專利名稱：一種發(fā)酵生產(chǎn)胰島素原的補(bǔ)料培養(yǎng)基及補(bǔ)料培養(yǎng)優(yōu)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物工程領(lǐng)域，涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)胰島素原的補(bǔ)料培養(yǎng)基，還涉及該培 養(yǎng)基的補(bǔ)料培養(yǎng)優(yōu)化方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種慢性內(nèi)分泌疾病，胰島素作為糖尿病的特效藥，用藥量大，每天臨床使 用量為幾毫克，且用藥時(shí)間長，胰島素依賴型糖尿病患者一般都終生使用胰島素。但在1982 年以前，人類應(yīng)用的全部胰島素皆來源于動(dòng)物。從動(dòng)物臟器提取的豬、牛胰島素受臟器來 源的限制，而且由于一級結(jié)構(gòu)的差異，帶來免疫原性問題，并可能導(dǎo)致一系列的副作用。 1982年世界上第一個(gè)重組藥物人胰島素(reeombinanthumnainsulin， ht)l問世，由于重組
人胰島素在一級結(jié)構(gòu)上與人體內(nèi)分泌的胰島素完全相同，療效確切，動(dòng)物胰島素就逐漸被 基因工程人胰島素所取代，而且重組人胰島素己成為占重組藥物市場份額最大的產(chǎn)品。但 是受經(jīng)濟(jì)水平和研發(fā)水平的限制，目前我國臨床上使用多為結(jié)晶豬胰島素的制劑，這與發(fā) 達(dá)國家在用藥水平上還存在相當(dāng)大的差距。我國加入WTO以后，生物制藥產(chǎn)業(yè)面臨巨大的 沖擊，國外的基因工程藥物大舉進(jìn)入國內(nèi)市場，因此研制具有技術(shù)或價(jià)格優(yōu)勢的國產(chǎn)基因 工程藥物是一個(gè)十分緊迫的任務(wù)。
隨著社會逐步進(jìn)入老齡化，我國糖尿病患者的數(shù)目一直呈上升趨勢，據(jù)專家預(yù)計(jì)，到 2010年我國糖尿病患者將達(dá)6300萬，對胰島素的需求將會越來越大。因此加快研制國產(chǎn) 基因工程人胰島素具有明顯的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。目前，市售基因工程藥物的價(jià)格一般 較普通藥物偏高，盡管基因工程人胰島素市場售價(jià)遠(yuǎn)較其它基因工程藥物低，但人胰島素 的用藥量大，特別是對胰島素依賴型糖尿病患者而言，仍是一個(gè)難以承受的負(fù)擔(dān)。對于生 產(chǎn)廠家而言，由于復(fù)雜的下游處理(變性、復(fù)性、酶切及多種層析過程)等原因，人胰島素 的生產(chǎn)成本一直居高不下，使得降價(jià)的空間很小。因此通過技術(shù)改進(jìn)，工藝優(yōu)化降低基因 工程人胰島素的生產(chǎn)成本成為十分迫切的要求。
胰島素類產(chǎn)品按照生產(chǎn)來源分為動(dòng)物胰島素、半合成胰島素和DNA重組生物合成胰島 素。與這三種分類相對應(yīng)的就是胰島素的三種生產(chǎn)方法。(1)動(dòng)物胰島素是由動(dòng)物(牛、豬) 胰臟提取的一種蛋白質(zhì)生物制劑，所含雜質(zhì)不僅對人體具有抗原性，還影響胰島素的生理
3作用，即使多次重結(jié)晶仍含少量雜質(zhì)，目前歐美各國都采用高純度胰島素，我國已能制備 高純胰島素，但因受原料限制，產(chǎn)量有限。(2)半合成人工胰島素。和人胰島素最相近的豬
胰島素，e鏈30位氨基酸，人為蘇氨酸而豬為丙氨酸，現(xiàn)已通過生化方法將豬胰島素e
鏈第30個(gè)氨基酸丙氨酸用蘇氨酸置換，即半合成人胰島素，使之更合乎人體需要而減少抗 體產(chǎn)生的機(jī)會。(3)重組人胰島素，即應(yīng)用DNA重組技術(shù)，將人胰島素基因插入細(xì)菌或酵 母的DNA，由微生物合成人胰島素，再經(jīng)純化處理即得到重組人胰島素。目前，重組人胰 島素的生產(chǎn)中應(yīng)用的宿主表達(dá)系統(tǒng)主要有大腸桿菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)。用.Eocli表達(dá)胰島素 有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)一是表達(dá)量高，表達(dá)產(chǎn)物可達(dá)到.Eocli總蛋白質(zhì)的20%-30%:二是表達(dá)產(chǎn)物為 不溶解的包涵體，經(jīng)過洗滌后即可大大提高表達(dá)產(chǎn)物的純度，因而有利于下游純化。其缺 點(diǎn)是表達(dá)出的胰島素沒有生物活性，需要復(fù)性。
目前，國內(nèi)外的研究工作者將主要的精力集中在如何優(yōu)化提取純化工藝來提高胰島素 原的表達(dá)量，而對大腸桿菌發(fā)酵過程中的補(bǔ)料分批培養(yǎng)環(huán)節(jié)研究很少。已經(jīng)公布的 CN101029323、 CN1042378、 CN1075983分別針對酵母菌、鏈霉菌及大腸桿菌生產(chǎn)胰島素前體 的發(fā)酵培養(yǎng)方法，并不涉及補(bǔ)料培養(yǎng)優(yōu)化方法。如L deMare'等在Feeding strategies:for E. coli fermentations demanding an enriched environment(Bioprocess Biosyst Eng ,2007,30:13-25)中歹!j 舉了多種補(bǔ)料培養(yǎng)方法，多以補(bǔ)碳水化合物、酵母粉等氮源、氨基酸等為主。其中ZawadaJ 禾口Swartz J等在Maintaining rapid growth in moderate density Escherichia coli fermentations. (Biotechnol Bioeng， 2005, 89:407415)中陳述了補(bǔ)加碳源對大腸桿菌發(fā)酵的意義； A-kesson'M等在Avoiding acetate accumulation in Escherichia coli cultures using feedback control of glucose feeding(BiotechnoI Bioeng，2001,73:223-230指出了添加葡萄糖和微量元素 對大腸桿菌培養(yǎng)帶來的益處。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明對人胰島素原的發(fā)酵補(bǔ)料環(huán)節(jié)進(jìn)行了綜合考慮，著力于提高大腸桿菌在發(fā)酵階 段的表達(dá)量，從而提高人胰島素的最終收率，優(yōu)化了生產(chǎn)工藝，建立了一套高表達(dá)高收率 的重組人胰島素發(fā)酵補(bǔ)料生產(chǎn)工藝。
為了達(dá)到本發(fā)明的目的，發(fā)明人另辟蹊徑，公開了一種適用于大腸桿菌發(fā)酵胰島素原 的補(bǔ)料培養(yǎng)基，該補(bǔ)料培養(yǎng)基含有用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的DMEM-高糖培養(yǎng)基(含L-谷氨酸胺， 不含丙酮酸鈉，不含碳酸氫鈉)以及其它常規(guī)的用于大腸桿菌發(fā)酵的組分。其中，其他常 規(guī)的用于大腸桿菌發(fā)酵的組分為蛋白胨,酵母粉，硫酸銨和甘油。另外，本發(fā)明的發(fā)明人針對目前大腸桿菌表達(dá)胰島素原過程中發(fā)酵密度小、表達(dá)量低 等不足，提出了一種將上述補(bǔ)料培養(yǎng)基應(yīng)用于大腸桿菌發(fā)酵胰島素原中的分批補(bǔ)料優(yōu)化方 法，即將上述補(bǔ)料培養(yǎng)基分批流加到發(fā)酵液中，其實(shí)時(shí)待調(diào)整的補(bǔ)料流加速率的確定是根 據(jù)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
根據(jù)微生物生長動(dòng)力學(xué)，實(shí)時(shí)待調(diào)整的補(bǔ)料流加速率是通過最初補(bǔ)料流加速率和下一 時(shí)刻的比生長速率確定的，而本發(fā)明人通過大量的試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)最初補(bǔ)料流加速率在
100 400ml h—'時(shí)，菌體的外源蛋白表達(dá)量具有顯著增加，優(yōu)選最初補(bǔ)料流加速率為200 400ml h一1，進(jìn)一步優(yōu)選為200 ml h_1。
本發(fā)明涉及的補(bǔ)料分批培養(yǎng)優(yōu)化方法中，比生長速率是通過最終發(fā)酵菌體密度與實(shí)時(shí) 測樣菌體密度的差值和發(fā)酵周期來確定的，具體步驟為-
(1) 確定最終大腸桿菌的發(fā)酵菌體密度和發(fā)酵周期；
(2) 補(bǔ)料流加開始后，每隔l小時(shí)取樣一次，檢測菌體密度，得到實(shí)時(shí)檢測菌體密度；
(3) 根據(jù)最終發(fā)酵菌體密度與實(shí)時(shí)測樣菌體密度的差值和發(fā)酵周期，計(jì)算出下一時(shí)刻比生長 速率。
在細(xì)胞生物技術(shù)領(lǐng)域，醒EM-高糖培養(yǎng)基是用來培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的。本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)， 將函EM-高糖培養(yǎng)基作為補(bǔ)料培養(yǎng)基的一種組分用來發(fā)酵大腸桿菌，取得了意想不到的效 果。為了使所述新型補(bǔ)料培養(yǎng)基的發(fā)酵效果得到增強(qiáng)，相應(yīng)地，本發(fā)明通過大量試驗(yàn)研究 出了補(bǔ)料分批培養(yǎng)的優(yōu)化方法，從而使胰島素原表達(dá)量有了很大提高。通過實(shí)施例可以看 出，與常規(guī)補(bǔ)料培養(yǎng)基相比，胰島素原表達(dá)量提高10%以上。根據(jù)附圖l可以看出，實(shí)施 例1-4相比于實(shí)施例5-8，表達(dá)出目的蛋白量顯著增加，雜蛋白如多聚體等蛋白所占比例 逐漸減少，經(jīng)過伯樂凝膠成像電泳數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)分析，采用本發(fā)明的補(bǔ)料培養(yǎng)基并結(jié)合本 發(fā)明的補(bǔ)料優(yōu)化方法發(fā)酵所表達(dá)的蛋白占總蛋白比例為35.3%，而只采用本發(fā)明的補(bǔ)料培 養(yǎng)基或只采用其補(bǔ)料優(yōu)化方法，或按照常規(guī)的補(bǔ)料培養(yǎng)基和補(bǔ)料方法所表達(dá)的蛋白占總蛋 白比例為23.9%，即前者比后者蛋白表達(dá)量提高11.4%，從總體上提高了收率。本發(fā)明改善 了高密度培養(yǎng)大腸桿菌時(shí)表達(dá)胰島素原時(shí)表達(dá)量低的現(xiàn)狀，具有很好的工業(yè)實(shí)用價(jià)值。
本發(fā)明與以往技術(shù)相比，還具有以下的優(yōu)點(diǎn)由于DMEM高糖培養(yǎng)基已經(jīng)商品化，便于 控制質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，含有碳源、氮源等養(yǎng)料，能夠提供給大腸桿菌足夠營養(yǎng)滿足其生長以及表 達(dá)外源蛋白的需要；而且該技術(shù)通用性強(qiáng)，大大提高了大腸桿菌表達(dá)胰島素前體等外源蛋 白的表達(dá)量。通過電泳檢測最終表達(dá)量，補(bǔ)料流速便于控制，從而更方便地控制各項(xiàng)參數(shù) 以及菌體生長速率。


附圖1補(bǔ)加DMEM培養(yǎng)基前后胰島素原表達(dá)量(SDS-PAGE電泳即比較
①-④分別為實(shí)施例l-4的胰島素原表達(dá)量⑤高分子量marker⑥中低分子量marker ⑦-⑩分別為實(shí)施例5-9的胰島素原表達(dá)量。胰島素原分子量為9000，箭頭所指方向就是 目的蛋白胰島素原的位置。電泳采用不連續(xù)SDS-PAGE電泳，具體方法見郭亮君編著的蛋白 質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)(北京科學(xué)出版社，1999， 134_136),其中濃縮膠選用5%，分離膠選 用15%。
具體實(shí)施方案
下述實(shí)施例僅僅更加詳盡地描述本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，對本發(fā)明保護(hù)的范圍并不構(gòu) 成任何限制。
實(shí)施例l
一，發(fā)酵規(guī)模及各項(xiàng)參數(shù)
發(fā)酵罐體積為50L，大腸桿菌宿主菌BL21 (DE3)PlysS，將活化好的菌種接種到LB培養(yǎng) 液中，37°C培養(yǎng)10小時(shí)，作為發(fā)酵罐用種子備用。配制發(fā)酵液培養(yǎng)基，補(bǔ)足水后121°C 滅菌30min后降溫至最適生長溫度一37。C。按照10%接種量將種子接種在50L發(fā)酵罐中， 根據(jù)基因工程菌的生長規(guī)律，按照常規(guī)方法培養(yǎng)，最初調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速250rpm，溫度保持在37°C， 空氣流量調(diào)節(jié)在10L h—、 pH值控制在7.0左右，溶解氧一直保持在40%以上。發(fā)酵最終 0Ds。。定為69，發(fā)酵周期定為19小時(shí)。培養(yǎng)兩個(gè)小時(shí)后取樣檢測菌體密度，繼續(xù)增大轉(zhuǎn)速至 350 rpm，始終保持溶解氧在40%以上，維持一定的生長速率。待轉(zhuǎn)速調(diào)至600rpm，培養(yǎng) 至6個(gè)小時(shí)后，檢測菌體密度，發(fā)酵液的600nm吸光值已經(jīng)達(dá)到15.0，菌體細(xì)胞器合成和 生長速率受限，加入自制微量元素溶液1L，此時(shí)發(fā)酵液變?yōu)槲⒓t色，生長速率繼續(xù)加快。 微量元素逐漸被消耗殆盡，發(fā)酵液變?yōu)槿榘咨?，大腸桿菌生長減慢，乙酸產(chǎn)量降低，此時(shí) 溶解氧開始瞬時(shí)升高，瞬間PH值升至7. 8以上，開始補(bǔ)入含有DMEM-高糖(含L-谷氨酸胺， 不含丙酮酸鈉，不含碳酸氫鈉)細(xì)胞培養(yǎng)基的補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料流加速率為200ml*h—、 控制氧氣流量、空氣通量，使溶解氧繼續(xù)維持在40%以上。
發(fā)酵液培養(yǎng)基配方蛋白胨5.75g/L,酵母粉5.45g/L，十二水合磷酸氫二鈉25g/L, 磷酸二氫鉀3.00 g/L，氯化鈉0.75 g/L，氯化鉀0.50 g/L,氯化銨1.00 g/L，甘油
61.50mL/L，硫酸鎂1.05g/L ，補(bǔ)足水分，發(fā)酵罐內(nèi)滅菌備用。
自制微量元素溶液配方五水合硫酸錳0.001g/L，六水合氯化鈷0.(K)4g/L， 二水合 鉬酸鈉0. 002g/L，氯化鋅0. 002g/L,硼酸0. 0005 g/L,七水合硫酸亞鐵0. 02 g/L， 二 水合氯化鈣0. 02 g/L，五水合硫酸銅0. 001 g/L。
補(bǔ)料培養(yǎng)基配方蛋白胨200g/L,酵母粉200g/L,硫酸銨50g/L,甘油200mL， DMEM(高 糖)培養(yǎng)基(含L-谷氨酸胺，不含丙酮酸鈉，不含碳酸氫鈉)200mL,補(bǔ)足水至lOOOmL,滅菌 后備用。
(二) 比生長速率A的計(jì)算
確定最初補(bǔ)料流加速率V。=200ml h—、此時(shí)發(fā)酵時(shí)間t。=10h，測得菌體密度X。(0D600) =38。 pH值和溶解氧瞬間升高為7. 7和69%時(shí)加入lg IPTG (異丙基-P -D-硫代半乳糖苷) 誘導(dǎo)，15分鐘后繼續(xù)補(bǔ)入含有L-谷氨酰胺的函EM(高糖)細(xì)胞培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)空氣、氧氣流 量以及補(bǔ)料流速，保持溶解氧維持在40%以上，使菌體生長和胰島素原表達(dá)能夠保持一致。
按照微生物生長動(dòng)力學(xué)，P=dx/dt/X，單位時(shí)間為lh，比生長速率為A，則 Xt-X。(l+K)，X^Xi(l+m)……以此類推，Xn=Xn—Jl+K—》。
預(yù)計(jì)t。后比生長速率為恒定值，即^=^=……則X = X。(l+MtOn， Xn =69， n =T-1。，可 求得Mo。
K= (X /Xo) 1/n-1= (69/38)"(19—1。)-1=0.0685259，同樣地，當(dāng)下一取樣時(shí)刻，繼續(xù)設(shè)時(shí)間 為t。，所測得菌體密度為X。，可求得下一時(shí)刻的比生長速率Mo。
(三) 根據(jù)比生長速率Mo，得出補(bǔ)料流加速率 根據(jù)微生物動(dòng)力學(xué)中提到的底物消耗方程，AS二na+n^X+ni3AP，其中mi、 m2、 1113為比
例系數(shù)，考慮到誘導(dǎo)期單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物增加和菌體量增加都很少，則AS^mJ，因時(shí)間單 位為lh，所以AS即為補(bǔ)料流加速率。還是以取樣時(shí)間t。=10h為例，所測得菌體密度X。 (0D6。。=38)，補(bǔ)料流加速率為AS。二V。二200ml h_1，比生長速率K為0.0685259，則下一時(shí) 間底物消耗ASpmA， ASyAS^Xyx^(l+K)，可以得到下面方程 AS,二AS。(1+Md) =200X (1 + 0.0685259) =213.70518 ml h—'。 同樣地，在下一取樣時(shí)段，設(shè)時(shí)間為U所測得菌體密度為X。，可求得再下一時(shí)段的AS,。
(四) 根據(jù)實(shí)時(shí)計(jì)算的補(bǔ)料流加速率補(bǔ)入改進(jìn)后的補(bǔ)料培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至放罐 根據(jù)比生長速率計(jì)算出的補(bǔ)料流加速率，能夠在菌體不同生長時(shí)期及時(shí)地調(diào)整補(bǔ)料流
速，盡可能地提高菌體生長速率，增加胰島素原表達(dá)量，使菌體本身生長與外源蛋白表達(dá) 相一致。在發(fā)酵至19小時(shí)后停止補(bǔ)料，待溶解氧反彈后發(fā)酵結(jié)束，放出發(fā)酵液離心收集菌體，檢測蛋白表達(dá)量。 實(shí)施例2
確定最初補(bǔ)料流加速率V。二200ml h—、其他參數(shù)和步驟均與實(shí)施例1 一致。 實(shí)施例3
確定最初補(bǔ)料流加速率V。二300ml h—、其他參數(shù)和步驟均與實(shí)施例1 一致。 實(shí)施例4
確定最初補(bǔ)料流加速率V。^400ml h—、其他參數(shù)和步驟均與實(shí)施例1 一致。 實(shí)施例5
補(bǔ)料培養(yǎng)基為蛋白胨200g/L,酵母粉200g/L，硫酸銨50g/L,甘油200mL，補(bǔ)足水至 1000mL,滅菌后備用。其他參數(shù)和步驟均與實(shí)施例1 一致。
實(shí)施例6
補(bǔ)料培養(yǎng)基為蛋白胨200g/L,酵母粉200g/L,硫酸銨50g/L,甘油200mL，補(bǔ)足水至 lOOOmL,滅菌后備用。其他參數(shù)和步驟均與實(shí)施例4 一致。
實(shí)施例7
補(bǔ)料培養(yǎng)基與實(shí)施例1 一致。根據(jù)常規(guī)經(jīng)驗(yàn)培養(yǎng)10個(gè)小時(shí)后補(bǔ)料；補(bǔ)料速率固定為 300ml h—'。
實(shí)施例8
補(bǔ)料培養(yǎng)基為蛋白胨200g/L,酵母粉200g/L,硫酸銨50g/L,甘油200mL，補(bǔ)足水至 lOOOmL,滅菌后備用。根據(jù)常規(guī)經(jīng)驗(yàn)培養(yǎng)10個(gè)小時(shí)后補(bǔ)料；補(bǔ)料速率固定為300ml *h—權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)胰島素原的補(bǔ)料培養(yǎng)基，其特征在于，它含有DMEM-高糖培養(yǎng)基以及其它用于發(fā)酵的組分，其中DMEM-高糖培養(yǎng)基含L-谷氨酸胺，不含丙酮酸鈉和碳酸氫鈉。
2. 如權(quán)利要求1所述的補(bǔ)料培養(yǎng)基，其特征在于，其它用于發(fā)酵的組分為蛋白胨，酵母粉， 硫酸銨和甘油。
3. —種將權(quán)利要求1所述補(bǔ)料培養(yǎng)基應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)胰島素原中的補(bǔ)料優(yōu)化方法，其特征在 于，將所述補(bǔ)料培養(yǎng)基分批流加到發(fā)酵液中，其中實(shí)時(shí)補(bǔ)料流加速率是通過最初補(bǔ)料流加 速率和下一時(shí)刻的比生長速率確定的。
4. 如權(quán)利要求3所述的補(bǔ)料優(yōu)化方法，其特征在于，最初補(bǔ)料流加速率為100 400ml h一1。
5. 如權(quán)利要求3所述的補(bǔ)料優(yōu)化方法，其特征在于，最初補(bǔ)料流加速率為200 400ml h—、
6. 如權(quán)利要求3所述的補(bǔ)料優(yōu)化方法，其特征在于，最初補(bǔ)料流加速率為200ml 『1。
7. 如權(quán)利要求3所述的補(bǔ)料優(yōu)化方法，其特征在于，比生長速率是通過最終發(fā)酵菌體密度與 實(shí)時(shí)測樣菌體密度的差值和發(fā)酵周期來確定的，具體為(1) 確定最終大腸桿菌的發(fā)酵菌體密度和發(fā)酵周期；(2) 補(bǔ)料流加開始后，每隔1小時(shí)取樣一次，檢測菌體密度，得到實(shí)時(shí)檢測菌體密度；(3) 根據(jù)最終發(fā)酵菌體密度與實(shí)時(shí)測樣菌體密度的差值和發(fā)酵周期，計(jì)算出下一時(shí)刻比生長 速率。
全文摘要
一種發(fā)酵生產(chǎn)胰島素原的補(bǔ)料培養(yǎng)基及補(bǔ)料培養(yǎng)優(yōu)化方法，屬于微生物工程領(lǐng)域。本發(fā)明針對目前大腸桿菌表達(dá)胰島素原過程中發(fā)酵密度小、表達(dá)量低等不足，提出了一種含有DMEM-高糖培養(yǎng)基的補(bǔ)料培養(yǎng)基，以及一種將這種補(bǔ)料培養(yǎng)基應(yīng)用于大腸桿菌發(fā)酵胰島素原中的分批補(bǔ)料優(yōu)化方法。本發(fā)明涉及的培養(yǎng)方法工藝易于控制，通用性強(qiáng)，彌補(bǔ)了大腸桿菌表達(dá)胰島素前體的補(bǔ)料培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)優(yōu)化方法。
文檔編號C12P21/04GK101643764SQ20081021040
公開日2010年2月10日 申請日期2008年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月9日
發(fā)明者強(qiáng)紅剛, 趙志全, 鐘傳青 申請人:魯南制藥集團(tuán)股份有限公司