專利名稱：一種抵御冷凍脅迫乳桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種抵御冷凍脅迫乳桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，本發(fā)明利用高效率乳桿
菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備，大腸桿菌谷胱甘肽基因的導(dǎo)入，NICE表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建， 以及谷胱甘肽基因的誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)行該基因工程菌的構(gòu)建。屬于生物工程技術(shù) 領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳桿菌是一類使用廣泛的益生菌，在食品發(fā)酵行業(yè)被廣泛應(yīng)用。由于乳桿 菌的最適生長溫度一般在30。C-37。C，而在實(shí)際生產(chǎn)中，起酵物的冷凍保藏、低 溫培育和發(fā)酵產(chǎn)品的冷藏過程都將使乳桿菌要經(jīng)歷遠(yuǎn)低于最適生長溫度的冷凍 條件，從而影響其生命力。
研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌胞內(nèi)谷胱甘肽含量的增加能顯著提高其對(duì)于冷凍脅迫的 耐受能力，但部分乳桿菌本身不具備合成谷胱甘肽的能力，或合成谷胱甘肽的 能力較弱。將谷胱甘肽合成基因?qū)肴闂U菌，使其在少量食品級(jí)誘導(dǎo)物nisin的 誘導(dǎo)下，自身合成谷胱甘肽，提高乳桿菌對(duì)于冷凍條件的適應(yīng)能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抵御冷凍脅迫乳桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，提 高乳桿菌對(duì)于冷凍條件的適應(yīng)能力。
本發(fā)明的技術(shù)方案的詳細(xì)描述 一種抵御冷凍脅迫乳桿菌基因工程菌的構(gòu) 建方法，通過高效率乳桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備，導(dǎo)入谷胱甘肽基因的質(zhì)粒
pNZ3203的提取，NICE表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的質(zhì)粒pNZ9530的提取，質(zhì)粒pNZ3203 和pNZ9530的導(dǎo)入，以及谷胱甘肽基因的誘導(dǎo)表達(dá)；步驟為
(1)高效率乳桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備
a) 挑舊金山乳桿菌DSM2045lT單菌落接種到MMRS培養(yǎng)液中，30°C靜置 培養(yǎng)過夜；
b) 2% v/v接種至20 mL MMRS培養(yǎng)液中，30°C靜置培養(yǎng)細(xì)胞006()0至 0.5-0.8;
c) 培養(yǎng)物裝至50mL預(yù)冷的無菌離心管中，5000 rpm、 5min離心去上清， 收集菌體；
e)用與菌體等體積預(yù)冷的PEB-1洗滌菌體兩次；
e)用200 pL預(yù)冷的PEB-1重懸菌體，按每份40 pL分裝于5份1.5 mL離心管中，保存于-80。C或直接轉(zhuǎn)化；
(2) 質(zhì)粒pNZ3203的提取
f) 乳酸乳球菌NZ9000的培養(yǎng)挑選含有插入了谷胱甘肽合成關(guān)鍵酶的基 因gshA和gshB的質(zhì)粒pNZ3203的乳酸乳球菌NZ9000單菌落接種到含有25 pg/mL氯霉素的15mLGM17培養(yǎng)液中，30°C、 200rpm培養(yǎng)過夜；
g) 質(zhì)粒pNZ3203的提取合并步驟f)菌懸液100 mL，用博大泰克公司生 產(chǎn)的革蘭氏陽性菌大量質(zhì)粒提取試劑盒按使用說明提取質(zhì)粒pNZ3203，并用200 pL無菌水溶解質(zhì)粒pNZ3203;
(3) 質(zhì)粒pNZ9530的提取
h) 乳酸乳球菌MG1363的培養(yǎng)挑選含有插入了協(xié)助pNZ3203構(gòu)成NICE 表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒pNZ9530的乳酸乳球菌MG1363單菌落接種到含有紅霉素50 pg/mL的15mLGM17培養(yǎng)液中，30°C、 200rpm培養(yǎng)過夜；
i) 質(zhì)粒pNZ9530的提取合并步驟h)菌懸液100 mL，用博大泰克公司生產(chǎn) 的革蘭氏陽性菌大量質(zhì)粒提取試劑盒按使用說明提取質(zhì)粒pNZ9530，并用200
無菌水溶解質(zhì)粒pNZ9530;
(4) 質(zhì)粒pNZ3203和pNZ9530的導(dǎo)入
j)取1 pL質(zhì)粒pNZ3203和1 fiL質(zhì)粒pNZ9530與40 的上述步驟e)所得 的菌體混勻，轉(zhuǎn)至0.2cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，冰浴10min;
1)采用電穿孔儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化電壓1.75kV;電容25^lF;電阻100 Q;
1)電擊完畢向電轉(zhuǎn)化杯中加入400 添加了質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)15%蔗糖的 MRS培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至1.5mL的離心管中，30°C靜置活化2-3 h;
m)取步驟l)所得的培養(yǎng)液100 pL涂布在含有25 pg/mL氯霉素和50 pg/mL 紅霉素的MMRS瓊脂平板，30。C靜置培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)；
(5) 谷胱甘肽基因的誘導(dǎo)表達(dá)
n)將步驟m)所得單菌落接種到含有25 pg/mL氯霉素和50 pg/mL紅霉素的 MMRS培養(yǎng)液中，30°C靜置活化2-3 h;
o)在步驟n)所得培養(yǎng)液中添加終濃度為2 ng/mL的nisin和5 mmol/L的 L-半胱氨酸，30。C培養(yǎng)36-48h，得到能在nisin誘導(dǎo)下自身產(chǎn)生谷胱甘肽的舊金 山乳桿菌DSM2045r基因工程菌菌懸液。
所述的抵御冷凍脅迫乳桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，構(gòu)建了能在乳鏈菌肽 (nisin)誘導(dǎo)作用下自身產(chǎn)生谷胱甘肽的舊金山乳桿菌DSM2045r基因工程菌, 從而顯著提高菌體在冷凍保藏條件下的存活率。
相關(guān)培養(yǎng)基
GM17培養(yǎng)基5g/L胰蛋白胨，5g/L大豆胨，5g/L牛肉膏，2.5 g/L酵母 膏，0.5g/L抗壞血酸，0.25g/LMgSO4'7H2O， 1 g/L蔗糖，15g/L葡萄糖，19 g/L
5磷酸甘油二鈉，pH調(diào)節(jié)至6.9;
PEB-1緩沖液272 mmol/L蔗糖，0.5 mmol/L MgCl2 ， 0.5 mmol/L KH2P04/K2HP04 (pH7.4);
MMRS培養(yǎng)基10g/L蛋白胨，8g/L牛肉膏，4g/L酵母膏，20 g/L葡萄糖， 5g/L麥芽糖，5g/L醋酸鈉，2g/L檸檬酸銨，lg/L吐溫80， 2g/L磷酸氫二鉀， 0.2 g/L七水硫酸鎂，0.05 g/L四水硫酸錳，pH調(diào)節(jié)至6.2。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明為一種抵御冷凍脅迫乳桿菌基因工程菌的構(gòu)建 方法，主要包括高效率乳桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化；大腸桿菌谷胱甘肽 基因的導(dǎo)入；NICE表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建以及谷胱甘肽基因的誘導(dǎo)表達(dá)。通過一整套 系統(tǒng)方法，可以在3-5天內(nèi)快速的得到有效表達(dá)谷胱甘肽的目的菌。谷胱甘肽基 因的表達(dá)，有效提高了乳桿菌在冷凍脅迫條件下的生存力，降低了乳桿菌在傳 統(tǒng)保藏條件下的死亡率。此外，由于NICE表達(dá)系統(tǒng)的誘導(dǎo)物nisin對(duì)人體安全 無害，這一構(gòu)建思路能夠用于后續(xù)食品級(jí)乳桿菌的研究使用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
按照上文所述方法，將活化后的舊金山乳桿菌DSM2045r于30。C靜置培 養(yǎng)細(xì)胞OD6oo至0.5-0.8。菌懸液裝至50 mL預(yù)冷的無菌離心管中，5000 rpm、5 min 離心去上清，收集菌體，并用等體積預(yù)冷的PEB-1洗滌菌體兩次。用200pL預(yù) 冷的PEB-1重懸菌體，按每份40pL分裝于5份1.5mL離心管中，從而得到舊 金山乳桿菌DSM20451T電轉(zhuǎn)化感受態(tài)。
實(shí)施例2
按照上文所述方法，在添加終濃度25pg/mL氯霉素的培養(yǎng)條件下，從之前 構(gòu)建的乳酸乳球菌NZ9000(pNZ3203)中大量提取出含有谷胱甘肽合成關(guān)鍵酶基 因gshA和gshB的質(zhì)粒pNZ3203;并在添加終濃度50 pg/mL紅霉素的培養(yǎng)條件 下，從之前構(gòu)建的乳酸乳球菌MG1363(pNZ9530)中大量提取出含有在nisin誘導(dǎo) 下啟動(dòng)pNZ3203表達(dá)的質(zhì)粒pNZ9530。然后利用電轉(zhuǎn)化方法將質(zhì)粒pNZ3203與 質(zhì)粒pNZ9530共同轉(zhuǎn)入舊金山乳桿菌DSM204511電轉(zhuǎn)化感受態(tài)，從氯霉素+紅 霉素抗性平板上得到目的菌能在nisin誘導(dǎo)下自身產(chǎn)生谷胱甘肽的舊金山乳桿 菌DSM2045r基因工程菌菌懸液。
實(shí)施例3
將實(shí)施例1中所得舊金山乳桿菌DSM2045r基因工程菌在4。C冷凍脅迫30 d后，存活率由原始菌的0.09%提高到0.76%;在-20。C冷凍脅迫30 d后，存活 率由原始菌的0.60%提高到3.84%。
權(quán)利要求
1、一種抵御冷凍脅迫乳桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征是通過高效率乳桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備，導(dǎo)入谷胱甘肽基因的質(zhì)粒pNZ3203的提取，NICE表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的質(zhì)粒pNZ9530的提取，質(zhì)粒pNZ3203和pNZ9530的導(dǎo)入，以及谷胱甘肽基因的誘導(dǎo)表達(dá)；步驟為(1)高效率乳桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備a)挑舊金山乳桿菌DSM20451T單菌落接種到MMRS培養(yǎng)液中，30℃靜置培養(yǎng)過夜；b)2％ v/v接種至20mL MMRS培養(yǎng)液中，30℃靜置培養(yǎng)細(xì)胞OD600至0.5-0.8；c)培養(yǎng)物裝至50mL預(yù)冷的無菌離心管中，5000rpm、5min離心去上清，收集菌體；d)用與菌體等體積預(yù)冷的PEB-1洗滌菌體兩次；e)用200μL預(yù)冷的PEB-1重懸菌體，按每份40μL分裝于5份1.5mL離心管中，保存于-80℃或直接轉(zhuǎn)化；(2)質(zhì)粒pNZ3203的提取f)乳酸乳球菌NZ9000的培養(yǎng)挑選含有插入了谷胱甘肽合成關(guān)鍵酶的基因gshA和gshB的質(zhì)粒pNZ3203的乳酸乳球菌NZ9000單菌落接種到含有25μg/mL氯霉素的15mL GM17培養(yǎng)液中，30℃、200rpm培養(yǎng)過夜；g)質(zhì)粒pNZ3203的提取合并步驟f)菌懸液100mL，用博大泰克公司生產(chǎn)的革蘭氏陽性菌大量質(zhì)粒提取試劑盒按使用說明提取質(zhì)粒pNZ3203，并用200μL無菌水溶解質(zhì)粒pNZ3203；(3)質(zhì)粒pNZ9530的提取h)乳酸乳球菌MG1363的培養(yǎng)挑選含有插入了協(xié)助pNZ3203構(gòu)成NICE表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒pNZ9530的乳酸乳球菌MG1363單菌落接種到含有紅霉素50μg/mL的15mL GM17培養(yǎng)液中，30℃、200rpm培養(yǎng)過夜；i)質(zhì)粒pNZ9530的提取合并步驟h)菌懸液100mL，用博大泰克公司生產(chǎn)的革蘭氏陽性菌大量質(zhì)粒提取試劑盒按使用說明提取質(zhì)粒pNZ9530，并用200μL無菌水溶解質(zhì)粒pNZ9530；(4)質(zhì)粒pNZ3203和pNZ9530的導(dǎo)入j)取1μL質(zhì)粒pNZ3203和1μL質(zhì)粒pNZ9530與40μL的上述步驟e)所得的菌體混勻，轉(zhuǎn)至0.2cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，冰浴10min；k)采用電穿孔儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化電壓1.75kV；電容25μF；電阻100Ω；1)電擊完畢向電轉(zhuǎn)化杯中加入400μL添加了質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)15％蔗糖的MRS培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至1.5mL的離心管中，30℃靜置活化2-3h；m)取步驟1)所得的培養(yǎng)液100μL涂布在含有25μg/mL氯霉素和50μg/mL紅霉素的MMRS瓊脂平板，30℃靜置培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)；(5)谷胱甘肽基因的誘導(dǎo)表達(dá)n)將步驟m)所得單菌落接種到含有25μg/mL氯霉素和50μg/mL紅霉素的MMRS培養(yǎng)液中，30℃靜置活化2-3h；o)在步驟n)所得培養(yǎng)液中添加終濃度為2ng/mL的nisin和5mmol/L的L-半胱氨酸，30℃培養(yǎng)36-48h，得到能在nisin誘導(dǎo)下自身產(chǎn)生谷胱甘肽的舊金山乳桿菌DSM20451T基因工程菌菌懸液。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抵御冷凍脅迫乳桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法， 其特征是構(gòu)建了能在nisin誘導(dǎo)作用下自身產(chǎn)生谷胱甘肽的舊金山乳桿菌 DSM2045lT基因工程菌，從而顯著提高菌體在冷凍保藏條件下的存活率。
全文摘要
一種抵御冷凍脅迫乳桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明為一種選育抵御冷凍脅迫乳桿菌的系統(tǒng)方法，主要包括高效率乳桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備，導(dǎo)入谷胱甘肽基因的質(zhì)粒pNZ3203的提取，NICE表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的質(zhì)粒pNZ9530的提取，質(zhì)粒pNZ3203和pNZ9530的導(dǎo)入，以及谷胱甘肽基因的誘導(dǎo)表達(dá)。通過一整套系統(tǒng)方法，可以在3-5天內(nèi)快速的得到有效表達(dá)谷胱甘肽的目的菌。谷胱甘肽基因的表達(dá)，有效提高了乳桿菌在冷凍脅迫條件下的存活率，降低了乳桿菌在傳統(tǒng)保藏條件下的死亡率。此外，由于NICE表達(dá)系統(tǒng)的誘導(dǎo)物nisin對(duì)人體安全無害，這一構(gòu)建思路能夠用于后續(xù)食品級(jí)乳桿菌的研究使用。
文檔編號(hào)C12N15/74GK101440365SQ20081024412
公開日2009年5月27日 申請(qǐng)日期2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日
發(fā)明者堵國成, 廖鮮艷, 娟 張, 峰 薛, 堅(jiān) 陳 申請(qǐng)人:江南大學(xué)