝癌裸鼠具有治療作用，且在本實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了比單獨(dú)使用1311組或腿901更好的效果。另外，該實(shí)驗(yàn)期間，陽性對(duì)照組有一只荷瘤裸鼠不能耐受化療藥物毒性而死亡，余荷瘤裸鼠均耐受治療，無死亡。1311-01901治療后，荷瘤裸鼠一般情況改善，食欲增加，體重增加正常。實(shí)施例六本發(fā)明1311—01901對(duì)荷人肝癌的裸鼠的顯像實(shí)驗(yàn)1311—腿901在荷瘤裸鼠體內(nèi)的核素顯像取出荷H印G2瘤(腫瘤約0.8cmXl.Ocm)裸鼠1只，仰臥固定，經(jīng)瘤內(nèi)注射0.2ml131I-KH901(3.7MBq);再取荷瘤(腫瘤約O.8cmXl.Ocm)裸鼠1只，經(jīng)瘤體內(nèi)注射相同劑量的Na1311，作為對(duì)照。注射后各自分別于2h、6h、12h、24h進(jìn)行靜態(tài)采集放射性核素顯像，觀察1311-腿90和^1311在腫瘤部位的濃聚情況。荷瘤裸鼠顯像結(jié)果如圖2可見，注射1311-腿901的荷瘤裸鼠自始至終在瘤體內(nèi)均有很強(qiáng)的放射性滯留，隨時(shí)間延長腫瘤部位的放射性攝取未見明顯減弱，24h后腫瘤仍清晰顯影，部位、大小仍與實(shí)際相符；而在整個(gè)顯像期間，僅在2h、6h時(shí)有膀胱影像外，均未見其它組織有明顯的放射性分布。但是，注射Na^4的荷瘤裸鼠自始至終均明顯見膀胱影像(見圖3)，隨時(shí)間延長膀胱、頸部顯像有增強(qiáng)的跡象，而在整個(gè)顯像期間，僅在2h時(shí)隱約可見腫瘤部位的顯像，其余時(shí)間均未見明顯的腫瘤影像。本實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明放射性核素標(biāo)記的腺病毒KH901能夠富集在腫瘤部位持續(xù)發(fā)揮功能。以上的較優(yōu)的具體實(shí)施方式是對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的舉例說明，但并非對(duì)本發(fā)明范圍的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種變型或改進(jìn)，只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的精神及所附上的權(quán)利要求書定義的范圍之內(nèi)。參考文獻(xiàn)1、沈富兵，楊春，雷寧等。特異性溶瘤重組腺病毒腿901對(duì)荷瘤鼠腫瘤生長的抑制作用和表達(dá)GM-CSF的研究。四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2007;38(3):286—3902、SpearMA，S皿F，ElingDJ，etal.Cytotoxicity,即optosis，andviralreplicationintumorcellstreatedwithoncolyticribonucleotidereductase-defectiveherpessimplextype1virus(hrR3)combinedwithionizingradiation.CancerGeneTher，2000;7:1051-10593、TangDc，Je皿elleRS，ShiZ，CarboneDP,LoyaF，ChangCH，etal.Overexpressionofadenovirus—encodedtransgeiiesfromthecytomegalovirusimmediateearlypromoterinirradiatedtumorcells.HumGeneTher，1997;8(17):2117-21244、Bradley瓜KataokaY，AdvaniS，ChungSM，AraniRB，GillespieGY，etal.Ionizingradiationimprovessurvivalinmicebearingintracranialhigh-gradegliomasinjectedwithgeneticallymodifiedherpessimplexvirus.ClinCancerRes，1999;5:1517-5225、MatherSJ，WardBG..Highefficiencyiodinationofmonoclonalantibodiesforradiotherapy.JNuclMed，1987;28⑥1034-10366、沈富兵，常建華，楊春，等。特異性溶瘤重組腺病毒KH901的體外特異性抗腫瘤作用研究。四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2007;38(1):31—3權(quán)利要求1.放射性核素標(biāo)記的腺病毒，其特征在于放射性核素修飾在腺病毒衣殼蛋白上。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的放射性核素標(biāo)記的腺病毒，其特征在于所述的放射性核素為。1、^、1SSRe、1SSRe、；Y中的至少一種。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的放射性核素標(biāo)記的腺病毒，其特征在于所述的腺病毒為溶瘤性腺病毒。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的放射性核素標(biāo)記的腺病毒，其特征在于所述的溶瘤性腺病毒為腺病毒KH901。5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的放射性核素標(biāo)記的腺病毒，其特征在于所述每個(gè)腺病毒上修飾的放射性核素為5'^10—OxlO:Bq。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的放射性核素標(biāo)記的腺病毒，其特征在于所述每個(gè)腺病毒上修飾的放射性核素為8.3X3X]C^Bq。7.制備權(quán)利要求16所述的放射性核素標(biāo)記的腺病毒的方法，其特征在于包括以下步驟加入濃度為1xx10i:'VP/ni的腺病毒溶液，然后每IOOyl腺病毒溶液中加入1X1(^—1X10'Bq的放射性核素，再每100y1加入N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)1100yg，室溫下加入磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH值至77.6，反應(yīng)25分鐘，再加入濃度為2%的人血清白蛋白溶液終止反應(yīng)。8.根據(jù)權(quán)利要求7利要求16所述的放射性核素標(biāo)記的腺病毒的方法，其特征在于包括以下步驟準(zhǔn)備濃度為8X109的腺病毒KH901，然后每IOOyl腺病毒溶液加入7.4d口I和25MSNBS，再加入pH值為7.5的o.05mol/L的磷酸鹽緩沖液120y1，室溫下反應(yīng)3min，再加入IOyl2%的人血清白蛋白溶液終止反應(yīng)。9.權(quán)利要求16任一項(xiàng)所述的放射性核素標(biāo)記的腺病毒在制備抗腫瘤藥物組合物中的用途。10.抗腫瘤藥物組合物，由權(quán)利要求16任一項(xiàng)所述的放射性核素標(biāo)記的腺病毒為主要活性成分添加藥學(xué)上可接受的輔助性成分制備而成。全文摘要本發(fā)明涉及放射性核素標(biāo)記的腺病毒，涉及腫瘤治療領(lǐng)域。該放射性核素標(biāo)記的腺病毒是將放射性核素共價(jià)或螯合修飾在腺病毒衣殼蛋白上。所述的放射性核素為可以選擇¹²⁵I、¹³¹I、³²P、¹⁸⁸Re、¹⁸⁶Re、⁹⁰Y中的至少一種。本發(fā)明放射性核素標(biāo)記的腺病毒能夠起到更好的抗腫瘤作用，為本領(lǐng)域提供了一種新的選擇。文檔編號(hào)C12N7/00GK101338303SQ20081030432公開日2009年1月7日申請(qǐng)日期2008年8月29日優(yōu)先權(quán)日2008年8月29日發(fā)明者李云春,米彥霞申請(qǐng)人:四川大學(xué)華西醫(yī)院