專利名稱：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑混合物的保存方法
環(huán)介導(dǎo)離擴(kuò)增鵬淑嗨溯的保存旅
駄領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種生化i敘跑^t/的保存方法，確切地說j^^生物學(xué)中環(huán)介導(dǎo)^r增^z體系除
待測(cè)樣品核酸(DNA或RNA)以外各禾M啲混溯的保存方;S~~^環(huán)介導(dǎo)#^擴(kuò)增&^淑嗨^/
的保存施。
背景獄
環(huán)介導(dǎo)#^擴(kuò)增(looproediatedisotheimalamplificatioi^LAMP) ife^:是2000年由Notomi等發(fā)明的 一種^f 的^r增獄。該S^針對(duì)目的基因的6個(gè)區(qū)段，設(shè)計(jì)4斜寺異引物并利用一種具有驢換 活性的DNA聚識(shí)在65'C左右X射亥^ffif^^擴(kuò)增。由于LAMPg^:具有特異性高、衝鎖單、無
需S^儀器設(shè)^tt:點(diǎn)，所以ft^幾年，該技術(shù)己開始廣a^于生物致病病原的檢測(cè)，病毒醜原如
人^ ￡急性 ^征病毒、艾滋病病毒、埃博鵬毒、 ^薪口^ 彌毒、H5N1型禽鵬 病毒、豬繁殖與呼(i^^征病毒、Df^^毒等，細(xì)嗇醜原如SI^^^彎曲菌、4據(jù)沙門氏菌、金黃 色^W^^菌、沙門氏菌、霍亂弧菌等。但在實(shí)際鵬中，LAMPHl^f需的^^蹄酸弓鵬、三磷酸 脫Wf酸(dNlP)、鵬1沖液和DNA聚^^均敲-2(TC以下f釅餅下ie存，并服復(fù)凍齢 使S^g份^lt同時(shí)，對(duì)于力鵬妒的商品化檢測(cè)淑嗆，為了保證銜則過程的簡(jiǎn)便I4S檢測(cè)結(jié)果 的可靠性、糊性和穩(wěn)定性，也要棘可會(huì)配各種反應(yīng)i敘U—次性添加和條，荊吏試齊嗆 !存和運(yùn) 輸過程中^^盡可能長(zhǎng)的《頗期限。所以，發(fā)明一種方iSW^保存LAMP^Z試劑混糊的方法具額 要的價(jià)值。目前，尚沒有關(guān)于LAMPa^f需i敘蜮混^t常^^溫長(zhǎng)S!W^保存附K3i^鍋U。 目前，市場(chǎng)上出售的LAMP i敘搶通常是將LAMP a^f需的微盼別條，然后{ ￡存和運(yùn)輸(4 。C敏鵬，-2(TC長(zhǎng)期保存)，艦時(shí)再將LAMP鵬的各種鄉(xiāng)分別混合；其保糊頓求緣并 且艦鵬作步驟熟貞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的^i共一種可以使LAMP反應(yīng)i敘U的混^tl^S^溫^^溫長(zhǎng)期保存的方^~~if介
導(dǎo)纖廣增鵬綱昆溯的保存施。
若超接將LAMP鵬縱!J (通常情況下含LAMP引物、dNTP、甜 、 Tris-HCl、 KC1、 MgCl2 或MgS04或兩者的混^J、 (NHt)2S04、 Triton X-100或牛血清白蛋白、DNA聚彌，當(dāng)擴(kuò)增目的核酸 為RNA時(shí)^S^淑l胚含有反^W (^ )，有時(shí)該aS微腿含有尿嘧啶DNA糖SW)的 混，，在常^^ft^斜牛下進(jìn)行真空千M^K干除去水分可得粉狀混^1， ^^混^tl中加A7jC分 使其術(shù)只復(fù)原，細(xì)復(fù)原后的LAMP^Z淑嗨^tl對(duì)目的禾^4行擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增的效割瞎低，甚至 對(duì)目的核酸沒有擴(kuò)增倉幼。
本發(fā)明Jiffi3iftLAMP的^gi3ZWHJ中添加糖類、 、 S^^昆^l^f乍為干燥fW"劑，然后對(duì) 混^ 行千 3*實(shí)現(xiàn)的。
為了使LAMPS^淑鵬^t^千M^似親HiS活性，膨頁向其中力口入千燥 劑，如糖類、醇 類、S^KM合物；在LAMP ^a微嗨合物中添加0.01°/^30% (W/V，即SM體積比)的J^&干 激，劑，然后對(duì)其進(jìn)行真空千皿^MK干，除去其中，^:部分水分可以得至嫩>^ ^皿的混合物。為了防止千M^敦才LAMP^S^微嗨合物的活性、戰(zhàn)^f其中DNA聚，U反緑酶的 活l4it^員傷，需要在8(TC以下進(jìn)行千燥，并且千rai程中agM^ 。 LAMPa^微幌^t/的干 燥禾i^f其保存時(shí)間撤明顯的影響，千燥后混^t/的念K競(jìng)高不1^31 20% (質(zhì)量^R比)，通常 情況下，千臃混^l的^7K量在低于6。/。時(shí)有利于混^t/的長(zhǎng)期保存，fi3i低的^7K量(<0.1%時(shí))也 會(huì)破壞LAMP^giSi敘鵬^tl的活性，所以不能使LAMP^g^微腿^tfil^千燥(^7尺量<0.1%)。 4頓i^書驗(yàn)的混^tSa行LAMP鵬時(shí)，只需向混溯中力口入無0^餾水至一定^^只，充分混勻使 各成分溶解fiJf、，然后加入^S^的待檢測(cè)樣品核酸(DNA或RNA)就可以進(jìn)行LAMP鵬。4^便
利的ie^f牛下(如常^^a^M低盼鵬斜牛下)和一定的c存期內(nèi)，用j^千燥后的混^a行
LAMP Si^f得的結(jié)果與用,羊配制的aM昆^I所得到的結(jié)果完全相同。
戰(zhàn)LAMP ^SiS淑啲混^/至d^^含以下組份LAMP弓物、dNTP和DNA聚^H。通常情況 下，LAMP SJ^試劑的混糊由以下組傷^賊LAMP弓物、dNTP、甜麵、Tris^HCl、 KC1、 MgCl2 或MgSQt或兩者盼混，、(NH4)zS04、 Triton X-100或牛血清白蛋白和DNA聚合酶。當(dāng)目,酸為RNA 時(shí)，LAMP SiS微[J的混激也可由以下組傷^賊LAMP引物、dNTP、甜魏、Tris-HCl、 KC1、 MgQ2 或MgS04或兩者的混^j、 (NH4)zS04、 Triton X-100或牛血清白蛋白、DNA聚^Hf口反^H。有時(shí) 為了消除可會(huì)^的核酸污染的干擾，，LAMP am敘啲混，中還含有尿嘧啶糖SiW (UNG 酶)。
戰(zhàn)的千燥傲戶劑為糖類、麟、 ^混溯，包括但不限于庶糖、海藻糖、？l^、 wn、
麥芽糖、殼聚糖、葡聚糖、彩隹酮、聚乙二醇、羥乙a^粉類、乙烯乙二醇、甘露酹卩鄉(xiāng)油。鵬目
的核酸的不同，LAMP^Z淑ij混含吻中dNTP為dATP、 dTIP 、 dGTP、 dCTP和dUTP中的至少四種 的混^4勿。LAMP ^gim式劑混^tl中DNA聚，為同時(shí)具有5'—3'聚^^活性和^f々活性的DNA 聚"^H，包括但不限于:處腦A聚娜、phi29 DNA聚鄉(xiāng)、9°Nm DNA聚彌、DNA聚娜I (Klenow 大片段)、Klenow Fragment (3'—5' exo)、 Venfe DNA聚合酶、Venfe (exo) DNA聚合酶、Deep VentR DNA聚^H、 Deep VentR (exo-)DNA聚^||^口(|)29 DNA聚^fll。
^*說，LAMP HJ^淑收t3 LAMP引物、dNTP、甜魏(Belaine)、 Tris-HCl、 KC1、 MgCk或 MgS04或兩者的混合吻、(NH4)2S04、 TritonX-100 (曲拉通X-IOO)或BSA (牛血清白蛋白)和DNA 聚合麟需要在-20。C^m條aTF才能長(zhǎng)期保存(2個(gè)月以上)，在常溫割牛下它們均不能長(zhǎng)期fc存，
ss很分號(hào)Ji限制了LAMP相關(guān)i敘ij盒的^i^ir細(xì)。^s果表明，細(xì)本發(fā)明的方法^a^
的LAMP鵬翻的混溯可以在常溫體溫斜牛下存放6個(gè)月不會(huì)娃正常鵬活性，械働鵬 斜牛下(如l(TC或以下)存放12個(gè)月仍具有正常的^S活性。并且在j頓這祌添加千燥做齊i斤鵬
的混^t行LAMP^ism^過程中，無簡(jiǎn)^a劍牛，在室溫下操作即w^得a^想結(jié)果。
所以，本發(fā)明具有千鵬混^lt活性在徽顯割牛下穩(wěn)定持久、^*低、操l鎖單m^。 LAMP反
應(yīng)淑啲混^i，本發(fā)明的方 st行千Mba后，可在常溫斜牛下存放6個(gè)月以上 影響混合吻的
SiS性能；SM氐盼2^T (如I(TC或以下)貝何以存放12個(gè)月以上而不會(huì)失去活性。本發(fā)明將LAMP
鵬的各種淑u附昆^a行千mb理，然后即可常st存和運(yùn)輸，^頓時(shí)只需加A)5i蒸水即可。本發(fā)
明在戲斷氐LAMP^g^微啲lHi^:的同時(shí)，還為L(zhǎng)AMP鵬的實(shí)際操作帶來極大的働U， S# 輔力艦LAMP技術(shù)的在醫(yī)療、檢驗(yàn)和驗(yàn)織域的翻和LAMP診斷微l!繊OM^ir鵬。
4以下iffil^M例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)"^i兌明。 ^ffi例1. LAMP反應(yīng)試劑混^T添加不同濃度和不同種類千燥微劑后的真空千Mra
將除被測(cè)樣品核酸以外的各種LAMP ^Z淑啲混^t/3744 nL (包括LAMP弓物F1P和BIP各 1.6pM，引物F3和B3各0.2tiM， dAIP、 dTTP 、 dGTP和dCTP各1.4mM， MgQ26mM，甜菜堿1M， Tris-HC120mM， KC110mM， ！^042我 410mM， TritonX-l,.l%，版DNA聚彌1248 U， AMV反録酶19.5 U)魏管144ML雜于26個(gè)1.5mL的離心管中，按表l第l列(共26行) 戶標(biāo)的濃度和種類向針1.5mL的離心管中力口入千劇默劑，混勻，翔^M.5mL離心管中的混彌 按24^L的量條于6個(gè)0.2mL的離心管中，然窟^"混合物的0.2ml的離心管置刊Ka真空凍干機(jī) (HetoDiywirine，艘)中，控第ffi^在l(TC以下，真空千燥2小時(shí)，離心管中的混^^失去水分， 變?yōu)槟頚量為5%左右呈鵬做的千燥的LAMP鵬湖混像 鄉(xiāng)例2.LAMP鵬微幌激添加不同鵬和不同種類千燥嫩劑后的K5IM干鵬
將除被測(cè)樣品核酸以外的各種LAMP ^^敘啲混^t/3744 pL (包括LAMP引物FIP和BIP各 1.6mM，引物F3和B3各(X2hM， dAIP、 dTTP 、 dGTP和dCTP各1.4mM， MgCl26mM，甜，1M， Tris^HCl 20函，KC110 mM， MgS04 2 mH (NH^SCU 10 mM， BSA 100ng/mL， ^S對(duì)DNA聚^fl 1248 U， AMV反，酶19.5 U)按每管144pL ^^于26個(gè)1.5mL的離心管中，按表2第1列(共26行)g 的mg和種類向針1.5mL的離心管中力口入千激,劑，混勻，翔每針1.5mL離心管中的混^t^24ML 的量條于6個(gè)0.2mL的離心管中，然窟^W混^tl的0.2ml的離心管置于常^M干機(jī)(富瑞德，中 國)中，控葡^￡25'。以下，吹干3小時(shí)，離心管中的混^^好7K分，妙^7jC量為5。/。左右呈 鵬做的千燥的LAMP鵬試劑混像
^S例3 .LAMP^m敘U混^T添加Mft以上千燥f，劑后的真空千Mfca
將除被測(cè)樣品核酸以外的各種LAMP ^SiS縱啲混激1440 mL (包括LAMP引物FIP和BIP各 1.6 mM，引物F3和B3各0,2tM， dAIP、 dTIP 、 dGTP和dCIP各1.4mM，甜，1M， Tris-HC120 mM， KC110mM， MgS048mH(NH^SOj 10mM， TritonX-1000.1%，版DNA聚儒480U， AMV 反録酶7.51;)按每管144ML雜于10個(gè)1.5mL的離心管中，按表3第1列(共10行)戶麻盼鵬 和種類向針1.51^的離心管中力口入千燥做劑，混勻，賴^H.5mL離心管中的混^t/S24ML的 量，于6個(gè)0.2mL的離心管中，然后4^W混，的0.2ml的離心管置于fft^真空凍干機(jī)(Heto Diywinne，艘)中，控諱^S在1(TC以下，真空千燥2小時(shí)，離心管中盼混^^失去水分， 含 水量為5%左右呈鵬微的千燥的LAMP鵬i敘鵬像 魏例4. LAMP鵬綱昆激的保存和復(fù)原
將i^f千燥的LAMP Si^淑腿激的離心管分別于4'C和常溫(2(K35°C)兩爭(zhēng)鵬剝牛下 jC存，M:^滿6個(gè)月、12個(gè)月和18個(gè)月時(shí)分別取兩t^S斜牛下保存的LAMP^Sm敘鵬^t 斗m^，戰(zhàn)3個(gè)時(shí)間段，齡時(shí)間駄SH—批，^ftk包含124個(gè)02mL的^t千燥L(fēng)AMPS^縱y 混溯的離心管( 1、 2和3)，向針離心管中力口入24ML無RNA酶的雙蒸水，充分混勻使各成分 溶解，可得到魏的LAMP鵬縱嗨恤
5^SI例5.ft^的LAMP ^m淑幌^/的活性檢測(cè)
1)依據(jù)^M例4中3個(gè)C存時(shí)間段，共需進(jìn)行3次Si!的LAMP ^Zi敘嗨激的活性檢測(cè)，每 ^^測(cè)的時(shí)候雷將X^下桃!滿毒(Taura syndrome virus, TSV)的核酸(10ng/|jL) 124-等量^^于124 ^t復(fù)原的LAMP^g^淑嗨合物的0.2mL的離心管中，混勻。
2 )將i^&離心管于63 保溫60 min進(jìn)行LAMP反應(yīng)，然后于90 ^保溫5 min終ihS應(yīng)。
LAMPMi^冬ih^，在旨離心管中力口入2 pL 10倍,的核m^料GeneFinder，如果離心管中 鵬^MJ艱絶，貝鵬明該離心管中的LAMPMiSi敘啲混^t;具有正常的鵬活性；如果離心管中反 應(yīng)^M王I^黃色，貝IJ說明該離心管中的LAMP鵬淑啲混激已失去正常的S^活性。
對(duì)±^添加不同濃度、不同種類微齊訴t]細(xì)不同千燥方法艦的LAMP Sm敘嗨溯的檢測(cè)結(jié) 果(見表l、 2和3)表明保存時(shí)間為6個(gè)月時(shí)，在常溫(20~35°C)和4'C^f牛下je存的混^^具 有正常的R/S活性；保存時(shí)間為12個(gè)月時(shí)，在4'C斜牛下lt存的混^l^具有正常的M^活性。
^!例1中細(xì)的LAMP弓胸FIP、 BIP、 F3和B3為)(^下桃!彌毒(TSV)的艦引物(引物序列 參見Kia1pathomchai W， Jareonram W, Jitrapakdee S, Flegel TW. R^)id and sensitive detection of Taura syndrome virus by reverse transcription loophmediated isothermal amplificationJ Virol Methods. 2007;146(1-2):125-12& )， 由上海虹生物Xf呈技術(shù)服務(wù)有限公司合成。本發(fā)明中所用的i敘訴附料甜麵(Betaine)、蔗糖、海 藻糖、乳糖、 ^糖、麥芽糖、^!糖、葡聚糖、彩隹酮、聚乙二醇、羥Z^淀粉類、乙烯乙二醇、甘 露醇、甘油等均購自Sigma公司，Tris-HCl、 KC1、 MgS04、 MgQ2、 (NH^SO: Triton X-100和牛血清 白蛋白(BSA)購自上^I生物Xg^術(shù)服儲(chǔ)限公司，各種DNA聚^H^購自NEB公司，AMV 反^H購自Promega公司，核^l4GeneFinder^購自廈門百維信生t^4^限公司。表l.真空千鵬不同鵬、不同禾>^干底微齊樹1^ (5^微股^1的^^錁
微劑\4°C4。C4°C箭顯繩
6個(gè)月12個(gè)月18個(gè)月6個(gè)月12個(gè)月18個(gè)月
5%賺++++++
10%賺++++++
50腐繊++++++
10°腐繊++++++
5°/鵬++++++
贈(zèng)應(yīng)十+++++
++++++
++++++
5%鼓糖++++++
++++++
++++++
++++++
畫++++++
10%葡繊++++
5,鋼+++++-
10°/邀鋼+++++-
++++--
++++--
++-+一-
++-+--
++++--
++++--
5%甘離+++++-
10%甘,+++++
5%糊++++++
10%糊++++++
注1.表1的第1歹呩LAMP MiS淑嗨溯中千M^臓加的禾^^和鵬。
2.表1中"+" LAMP ^a凝lJM^t^貼B^曾活性，"-"標(biāo)LAMP ^^微嗨^|#沒有擴(kuò)增活性。
7表2. WIR干后不同鵬、不雨"1^干M^樹LAMPMiS淑鵬^t)的微^蝶
4。C4。C4。C常溫常溫常溫
6個(gè)月12個(gè)月18個(gè)月6個(gè)月12個(gè)月18個(gè)月
微劑\
5%賺++++++
10%鵷++++++
50腐藻糖++++++
10°腐繊++++++
50/疆++++++
10% 藤++++++
++++++
++++++
++++++
10%鼓糖++++++
++++++
10%^ ++++++
++++++
10%葡賺++++++
50/潔鋼++++--
10°/潔鋼++++--
++++—-
++++--
5條M定粉類++-+--
贈(zèng)5Z^淀粉類++-+--
++++--
腦乙烯Z^z:醇++++一-
5%甘離++++--
10%甘,++++--
5%糊+++++
10%糊+++++-
注1.表2麟1列示LAMP ^a凝腿溯中千TO^膝加的禾"f^和鵬。
2.表2中"+" ^^LAMP SiM^鵬^t)W郞子擴(kuò)增活性，標(biāo)LAMP Mj^i翁嗨^tT沒有擴(kuò)增活性。表3.真空干鵬照中社千燥W^樹LAMP鵬縱嗨激的微郷 保糊牛
、活@
鵬U 5%賺 50/燕鎌
贈(zèng)賺 5%賺
50/0甘離 50/燕纖
50/掘 50腐繊
5繊鲴
5條Z^定粉類 5%蔗糖
5% | 5繊鋼 5條纖
4°C 6個(gè)月
+ + +
+
+
+
+
+
+
+
4。C 12個(gè)月
+ + +
+
+
+
+
+
4。C 18個(gè)月
+ + +
+
+
+
+
徵顯 6個(gè)月
+ +
+
+
+
+
+
常溫 12個(gè)月
+
+
+
+
+
+
+
+
18個(gè)月
+
+
+
+
+
+
+
+
注1.表3的第1歹際LAMP ^Z織嗨溯中干燥Wfi働啲^^^S。
2,表3中"+" ^^LAMP^^嗨^^^jr增活性，"陽"標(biāo)LAMPS^a翁l服^T沒有擴(kuò)潛活性。
9
權(quán)利要求
1.一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑混合物的保存方法，其特征在于在各種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑混合物中加入干燥保護(hù)劑進(jìn)行混合，其中干燥保護(hù)劑的重量體積比濃度范圍為0.01％～30％，然后將其在低于80℃的溫度下進(jìn)行真空干燥或快速風(fēng)干，使其含水量低于20％即可。
2. 如權(quán)利要求1中所述的保存方法，其特征在于所述的各種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反 應(yīng)試劑混合物至少包含以下組份環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)引物、dNTP和DNA聚合酶。
3. 如權(quán)利要求1中所述的保存方法，其特征在于所述的各種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反 應(yīng)試劑混合物通常由以下組份組成環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)引物、dNTP、甜菜堿、 Tris-HCl、 KC1、 MgCl2或MgS04或兩者的混合物、(NH4)2S04、 Triton X-l00或牛血清 白蛋白和DNA聚合酶。
4. 如權(quán)利要求1中所述的保存方法，其特征在于所述的各種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反 應(yīng)試劑混合物也可由以下組份組成環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)引物、dNTP、甜菜堿、 Tris-HCl、 KCl、 MgCl2或MgS04或兩者的混合物、(NH4)2S04、 Triton X-l00或牛血清 白蛋白、DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶。
5. 如權(quán)利要求1中所述的保存方法，其特征在于所述的干燥保護(hù)劑為糖類、醇 類、酮類或其混合物，包括但不限于蔗糖、海藻糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、殼聚糖、 葡聚糖、聚維酮、聚乙二醇、羥乙基淀粉類、乙烯乙二醇、甘露醇或甘油。
6. 如權(quán)利要求2、 3和4中所述的保存方法，其特征在于所述的dNTP為dATP、 dTTP 、 dGTP、 dCTP和dUTP中的至少四種的混合物。
7. 如權(quán)利要求2、 3和4中所述的保存方法，其特征在于其中所述的DNA聚合 酶為同時(shí)具有5'—3'聚合酶活性和鏈替代活性的DNA聚合酶，包括但不限于 DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶、9°Nm DNA聚合酶、DNA聚合酶I (Klenow大片 段)、Klenow Fragment (3'—5' exo-)、 VentR DNA聚合酶、VentR (exo-) DNA聚合酶、 Deep VentR DNA聚合酶、Deep VentRTM (exo-)DNA聚合酶和(()29 DNA聚合酶。
全文摘要
本發(fā)明公開一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑混合物的保存方法。該方法通過在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑混合物中加入特定的干燥保護(hù)劑，然后將添加了干燥保護(hù)劑的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑混合物在低于80℃的條件下進(jìn)行真空干燥或快速風(fēng)干，實(shí)現(xiàn)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑混合物在常溫或室溫條件下的長(zhǎng)期保存。本發(fā)明具有成本低、操作簡(jiǎn)單、干燥后環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑混合物活性在常溫條件下穩(wěn)定持久等優(yōu)點(diǎn)，將有力促進(jìn)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在醫(yī)療、檢驗(yàn)及檢疫等領(lǐng)域的運(yùn)用和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒的推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101591703SQ20081015941
公開日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2008年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月22日
發(fā)明者史成銀, 張慶利, 冰 楊, 艷 梁, 強(qiáng) 高, 倢 黃 申請(qǐng)人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所