專利名稱：：一種球擬酵母菌及采用該菌種發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種丙氨酸缺陷型丙酮酸高產(chǎn)菌和用該菌發(fā)酵生產(chǎn)丙翻酸的方法。
背景技術(shù)：
：丙酮酸是一種十分重要的有機(jī)酸，在化工、制藥、農(nóng)用化學(xué)品等工業(yè)以及科學(xué)研究中有著廣泛的用途。發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸具有原料成本低，來源廣泛，產(chǎn)品純度高，反應(yīng)條件溫和等諸多優(yōu)點(diǎn)，引起了研究者的廣泛興趣。在選育高產(chǎn)菌株方面，主要集中在對(duì)丙酮酸代謝去路的阻斷和加速葡萄糖到丙酮酸的代謝，目前已取的較大進(jìn)步。文獻(xiàn)Yonehara(《J.Ferment.Bioeng》.1994,78:155-159)和Miyata(《J.Ferment.Bioeng》.1996,82:475-479)報(bào)道的四種維生素營(yíng)養(yǎng)缺陷型T.g/a6ratolF00005(為煙酸(NA),維生素(B》，維生素B6，生物素(Bio))產(chǎn)酸超過50g/L。米原轍在四種維生素缺陷的基礎(chǔ)上，選育出L-Arg(《生物工學(xué)會(huì)志》2000，78(2):56-62)，L-Val和L-Leu營(yíng)養(yǎng)缺陷型(《特許公報(bào)》平4一24037),以及2-脫氧葡萄糖抗性，氨基羥乙酸抗性(《特許公報(bào)》平4—24038)菌株，使丙酮酸的產(chǎn)率提高到30.54g/g;Miyata在四種維生素缺陷的基礎(chǔ)上選育出乙酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株(JBiosciBioeng199988:173-178)，降低PDC活性，使丙酮酸產(chǎn)率提高到0.58g/g江南大學(xué)(原無錫輕工大學(xué))李寅(《工業(yè)微生物》2001.31(2):1013.)選育了乙酸滲漏型菌株，丙酮酸產(chǎn)量(300L)可達(dá)58.4g/L，產(chǎn)率0.562g/g.Yikota(BiosciBiotechnolBiochem.1994,58:2164-2167)選育硫辛酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型￡-co//W1485lip2培養(yǎng)32小時(shí)丙酮酸產(chǎn)率達(dá)0.51g/g，而以該菌株為出發(fā)菌株構(gòu)建的￡-co//TBLA-l培養(yǎng)24小時(shí)，丙酮酸產(chǎn)率達(dá)到0.6g/g。上述文件或?qū)＠麍?bào)道的技術(shù)，普遍存在的一個(gè)缺陷是生產(chǎn)成本偏高、生產(chǎn)控制要求嚴(yán)格和菌種安全性質(zhì)有待進(jìn)一步評(píng)估等。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的之一是公開一種球擬酵母菌(7^"/0戸&g/WratoDY404)本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供采用上述球擬酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。本發(fā)明所述的球擬酵母菌是一種屬于光滑酵母屬(7br"/o戸&)的球擬酵母(g/Wrato)，以下簡(jiǎn)稱DY404。該菌種的原始菌種為7brw/o/w&g/WrataDY400，是本公司實(shí)驗(yàn)室保藏菌種，是由土壤分離并且經(jīng)化學(xué)誘變篩選煙酸(NA)、硫胺素(B》，吡哆醇(B6)和生物素(Bio)四種維生素營(yíng)養(yǎng)滲漏型，在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CCTCCM1178。本菌種經(jīng)對(duì)所述菌種進(jìn)行紫外線照射、化學(xué)試劑處理(如硫酸二乙酯誘變)等所獲得的，該菌種已于2008年8月29日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏(保藏單位地址北京市朝陽區(qū)大屯路)，保藏號(hào)為:CGMCC2646(分類命名光滑球擬酵母Torulopsisgkbrata)。所述菌種的誘變和分離篩選紫外誘變從新鮮斜面上接一環(huán)DY400菌種入種子培養(yǎng)基，在500毫升三角瓶中放置70毫升種子培養(yǎng)基，在30°C，115rpm條件下培養(yǎng)20小時(shí)，離心收集細(xì)胞，洗滌，加入無菌生理鹽水到原體積，震蕩均勻，取5毫升至含有50毫升加玻璃珠的生理鹽水中震蕩。取10毫升該菌懸液入9毫升培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于磁力攪拌器上，放在20W的紫外燈下，距離30厘米，照射1分鐘。稀釋涂布在培養(yǎng)基A(完全培養(yǎng)基)，3(TC培養(yǎng)48小時(shí)，再對(duì)應(yīng)點(diǎn)種于培養(yǎng)基B(基本培養(yǎng)基)和培養(yǎng)基C(補(bǔ)充基本培養(yǎng)基)，挑取篩選生長(zhǎng)良好，而基本平板不長(zhǎng)或生長(zhǎng)較微弱的菌落。硫酸二乙酯誘變?nèi)∽贤庹T變得到菌株，接一環(huán)菌種入種子培養(yǎng)基，在500毫升三角瓶中放置70毫升種子培養(yǎng)基，在3(TC，115r/min條件下培養(yǎng)20小時(shí)，離心收集細(xì)胞，洗漆，加入磷酸緩沖液到原體積，震蕩均勻。取4毫升菌懸液加入含有16毫升磷酸緩沖液的三角瓶中，加0.2毫升硫酸二乙酯，震蕩培養(yǎng)50分鐘，立即加入0.5毫升的25%硫代硫酸鈉緩沖液終止反應(yīng)。將此反應(yīng)液稀釋涂布在培養(yǎng)基A(完全培養(yǎng)基)，30'C培養(yǎng)48小時(shí)，再對(duì)應(yīng)點(diǎn)種于培養(yǎng)基B(基本培養(yǎng)基)和培養(yǎng)基C(補(bǔ)充基本培養(yǎng)基)，挑取篩選生長(zhǎng)良好，而基本平板不長(zhǎng)或生長(zhǎng)較微弱的菌落，接種種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時(shí)。將挑選出來的菌株接一環(huán)入發(fā)酵培養(yǎng)基，根據(jù)丙酮酸產(chǎn)量高低確定復(fù)篩菌株，復(fù)篩時(shí)，對(duì)復(fù)篩用菌株的維生素營(yíng)養(yǎng)缺陷型遺傳標(biāo)記進(jìn)行確認(rèn)。所述種子培養(yǎng)液的組分如下葡萄糖40g/L，蛋白胨5g/L，KH2P04lg/L，MgS04'7H200.3g/L。所述完全培養(yǎng)基的組分如下葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，KH2P04lg/L，MgSCV7H200.4g/L，自然pH(固體培養(yǎng)基加2%重量百分比的瓊脂粉)；所述基本培養(yǎng)基的組分如下葡萄糖10g/L，硫酸銨0.5g/L，KH2P04lg/L，MgS04'7H200.4g/L，CaCl250mg/L，F(xiàn)eS0420mg/L，CuS045mg/L,MnCl22mg/L，ZnCl25mg/L，鹽酸硫胺0.01mg/L，鹽酸吡哆醇0.5mg/L，生物素0.02mg/L，煙酸7.5mg/L。所述補(bǔ)充基本培養(yǎng)基的組分如下在基本培養(yǎng)基中添加天冬氨酸，濃度為0.8g/L。上述的菌種具有如下的特征1.形態(tài)特征用普通光學(xué)顯微鏡觀察在肉湯培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)16~24h的染色培養(yǎng)物，細(xì)胞通常為球形，2.在各種培養(yǎng)基上的特征a普通肉湯瓊脂斜面中間劃直線培養(yǎng)，呈中度生長(zhǎng)，24h呈白色，表面光滑、濕潤(rùn)、無黏性。b普通肉湯瓊脂平板單菌落圓形，培養(yǎng)2430h，菌落為白色，直徑約lmm，48h約3mm，表面濕潤(rùn)、光滑并有光澤，邊緣整齊，無黏性。2.生理生化特征a.對(duì)氧要求表現(xiàn)為好氧及兼性厭氧。b.對(duì)溫度關(guān)系菌株的生長(zhǎng)溫度為1533°C，2530。C培養(yǎng)生長(zhǎng)良好。菌株在40、50、6(TC條件下處理10min，迅速冷卻后置于3(TC培養(yǎng)36h，發(fā)現(xiàn)50'C熱處理20min菌體已全部死亡。c.pH值的影響菌體在pH3~7.5均能生長(zhǎng)，但在pH5.56時(shí)生長(zhǎng)最好。d.不利用蔗糖為碳源。e.必需生長(zhǎng)因子生物素、硫胺素、煙酸和吡哆醇以及丙氨酸或天冬氨酸。3.碳源利用葡萄糖、果糖、淀粉、乙酸鈉等4.氮源利用使用氮源包括氨、硫酸銨、氯化銨、尿素、硝酸銨、蛋白胨等。采用(《Theyeastsataxonomicstudy》thirdrevisedandenlargededitedbyN丄W.Kreger-vanRij)文獻(xiàn)規(guī)定的方法，對(duì)所述菌種進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，該菌種為一種屬于光滑球擬酵母屬的菌種，但是，又與原菌種有明顯區(qū)別，其區(qū)別在于本公開菌種還具有煙酸(NA)、硫胺素(B》，吡哆醇(B6)和生物素(Bio)四種維生素營(yíng)養(yǎng)滲漏型和丙氨酸和天冬氨酸缺陷型。通過常規(guī)的發(fā)酵培養(yǎng)方法，可以培養(yǎng)所述的DY404菌，并利用其生產(chǎn)丙酮酸，其培養(yǎng)方法在許多文獻(xiàn)中，均有詳細(xì)的報(bào)道，如文獻(xiàn)《工業(yè)微生物》2001.31(2):1013.，簡(jiǎn)述如下將所述的DY404菌，接入種子培養(yǎng)基中，在2537。C震蕩培養(yǎng)或發(fā)酵罐1822小時(shí)，即可獲得培養(yǎng)物，用于發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸；所述種子培養(yǎng)液的組分如下葡萄糖40g/L,蛋白胨5g/L，KH2P04lg/L，MgS04*7H200.3g/L。該方法為一種成熟的方法，本發(fā)明不再贅述。將所述的培養(yǎng)物以110%的體積比的接種量，優(yōu)選4~6%的體積比，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度2832T:，優(yōu)選3(TC下，并加入堿性物質(zhì)，控制體系的pH為4.56.5，優(yōu)選5.5，通入空氣，攪拌發(fā)酵5060小時(shí)，然后從發(fā)酵產(chǎn)物中，收集丙酮酸；通風(fēng)為1525L/min，攪拌速度為400450r/min，所述堿性物質(zhì)為NaOH、KOH、Ca(OH)2或CaC03等。發(fā)酵培養(yǎng)基的組分如下葡萄糖100g/L，硫酸銨6g/L，KH2P042g/L，MgS(V7H200.3g/L，CaCl250mg/L,FeS0440mg/L，CuS044mg/L，MnCl22mg/L，ZnCl25mg/L，鹽酸硫胺0.01mg/L，鹽酸吡哆醇0.5mg/L，生物素0.02mg/L，煙酸7.5mg/L，天冬氨酸0.8g/L。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在丙酮酸的生物合成途徑中，丙酮酸的合成途徑短，合成能力是很強(qiáng)的。但由于丙酮酸是非?；顫姷拇x中間產(chǎn)物，是各種氨基酸和有機(jī)酸的代謝樞紐，往往不會(huì)大量積累。因此控制丙酮酸的代謝消耗是目前研究的主要方向。丙酮酸經(jīng)乙酰CoA到三羧酸循環(huán)后，經(jīng)草酰乙酸并在天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶作用下生成天冬氨酸，而天冬氨酸是天冬氨酸系氨基酸包括賴氨酸、高絲氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸和異亮氨酸等的起始物質(zhì)，這些氨基酸存在發(fā)酵液中，既消耗了能量，又增加了發(fā)酵液中的副產(chǎn)物。在光滑球擬酵母菌中，丙酮酸在轉(zhuǎn)氨酶的作用下，生成丙氨酸，再進(jìn)一步代謝為谷氨酰胺等。本發(fā)明篩選得到的菌種為同時(shí)天冬氨酸和丙氨酸缺陷型菌株。由于天冬氨酸和丙氨酸是可以相互轉(zhuǎn)換的，因此在基本培養(yǎng)基中只需添加兩種氨基酸中的一種菌種即可生長(zhǎng)。本發(fā)明公開的DY404菌，為天冬氨酸和丙氨酸缺陷型丙酮酸高產(chǎn)菌，能夠減少丙酮酸的代謝，增加了糖酸轉(zhuǎn)化率。另外，該酵母菌中不僅存在丙酮酸到丙氨酸的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，還存在天冬氨酸到丙氨酸的脫羧反應(yīng)，采用所述菌種發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸，和現(xiàn)有技術(shù)比較，在相同的生產(chǎn)周期內(nèi)產(chǎn)酸率可提高38%，轉(zhuǎn)化率提高2-3個(gè)百分點(diǎn)，具有較大的工業(yè)化生產(chǎn)的前景。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中，轉(zhuǎn)化率的定義如下產(chǎn)酸率發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵培養(yǎng)液中丙酮酸的濃度(％，w/v)。轉(zhuǎn)化率發(fā)酵過程中產(chǎn)物(丙酮酸)的生成量與碳源(葡萄糖)的投入量的比值(g/g)。實(shí)施例13從新鮮斜面取一環(huán)DY404菌接種于3只體積為5L裝液量為0.7L種子培養(yǎng)基的三角瓶中，3(TC培養(yǎng)20小時(shí)，以體積百分比為10%的接種量接入30L發(fā)酵罐，通風(fēng)為20L/min，溫度3(TC，攪拌450r/min，過程中用8.8mol/LNaOH控制pH5.5。所述種子培養(yǎng)液的組分如下葡萄糖40g/L，蛋白胨5g/L，KH2P04lg/L，MgS04'7H200.3g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基的組分如下葡萄糖100g/L，硫酸銨6g/L，KH2P042g/L，MgS04*7H200.3g/L，CaCl250mg/L,FeS0440mg/L，CuS044mg/L，MnCl22mg/L，ZnCl25mg/L，鹽酸硫胺0.01mg/L,鹽酸吡哆醇0.5mg/L，生物素0.02mg/L，煙酸7.5mg/L，毛發(fā)粉0.8g/L。然后采用膜分離方法去除細(xì)胞和其他蛋白質(zhì)，丙酮酸可從清液中用直接濃縮精餾法提取。具體的結(jié)果見表l。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)施例47從新鮮斜面取一環(huán)菌接種于500mL搖瓶，3(TC培養(yǎng)20小時(shí)，以體積百分比為1%接種量接入30L罐種子罐，培養(yǎng)15小時(shí)，以體積百分比為10%的接種量接入300L發(fā)酵罐中，通風(fēng)為8L/小時(shí)，溫度3(TC，攪拌200r/min，過程中用10mol/LNaOH控制pH為5.5。其它同實(shí)施例l。結(jié)果如表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求1.一種球擬酵母菌(Torulopsisglabrata)-DY404—CCTCC.M2646。2.—種以球擬酵母菌(ronz/c^w'sg/fl6rato)為出發(fā)菌種選育丙酮酸高產(chǎn)菌株的方法，其特征在于利用物理或化學(xué)誘變方法使得菌株具有丙氨酸或天冬氨酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，阻斷菌種丙酮酸到丙氨酸的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)。3.—種以球擬酵母菌(T^w/o/w^g/"6rato)為菌種發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的方法，其特征在于，包括先培養(yǎng)所述的球擬酵母菌(7bra/o^"g/a6rato)-DY404,再將該培養(yǎng)物在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，獲得含有丙酮酸的發(fā)酵產(chǎn)物。4，根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)液的組分如下葡萄糖40g/L，蛋白胨5g/L，KH2P04lg/L，MgS04'7H200.3g/L。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，將所述的培養(yǎng)物以110%的體積比的接種量，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度2832°C，控制體系的pH為4.56.5，通入空氣，攪拌發(fā)酵5060小時(shí)。6..根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，通風(fēng)為1525L/min，攪拌速度為400450r/min，所述堿性物質(zhì)為NaOH、KOH、Ca(OH)2或CaC03。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基的組分如下:葡萄糖100g/L，硫酸銨6g/L，KH2P042g/L，MgS04'7H200.3g/L，CaCl250mg/L，F(xiàn)eS0440mg/L，CuS044mg/L，MnCl22mg/L，ZnCl25mg/L，鹽酸硫胺0.01mg/L，鹽酸吡哆醇0.5mg/L，生物素0.02mg/L，煙酸7.5mg/L，毛發(fā)粉0.8g/L。全文摘要本發(fā)明公開了一種球擬酵母菌及采用該菌種發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的方法。本發(fā)明的球擬酵母菌，為天冬氨酸和丙氨酸缺陷型丙酮酸高產(chǎn)菌，能夠減少丙酮酸的代謝，增加了糖酸轉(zhuǎn)化率。另外，該酵母菌中不僅存在丙酮酸到丙氨酸的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，還存在天冬氨酸到丙氨酸的脫羧反應(yīng)，采用所述菌種發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸，和現(xiàn)有技術(shù)比較在相同的生產(chǎn)周期內(nèi)產(chǎn)酸率可提高38％，轉(zhuǎn)化率提高2-3個(gè)百分點(diǎn)，具有較大的工業(yè)化生產(chǎn)的前景。文檔編號(hào)C12R1/88GK101440351SQ20081020114公開日2009年5月27日申請(qǐng)日期2008年10月14日優(yōu)先權(quán)日2008年10月14日發(fā)明者關(guān)惠琴,孫炳耀,健章申請(qǐng)人:上海新立工業(yè)微生物科技有限公司