專利名稱：一種多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)菌劑的制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體的說是一種多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)菌劑的制備和使
用方法。
背景技術(shù)：
多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons,簡(jiǎn)稱PAHs)是環(huán)境中普遍存在 的一類有機(jī)污染物，它通常是指一類含有兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)，以線狀、角狀或簇狀排列的 稠環(huán)型化合物，具有熔點(diǎn)和沸點(diǎn)較高、疏水性強(qiáng)、蒸汽壓小、正辛醇_水分配系數(shù)高等特性。 PAHs是重要的全球性污染物，是美國(guó)環(huán)保局制定的129種優(yōu)先污染物中的一類(MCVEETY BD et al，1988)。 環(huán)境中PAHs絕大多數(shù)積累于土壤中(Wild SR et al， 1995)，在適宜的情況下它 們可能遷移到其他環(huán)境介質(zhì)中，擴(kuò)大污染范圍并改變暴露途徑。農(nóng)田中的PAHs多由污灌所 致，它可以通過農(nóng)作物以生物鏈的形式傳遞，將其積累于人體內(nèi)，造成人體的損傷。所以多 環(huán)芳烴農(nóng)田污染土壤修復(fù)，尤其是強(qiáng)化長(zhǎng)期污染土壤的修復(fù)顯得十分重要和迫切。
多環(huán)芳烴污染土壤生物治理的相關(guān)研究有較多報(bào)道(丁克強(qiáng)等，(2001. 土壤，4 期169-178頁(yè))2001 ;Hwangs et al， 2002 ;Chang BV et al， 2002) ， 土壤微生物的降解是 去除PAHs的主要途徑。通過表面和亞表面土壤微生物的生物降解是土壤多相系統(tǒng)中去除 PAHs的主要過程，經(jīng)過適應(yīng)誘導(dǎo)，土壤中有多種微生物可以利用PAHs作為碳源和能源或利 用其它的物質(zhì)作為共代謝底物進(jìn)行多環(huán)芳烴的降解、礦化(鞏宗強(qiáng)等，(2000.生態(tài)學(xué)雜志， 19(6) :40-45.))。 多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)技術(shù)在環(huán)境治理方面已得到廣泛的研究，其中對(duì)微生物菌 劑降解效果影響因素的研究相對(duì)較少，大部分集中在微生物菌劑技術(shù)本身的研究，然而微 生物菌劑所采用的菌種對(duì)多環(huán)芳烴降解效果的影響也是至關(guān)重要的，所以篩選出好的菌種 能夠?yàn)槎喹h(huán)芳烴污染土壤修復(fù)技術(shù)提供良好的條件，是微生物菌劑制備的基礎(chǔ)。以往的微 生物菌種多以土著菌為主(宋志文等，(微生物學(xué)雜志20(4) :30-31,41. )2000 ;MeriemB et al， 1994)，引進(jìn)菌的利用少見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)菌劑的制備和使用方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為 多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)菌劑菌劑為按重量份數(shù)比為l-4 : l-4 : l-4 : l-4
的毛霉、小克銀漢、鐮刀菌和產(chǎn)黃青霉，余量為含有濃度為50-200mg/L的PAHs的真菌培 養(yǎng)液。所述真菌培養(yǎng)液按重量百分比計(jì)為蔗糖0. 05-0. 2%、酵母膏0. 03-0. 06%、 NaCl 0. 01-0. 02%、琴03 0 . 08-0. 15%、KH2P04 0 . 05-0 . 2% 、 MgS04 7H20 0. 01-0. 04% ，余量為 水分；pH5. 5 6. 0。
多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)菌劑的制備方法1)混合真菌菌懸液的制備將按重量份數(shù)為1-4 : 1-4 : 1-4 : 1-4的毛霉、小克銀漢、鐮刀菌和產(chǎn)黃青霉培養(yǎng)在培養(yǎng)液中，取重
量百分比為2-10%的混合真菌菌懸液接種于盛有培養(yǎng)液的器皿中封口，在25-2『C恒溫振 蕩培養(yǎng)3-6天；而后取出部分培養(yǎng)液，再補(bǔ)加相同量的培養(yǎng)液繼續(xù)于恒溫培養(yǎng)3-6天，待用；
2) 培養(yǎng)載體將5-10Kg的農(nóng)作物副產(chǎn)物攪拌均勻于7-10L的Ca(0H)2中，放置過夜，待用；
3) 菌劑的配制將步驟1)所得5-10%的混合真菌菌懸液加入到步驟2)的培養(yǎng)載體中，調(diào) 節(jié)使其含水量為60% _70%，室溫培養(yǎng)7-10天，即為菌劑。 所述真菌培養(yǎng)液按重量百分比計(jì)為蔗糖0. 05-0. 2 %、酵母膏0. 03-0. 06 %、 NaCl 0. 01-0. 02%、 NH4N03 0 . 08-0. 15%、 KH2P04 0 . 05-0 . 2%、 MgS04 7H20 0. 01-0. 04%， 余量為水分、pH5. 5 6. 0。所述培養(yǎng)液為含有濃度為50-200mg/L的PAHs的真菌培養(yǎng)液。 所述農(nóng)作物副產(chǎn)物按重量百分比計(jì)為玉米芯80. 0-60. 0%、稻糠10. 0-20. 0%、豆餅粉 3.0-4.0%、石膏(CaS04)0 . 05-1. 00%、 (NH4)2HP04 0 . 05-0. 10%、生石灰(Ca0)0. 8-1. 5%、 MgS04 *7H20 0. 05-0. 10X，余量為水分，pH5. 5 6. 0。所述玉米芯、稻糠和豆餅粉為經(jīng)粉碎 成O. 2-0. 6cm直徑顆粒。所述取出的培養(yǎng)液的量可為培養(yǎng)液體積的1/5-1/3，振蕩培養(yǎng)的頻 率為110-140r/min。 使用方法將所述菌劑按耕層土壤重的0. 1 % -0. 2 % ，投加到PAHs污染土壤中，處 理42-70天。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn) 1.經(jīng)濟(jì)環(huán)保，現(xiàn)有修復(fù)PAHs化合物污染土壤的技術(shù)，通常采用物理化學(xué)技術(shù)其投
資將巨大，同時(shí)可能導(dǎo)致二次污染，危害生態(tài)系統(tǒng)。而本發(fā)明采用生物修復(fù)技術(shù)其耗資小，
不會(huì)造成二次污染并且具有持續(xù)凈化作用，具有良好的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。 2.本發(fā)明的菌劑是通過相對(duì)高濃度的PAHs類化合物和無機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行馴化、篩
選而來，其生長(zhǎng)、繁殖能力及適應(yīng)性較強(qiáng)，并能保證在環(huán)境中有較高的生物量。 3.本發(fā)明的菌劑是由引進(jìn)菌組成，對(duì)環(huán)境條件要求不苛刻。對(duì)溫度、氧氣量上也沒
有特別嚴(yán)格的要求，同時(shí)使用方法簡(jiǎn)單，易于操作。 4.降解率高，采用本發(fā)明的菌劑降解PAHs類污染土壤的降解率達(dá)到 65. 35% -66. 00%。
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
實(shí)施例1 菌劑為毛霉(Mucor sp.)、小克銀漢(Cunninghamella sp.)、鐮刀菌(Fusarium sp.)和產(chǎn)黃青霉(Penicilli咖chrysogenum)(菌種購(gòu)自沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所微生物菌種 庫(kù))組成，其重量份數(shù)為l :1:2: 2，余量為含有濃度為100mg/L的PAHs的真菌培養(yǎng) 液。 所述，真菌培養(yǎng)液按重量百分比計(jì)為蔗糖O. 1%、酵母膏0.05%、 NaCl 0.01%、 NH4N03 0. 1%、KH2P04 0. 1 %、 MgS04 7H20 0. 02%、余量為99. 62%為水分，p朋.0。
所述真菌培養(yǎng)液滅菌在0. IMpa濕熱滅菌30分鐘，待冷卻后加入濃度為100mg/L 的PAHs (其購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑沈陽(yáng)有限公司)。
菌劑制備
i)混合真菌菌懸液的制備將按重量份數(shù)為i :1:2: 2的毛霉、小克銀漢、 鐮刀菌和產(chǎn)黃青霉培養(yǎng)在培養(yǎng)液中，取重量百分比為10%的混合真菌菌懸液接種于盛有 250ml盛有100ml培養(yǎng)液的三角瓶中封口 ， 25。C恒溫箱振蕩培養(yǎng)5天，振蕩培養(yǎng)的頻率為 130r/min ; 而后取出部分培養(yǎng)液，再補(bǔ)加相同量的培養(yǎng)液繼續(xù)于25t:恒溫箱中培養(yǎng)5天，待 用；所述取出的培養(yǎng)液的量可為培養(yǎng)液體積的1/3。 2)培養(yǎng)載體將5kg的農(nóng)作物副產(chǎn)物攪拌均勻于9L的Ca (OH) 2中，放置過夜，將過 夜后的培養(yǎng)載體裝入耐高壓聚乙烯袋中，每袋lkg，O. lMPa間歇滅菌二次，每次60min，冷卻 后待用；其中9L的Ca(0H)2為77g CaO溶于9L水中。 3)菌劑的配制將步驟1)所得10%的混合真菌菌懸液加入到步驟2)的培養(yǎng)載體 中，調(diào)節(jié)使其含水量為60% _70%，室溫25t:培養(yǎng)7天，即為菌劑。 所述真菌培養(yǎng)液按重量百分比計(jì)為蔗糖O. lX、酵母膏0.05X、NaC10.01X、 NH4N03 0. 1%、KH2P04 0. 1 %、 MgS04 7H20 0. 02%、余量為99. 62%為水分，p朋.0。
所述農(nóng)作物副產(chǎn)物按重量百分比計(jì)為玉米芯60.0%、稻糠15.0%、豆餅粉 3.0%、石膏(CaS04)0. 06%、 (NH4)2HP04 0 . 05%、生石灰(CaO) 1. 0%、 MgS04 7H20 0.08%、 余量為10. 81%為水分，p朋.0。所述玉米芯、稻糠和豆餅粉為經(jīng)粉碎成0. 2cm直徑顆粒。
菌劑的使用方法按耕層土壤重的0.2%，投加菌劑到人工配制含有濃度為 84. 23mg/L的PAHs 土壤中，處理時(shí)間為42天。PAHs濃度下降28. 64mg/L，降解率即可達(dá)到 66. 00%。人工配制含PAHs 土壤為IOL。
實(shí)施例2 菌劑為毛霉(Mucor sp.)、小克銀漢(Cunninghamella sp.)、鐮刀菌(Fusarium sp.)禾口產(chǎn)黃青霉(Penicilli咖chrysoge誦)組成，其重量份數(shù)為2 :2:1: l，余量為 含有濃度為50mg/L的PAHs的真菌培養(yǎng)液。 所述，真菌培養(yǎng)液按重量百分比計(jì)為蔗糖O. 15X、酵母膏0.03X、NaCl 0.02%、 NH4N03 0. 15%、KH2P04 0. 2%、MgS04 7H20 0. 03%、99. 42%為水分，pH5. 5。
菌劑制備 i)混合真菌菌懸液的制備將按重量份數(shù)為2 :2:i: i的毛霉、小克銀漢、
鐮刀菌和產(chǎn)黃青霉培養(yǎng)在培養(yǎng)液中，取重量百分比為2%的混合真菌菌懸液接種于盛有 250ml盛有100ml培養(yǎng)液的三角瓶中封口 ， 27。C恒溫箱振蕩培養(yǎng)3天，振蕩培養(yǎng)的頻率為 110r/min;而后取出部分培養(yǎng)液，再補(bǔ)加相同量的培養(yǎng)液繼續(xù)于27t:恒溫箱中培養(yǎng)3天，待 用；所述取出的培養(yǎng)液的量可為培養(yǎng)液體積的1/5。 2)培養(yǎng)載體將5kg的農(nóng)作物副產(chǎn)物攪拌均勻于9L的Ca (OH) 2中，放置過夜，將過 夜后的培養(yǎng)載體裝入耐高壓聚乙烯袋中，每袋lkg，O. lMPa間歇滅菌二次，每次60min，冷卻 后待用；其中9L的Ca(0H)2為77g CaO溶于9L水中。 3)菌劑的配制將步驟1)所得8%的混合真菌菌懸液加入到步驟2)的培養(yǎng)載體 中，調(diào)節(jié)使其含水量為60% _70%，室溫251:培養(yǎng)IO天，即為菌劑。 所述真真菌培養(yǎng)液按重量百分比計(jì)為蔗糖O. 15%、酵母膏0.03%、 NaCl 0.02%、NH4N03 0. 15%、KH2P04 0. 2%、MgS04 7H20 0. 03%、余量99. 42%為水分，pH5. 5。
所述農(nóng)作物副產(chǎn)物按重量百分比計(jì)為玉米芯75.0%、稻糠10.0%、豆餅粉4.0%、石膏(CaS04)0. 1 %、 (NH4)2HP04 0. 10%、生石灰(Ca0) 1. 0%、MgS04 7H20 0.05%、余 量為9. 75%為水分，p朋.5。所述玉米芯、稻糠和豆餅粉為經(jīng)粉碎成0. 6cm直徑顆粒。
菌劑的使用方法菌劑的使用方法按耕層土壤重的O. 15%，投加菌劑到人工配 制含有濃度為83. 72mg/L的PAHs 土壤中，處理時(shí)間為42天。PAHs濃度下降至29. 01mg/L， 降解率即可達(dá)到65. 35%。
實(shí)施例3與實(shí)施例1不同之處在于 制備方法i)混合真菌菌懸液的制備將按重量份數(shù)為3 :3:4: 4的毛霉、小
克銀漢、鐮刀菌和產(chǎn)黃青霉培養(yǎng)在培養(yǎng)液中，取重量百分比為6%的混合真菌菌懸液接種于 盛有培養(yǎng)液的器皿中封口 ，在28t:恒溫振蕩培養(yǎng)6天；而后取出部分培養(yǎng)液，再補(bǔ)加相同量 的培養(yǎng)液繼續(xù)于恒溫培養(yǎng)6天，待用；振蕩培養(yǎng)的頻率為140r/min。 2)培養(yǎng)載體將10kg的農(nóng)作物副產(chǎn)物攪拌均勻于10L的Ca (OH) 2中，放置過夜，待 用； 3)菌劑的配制將步驟1)所得5%的混合真菌菌懸液加入到步驟2)的培養(yǎng)載體 中，調(diào)節(jié)使其含水量為60 % -70 % ，室溫培養(yǎng)10天，即為菌劑。 所述真菌培養(yǎng)液按重量百分比計(jì)為蔗糖0. 05%、酵母膏0. 06%、 NaClO. 015%、 NH4N03 0 . 08%、 KH2P04 0 . 05%、 MgS04 7H20 0. 01%，余量為水分、pH5. 5 6. 0。所述培養(yǎng) 液為含有濃度為200mg/L的PAHs的真菌培養(yǎng)液。所述農(nóng)作物副產(chǎn)物按重量百分比計(jì)為玉 米芯80. 0%、稻糠20. 0%、豆餅粉3. 5%、石膏(CaS04) 1.00%、 (NH4)2HP04 0 . 08%、生石灰 (CaO) 1. 5%、MgS04 7H200. 08%，余量為水分，pH5. 5 6. 0。
權(quán)利要求
一種多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)菌劑，其特征在于菌劑為按重量份數(shù)比為1-4∶1-4∶1-4∶1-4的毛霉、小克銀漢、鐮刀菌和產(chǎn)黃青霉，余量為含有濃度為50-200mg/L的PAHs的真菌培養(yǎng)液。
2. 按權(quán)利要求1所述的多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)菌劑，其特征在于所述真菌培養(yǎng)液按重量百分比計(jì)為蔗糖0. 05-0. 2%、酵母膏0. 03-0. 06%、 NaCl 0. 01-0. 02%、 NH4N030. 08-0. 15%、KH2P04 0 . 05-0 . 2%、MgS04 7H200. 01-0. 04%，余量為水分；pH5. 5 6. 0。
3. —種按權(quán)利要求1所述的多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)菌劑的制備方法，其特征在于1)混合真菌菌懸液的制備將按重量份數(shù)為l-4 : l-4 : l-4 : l-4的毛霉、小克銀漢、鐮刀菌和產(chǎn)黃青霉培養(yǎng)在培養(yǎng)液中，取重量百分比為2-10%的混合真菌菌懸液接種于盛有培養(yǎng)液的器皿中封口，在25-28°。恒溫振蕩培養(yǎng)3-6天；而后取出部分培養(yǎng)液，再補(bǔ)加相同量的培養(yǎng)液繼續(xù)于恒溫培養(yǎng)3-6天，待用；2) 培養(yǎng)載體將農(nóng)作物副產(chǎn)物加入到Ca(0H)2中攪拌均勻，放置過夜，待用；3) 菌劑的配制將步驟1)所得5-10%的混合真菌菌懸液加入到步驟2)的培養(yǎng)載體中，調(diào)節(jié)使其含水量為60 % -70 % ，室溫培養(yǎng)7-10天，即為菌劑。
4. 按權(quán)利要求3所述的多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)菌劑的制備方法，其特征在于所述真菌培養(yǎng)液按重量百分比計(jì)為蔗糖0. 05-0. 2%、酵母膏0. 03-0. 06%、 NaCl 0. 01-0. 02%、NH4N03 0 . 08-0. 15%、KH2P04 0 . 05-0 . 2%、MgS04 7H20 0. 01-0. 04%，余量為水分、pH5. 5 6. 0。
5. 按權(quán)利要求3所述的多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)菌劑的制備方法，其特征在于所述培養(yǎng)液為含有濃度為50-200mg/L的PAHs的真菌培養(yǎng)液。
6. 按權(quán)利要求3所述的多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)菌劑的制備方法，其特征在于所述農(nóng)作物副產(chǎn)物按重量百分比計(jì)為玉米芯80. 0-60. 0 % 、稻糠10. 0-20. 0 % 、豆餅粉3. 0-4. 0%、石膏(CaS04)0. 05-1. 00%、 (NH4)2HP040. 05-0. 10%、生石灰(Ca0)0. 8-1. 5 %、MgS04 7H20 0. 05-0. 10%，余量為水分，pH5. 5 6. 0。
7. 按權(quán)利要求6所述的多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)菌劑的制備方法，其特征在于所述玉米芯、稻糠和豆餅粉為經(jīng)粉碎成0. 2-0. 6cm直徑顆粒。
8. 按權(quán)利要求3所述的多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)菌劑的制備方法，其特征在于所述取出的培養(yǎng)液的量可為培養(yǎng)液體積的1/5-1/3，振蕩培養(yǎng)的頻率為110-140r/min。
9. 一種按權(quán)利要求4所述的多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)菌劑的使用方法，其特征在于將所述菌劑按耕層土壤重的0. 1% -0. 2%，投加到PAHs污染土壤中，處理42-70天。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體的說是一種多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)菌劑的制備和使用方法。菌劑為按重量份數(shù)比為1-4∶1-4∶1-4∶1-4的毛霉、小克銀漢、鐮刀菌和產(chǎn)黃青霉，余量為含有濃度為PAHs的真菌培養(yǎng)液。制備將上述菌種在含有濃度為50-200mg/L的PAHs的真菌培養(yǎng)液中培養(yǎng)，而后將其接種在培養(yǎng)載體上培養(yǎng)，即得。本發(fā)明的菌劑是由引進(jìn)菌組成，對(duì)環(huán)境條件要求不苛刻。對(duì)溫度、氧氣量上也沒有特別嚴(yán)格的要求，同時(shí)使用方法簡(jiǎn)單，易于操作。采用本發(fā)明的菌劑降解PAHs類污染土壤的降解率達(dá)到65.35％-66.00％。
文檔編號(hào)C12R1/645GK101724566SQ20081022837
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2008年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月29日
發(fā)明者付莎莎, 馮倩, 劉宛, 臺(tái)培東, 姚德明, 許華夏, 鞠京麗 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所