專利名稱：：高耐性釀酒酵母工程菌及其構(gòu)建方法高耐性釀酒酵母工程菌及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及工業(yè)微生物育種的方法，尤其是一種耐高溫和耐高酒精濃度的釀酒酵母工程菌及其制備方法。
背景技術(shù)：
：酒精濃醪發(fā)酵可提高設(shè)備利用率、降低蒸餾能耗和生產(chǎn)成本。然而高濃度酒精對酵母菌的生長、發(fā)酵和存活都具有毒害作用，因此發(fā)酵終點的酒精濃度與酵母菌本身的耐酒精性能有關(guān)。普通釀酒酵母的酒精發(fā)酵濃度為12%(V)左右，如能將酒精發(fā)酵的濃度提高至16%(V)，則可節(jié)省蒸餾能耗25%左右。此外，普通釀酒酵母發(fā)酵的最適溫度為32X:左右，當(dāng)溫度超過35'C時，酵母菌的生長和發(fā)酵能力大大減弱。如果能提高酵母對溫度的耐受性，則可適當(dāng)提高發(fā)酵溫度，加快發(fā)酵速度，減少酒精發(fā)酵過程中冷卻水的消耗量。綜上所述，在酒精發(fā)酵時，有必要選用耐高溫和耐高酒精濃度的酵母菌。許多研究都表明，海藻糖不僅是釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的一種重要貯藏性碳源，而且可以作為酵母細(xì)胞的活性保護(hù)物質(zhì)。在一些極端環(huán)境(冷凍、干燥、熱處理等)下，酵母細(xì)胞可以通過調(diào)節(jié)海藻糖的合成來抵御外界的不良傷害，所以海藻糖含量被認(rèn)為是酵母耐性的重要鑒定指標(biāo)。但當(dāng)環(huán)境條件恢復(fù)的情況下，胞內(nèi)海藻糖又會迅速分解。所以如何降低胞內(nèi)海藻糖的消耗速率是提高酵母耐性的有效途徑。海藻糖的分解由兩類海藻糖酶(Trehalase)調(diào)控，中性海藻糖酶(NTH，由WW和w/W基因編碼)和酸性海藻糖酶(ATH，由a/W基因編碼)?，F(xiàn)在的研究表明中性海藻糖酶基因"&7在酵母胞內(nèi)海藻糖的積累上起著關(guān)鍵作用。近年來雖然通過改善工藝條件及選用先進(jìn)設(shè)備等可以在一定程度上提高酒精濃度，減少能源消耗，但是要從根本上解決酵母的耐性問題還是需要利用分子生物學(xué)育種技術(shù)構(gòu)建耐高溫和耐用消費(fèi)品高酒精濃度的釀酒酵母工業(yè)菌株。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是解決釀酒酵母菌株自身耐性不足的問題，提供一株具有耐高溫和耐高酒精濃度的高耐性釀酒酵母工程菌及其構(gòu)建方法。本發(fā)明采用基因工程育種技術(shù)選育獲得的耐高溫耐酒精的釀酒酵母菌株，可以更好地適合酒精濃醪發(fā)酵的要求，能夠為酒精發(fā)酵工業(yè)帶來顯著的經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明所提供的釀酒酵母工程菌，是將釀酒酵母中的中性海藻糖酶基因敲除，得到高海藻糖含量的釀酒酵母工程菌株，保藏號為CGMCCNo2666，命名為釀酒酵母Sflcc/zara附少ceyAY-18<=本發(fā)明所述的高耐性釀酒酵母工程菌的構(gòu)建方法，是通過構(gòu)建的同源重組質(zhì)粒，采用同源重組的方式敲除釀酒酵母中編碼中性海藻糖酶基因ATW/，降低酵母細(xì)胞內(nèi)生物活性保護(hù)物質(zhì)海藻糖的分解，獲得耐高溫耐酒精的釀酒酵母工程菌株。所述中性海藻糖酶OV77f/)的氨基酸序列的GenBank號為CAA88061。所述釀酒酵母(受體菌)可為釀酒酵母(&cc/wra/WK"cewv/w'ae)AS2.14(中國微生物菌種保藏管理委員會，公眾可以通過該保藏管理委員會獲得出發(fā)菌株AS2.14)。本發(fā)明方法所述的中性海藻糖酶的編碼基因AT///是通過構(gòu)建的重組質(zhì)粒pUC-NK進(jìn)行敲除的；所述重組質(zhì)粒pUC-NK的物理圖譜如圖4所示。該構(gòu)建方法的具體操作過程如下第一、編碼酵母中性海藻糖酶iV77/7基因的獲得根據(jù)已報道酵母中性海藻糖酶AA77/7的基因序列，設(shè)計上下游引物，進(jìn)行AT/Z/基因的PCR擴(kuò)增，引物序列為上游引物Pl:5'-CGTCAGCTTAGCGCTAGGC-3'下游弓l物P2:5'-CAATGCCTACCATCCGATCGC-3'以酵母總DNA為模板，以Pl和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR條件Pl、P2各10mmol/L及1/10體積的10xPCR緩沖溶液，0.2mmol/L的dNTP和2U的TaqDNA聚合酶，以20pL系進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增條件先95'C變性5min，然后95'C變性40s，58°C退火60s，72°C延伸2min，共25個循環(huán)；最后72°C延伸8min使產(chǎn)物延伸完全；PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，可看到一條約2.2kb的特異性條帶，其大小與預(yù)期相當(dāng)，即為編碼酵母中性海藻糖酶iVLW基因；第二、重組載體pUC-NK質(zhì)粒的構(gòu)建將上步純化后的PCR產(chǎn)物，經(jīng)五coRI-AWel雙酶切后，插入載體pUC19的五coRI和iWd酶切位點之間，構(gòu)成pUC-N質(zhì)粒；用歷wdIII-SacI從pUG6中酶切/ox;-Kfl"、/ox;片段，插入質(zhì)粒pUC-N的///wdlll和Sad酶切位點之間，構(gòu)成pUC-NK質(zhì)粒；第三、釀酒酵母工程菌的獲得1)釀酒酵母AS2.14中M7/7的敲除將第二步構(gòu)建的質(zhì)粒pUC-NK通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入酵母AS2.14中，通過質(zhì)粒上的iV77W與酵母中的染色體上的同源序列發(fā)生重組，從而整合到酵母染色體上隨染色體一起復(fù)制；重組后一方面將Kanr基因引入酵母的染色體，使重組菌株產(chǎn)生G418抗性；另一方面，質(zhì)粒的插入打斷了酵母染色體上的iV77^基因，產(chǎn)生由兩個不完整的NTH1基因構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)序列，從而實現(xiàn)iV77/7基因的敲除；2)kanr基因的去除將重組質(zhì)粒pSH47電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的釀酒酵母單倍體細(xì)胞，涂布含有200mg/LG418的YEPD平板篩選轉(zhuǎn)化子，將所得到的轉(zhuǎn)化子挑到無菌水中饑餓培養(yǎng)3h后，重新驗證轉(zhuǎn)化子的Kanr抗性表型；挑選在G418平板上生長較好的轉(zhuǎn)化子，接種含有半乳糖的液體YEPD培養(yǎng)基，3(TC誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時，取適量培養(yǎng)液涂在YEPD平板上30"C培養(yǎng)2天，將得到的單菌落影印到含有200mg/L的G418的YEPD平板上，篩選Kan抗性標(biāo)記丟失的菌株，即為高耐性釀酒酵母工程菌，分類命名是釀酒酵母(Sacc^romycMce/rv/w'ae)AY-18，保藏號為CGMCCNo2666。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果本發(fā)明利用改進(jìn)的Cre/loxP系統(tǒng)敲除了釀酒酵母AS2.14的M7//基因，獲得了釀酒酵母中性海藻糖酶(;V77//)突變株AY-18(CGMCCNo2666)。本法具有操作簡單、方便易行的特點。本發(fā)明所獲得的釀酒酵母工程菌&cc/KWwn_ycMcerevis/aeAY-18(保藏號CGMCCNo2666)與普通的釀酒酵母菌(受體菌)相比，胞內(nèi)海藻糖含量高，具有良好高溫耐性和酒精耐性，在52'C高溫下處理60min細(xì)胞存活率為85.15%,經(jīng)20%(V)酒精沖擊4h細(xì)胞存活率為95.12%，發(fā)酵酒精濃度達(dá)18.2%(V)，適合于淀粉質(zhì)原料的酒精濃醪發(fā)酵，能夠為酒精發(fā)酵工業(yè)帶來顯著的經(jīng)濟(jì)效益。工程菌對發(fā)酵設(shè)備及條件沒有特殊要求，一般酒精廠的設(shè)備和條件均可使用。附圉說明圖1為MH/的PCR產(chǎn)物電泳圖2為pUC19質(zhì)粒的物理圖譜；圖3為pUG6質(zhì)粒的物理圖譜；圖4為質(zhì)粒pUC-NK的構(gòu)建過程與圖譜圖5為質(zhì)粒pUC-NK的酶切驗證；圖6為M7//的重組過程，；圖7為pSH47質(zhì)粒的物理圖譜；圖8為Southernblot分析AwW突變株。本發(fā)明提供的耐高溫耐酒精釀酒酵母菌株(Sacc/wnwi_yc^cerev/w'從)，已于2008年9月12日保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號為CGMCCNo2666,建議分類命名為釀酒酵母Sacc^aro加ycescew's/ae。具體實施方式下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。實施例1、中性海藻糖酶缺失的釀酒酵母工程菌的獲得1、中性海藻糖酶缺失的釀酒酵母工程菌的構(gòu)建(1)編碼酵母中性海藻糖酶iV77f7基因的獲得根據(jù)已報道面包酵母中性海藻糖酶的基因序列(GenBank號為CAA88061),設(shè)計上下游引物，進(jìn)行iV77/7基因的PCR擴(kuò)增。引物序列為上游引物Pl:5'-CGTCAGCTTAGCGCTAGGC-3'下游引物P2:5'-CAATGCCTACCATCCGATCGC-3'以酵母總DNA為模板，以Pl和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件Pl、P2各10mmol/L及1/10體積的10xPCR緩沖溶液，0.2mmol/L的dNTP和2U的TaqDNA聚合酶，以20pL系進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件先95。C變性5min，然后95。C變性40s，58。C退火60s，72°C延伸2min，共25個循環(huán)；最后72°C延伸8min使產(chǎn)物延伸完全。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，可看到一條約2.2kb的特異性條帶，其大小與預(yù)期相當(dāng)(圖1)，其中圖1中泳道M為Marker，泳道1為的PCR產(chǎn)物。(2)重組載體的構(gòu)建與酶切驗證將純化后的PCR產(chǎn)物，經(jīng)￡coRI-A^d雙酶切后，插入載體pUC19(圖2)的￡coRI和MM酶切位點之間，構(gòu)成pUC-N質(zhì)粒。用/f/wdlII-5"fld從pUG6中酶切/0;^-/:";"-/0乂/7片段，插入質(zhì)粒pUC-N的//i"din和&d酶切位點之間，構(gòu)成pUC-NK質(zhì)粒(圖4)。質(zhì)粒pUC-NK經(jīng)五coRI-AWd酶切釋放出1400bp和5200bp的特異性條帶，其大小與預(yù)期相當(dāng)(圖5)，其中圖5中泳道M為Marker，泳道1為質(zhì)粒pUC-NK，泳道2為經(jīng)五coRI-AWel雙酶切后的pUC-NK質(zhì)粒。(3)釀酒酵母工程菌的獲得1)釀酒酵母AS2.147V77W的敲除將質(zhì)粒pUC-NK通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入酵母中，通過質(zhì)粒上的iV77//與酵母中的染色體上的同源序列發(fā)生重組，從而整合到酵母染色體上隨染色體一起復(fù)制(圖6)。重組后一方面將Kanr基因引入酵母的染色體，使重組菌株產(chǎn)生G418抗性；另一方面，質(zhì)粒的插入打斷了酵母染色體上的iV77//基因，產(chǎn)生由兩個不完整的NTH1基因構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)序列，從而實現(xiàn)M7/7基因的敲除。2)kanf基因的去除將重組質(zhì)粒pSH47(圖7)電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的釀酒酵母單倍體細(xì)胞，涂布含有200mg/LG418的YEPD平板篩選轉(zhuǎn)化子，將所得到的轉(zhuǎn)化子挑到無菌水中饑餓培養(yǎng)3h后，重新驗證轉(zhuǎn)化子的Kai^抗性表型。挑選在G418平板上生長較好的轉(zhuǎn)化子，接種含有半乳糖的液體YEPD培養(yǎng)基，3(TC誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時，取適量培養(yǎng)液涂在YEPD平板上30'C培養(yǎng)2天。將得到的單菌落影印到含有G418(200mg/L)的YEPD平板上，篩選Kan抗性標(biāo)記丟失的菌株。2、中性海藻糖酶缺失的釀酒酵母工程菌的驗證(1)工程菌的穩(wěn)定性檢測將釀酒酵母在YEPD培養(yǎng)基中連續(xù)傳代20代，提取酵母染色體DNA，以其為模板用PCR方法進(jìn)行驗證，結(jié)果表明，已成功實現(xiàn)iV77/7基因的敲除，未發(fā)生丟失現(xiàn)象。(2)Kanr的檢測將釀酒酵母AY-18(CGMCCNo2666)和受體菌釀酒酵母分別接種在含有200mg/LG418的YEPD平板上，在30'C條件下培養(yǎng)3天后，結(jié)果表明，受體菌釀酒酵母AS2.14和釀酒酵母AY-18(CGMCCNo2666)在200mg/LG418的YEPD平板上均不能生長。(3)Southern雜交驗證以iV77Z7基因中經(jīng)酶切的1.2kb的片段為探針，與經(jīng)Pc/I酶解的酵解總DNA雜交，出現(xiàn)了4.02kb的雜交條帶，為酵母染色體上包含完整AT/f/基因的戶dl片段；與JWW突變株尸dl酶解的總DNA雜交出現(xiàn)2.0kb和4.35kb的2條雜交條帶，為酵母染色體上A77f/基因上游和下游的尸c/1位點與質(zhì)粒pUC-NK上Pc/I位點間DNA片段的長度(圖8)。實施例2、菌株耐性試驗1、胞內(nèi)海藻糖含量親本和突變株分別經(jīng)斜面活化后，首先分別接入30mLYEPD液體培養(yǎng)基中，30'C靜止培養(yǎng)24小時后，按10%的接種量接至50mLYEPD液體培養(yǎng)基中，3(TC搖床(150rpm)培養(yǎng)36小時后，離心收集菌體，用硫酸蒽酮法測定胞內(nèi)海藻糖含量。試驗結(jié)果見表l，從結(jié)果看,突變株的海藻糖含量為16.53%，與親本相比提高了98.9%。而且生物量沒有變化，說明海藻糖酶基因的缺失并沒有對酵母的生長產(chǎn)生影響。表l親本和突變株海藻糖含量的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、高溫耐性親本和突變株分別經(jīng)斜面活化后，首先分別接入30mLYEPD液體培養(yǎng)基中，3(TC靜止培養(yǎng)24小時后，按10%的接種量接至50mLYEPD液體培養(yǎng)基中，30'C搖床(150rpm)培養(yǎng)12小時后，離心，用冷水洗滌，然后將其懸浮在50mLYEPD液體中，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到OD6Q()=0.5h時，在52'C下處理60min后迅速在冰浴中冷卻，然后將其細(xì)胞懸浮液稀釋到l()S個/ml，涂平板測定細(xì)胞存活率(見表2)。由表2可知，經(jīng)高溫處理后親本的存活率為16.83%,而zlw/W的存活率可達(dá)85.15%。熱激會增加海藻糖合成酶海藻糖-6-磷酸合成酶(fj^)的表達(dá)量，增加海藻糖的含量。突變株由于敲除了海藻糖酶基因，可以阻止海藻糖的分解，使胞內(nèi)海藻糖積累量增加，從而提高了細(xì)胞的高溫耐性。表2J"A7突變株高溫(52°C，60min)存活率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3、酒精耐性親本和突變株分別經(jīng)斜面活化后，首先分別接入30mLYEPD液體培養(yǎng)基中，3(TC靜止培養(yǎng)24小時后，按10。/。的接種量轉(zhuǎn)接至YNB液體培養(yǎng)基中，30°C150r/min培養(yǎng)至穩(wěn)定期早期，取5mL菌液，離心，無菌水洗滌，轉(zhuǎn)移至含酒精20M的50mLYNB培養(yǎng)基中沖擊4h。然后將其細(xì)胞懸浮液稀釋到l()S個/ml，涂平板測定細(xì)胞存活率(見表3)。從結(jié)果看，經(jīng)20%(V)酒精沖擊4h后，突變株的存活率為95.12%，比親本提高了43.18%，說明突變株酒精耐性大大提高了。表3酒精沖擊(20%，<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例3、30L罐酒精濃發(fā)酵實驗1、糊化液化取玉米粉10.8kg，加70。C溫水19.0L調(diào)漿，加耐高溫a-淀粉酶(20000U/mL)5.6mL，CaC1213.6g，混勻后升溫至8590°C,糊化液化90min。2、糖化糊化醪冷卻到60。C，加糖化酶(105U/mL)13.0mL，糖化30min。3、接種發(fā)酵糖化醪冷卻至30'C，加尿素17.6g，磷酸氫二鉀8.0g，硫酸鎂4.0g，攪勻，接酵母種子液4.0L，補(bǔ)加無菌水至發(fā)酵液總體積約26.5L。4、溫度控制發(fā)酵前期(012h)32°C，主發(fā)酵期(1228h)36°C，后發(fā)酵期33°C，72h發(fā)酵結(jié)束。5、發(fā)酵結(jié)束后分測定殘?zhí)?、酒精濃度，并計算淀粉對乙醇得率，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，與親本相比，突變株的發(fā)酵酒精度提高了3.7度，淀粉出酒度提高了10.59個百分點；從殘?zhí)乔闆r看，突變株發(fā)酵液殘?zhí)菫?.48g/100mL，親本的殘?zhí)菫?.53g/100mL。這是因為親本菌株由于不能耐受較高的酒精度，發(fā)酵至60h后酵母細(xì)胞大量死亡，酒精發(fā)酵已基本停止，最終導(dǎo)致發(fā)酵不徹底。表430L罐酒精濃醪發(fā)酵試驗結(jié)果(五次試驗平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注計算淀粉對乙醇得率時，按投入的總淀粉計。權(quán)利要求1、一種高耐性釀酒酵母工程菌，是將釀酒酵母中的中性海藻糖酶NTH1基因敲除，得到不產(chǎn)生中性海藻糖酶且耐性比所述釀酒酵母高的菌株。2、如權(quán)利要求1所述的高耐性釀酒酵母工程菌，其特征在于所述釀酒酵母工程菌為釀酒酵母(Sacc/wro/^cescem^/ae)AY-18,保藏號為CGMCCNo2666。3、如權(quán)利要求1所述的高耐性釀酒酵母工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于該方法是通過構(gòu)建的同源重組質(zhì)粒，采用同源重組的方式敲除釀酒酵母中編碼中性海藻糖酶基因M7//,降低酵母細(xì)胞內(nèi)生物活性保護(hù)物質(zhì)海藻糖的分解，獲得耐高溫耐酒精的釀酒酵母工程菌株。4、如權(quán)利要求3所述的高耐性釀酒酵母工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于所述的中性海藻糖酶的編碼基因MH/是通過構(gòu)建的重組質(zhì)粒pUC-NK進(jìn)行敲除的。全文摘要本發(fā)明公開了一種高耐性釀酒酵母工程菌及其構(gòu)建方法。本發(fā)明所提供的釀酒酵母工程菌，是利用改進(jìn)的Cre/loxP系統(tǒng)將釀酒酵母中編碼中性海藻糖酶的基因敲除，得到生物活性保護(hù)物質(zhì)海藻糖含量提高的菌株SaccharomycescerevisiaeAY-18(保藏號CGMCCNo2666)。本法具有操作簡單、方便易行的特點。本發(fā)明所獲得的釀酒酵母工程菌胞內(nèi)海藻糖含量高，具有良好高溫耐性和酒精耐性，在52℃高溫下處理60min細(xì)胞存活率為85.15％，經(jīng)20％(V)酒精沖擊4h細(xì)胞存活率為95.12％，發(fā)酵酒精濃度達(dá)18.2％(V)，適合于淀粉質(zhì)原料的酒精濃醪發(fā)酵，能夠為酒精發(fā)酵工業(yè)帶來顯著的經(jīng)濟(jì)效益。工程菌對發(fā)酵設(shè)備及條件沒有特殊要求，一般酒精廠的設(shè)備和條件均可使用。文檔編號C12N1/19GK101440352SQ200810153108公開日2009年5月27日申請日期2008年11月17日優(yōu)先權(quán)日2008年11月17日發(fā)明者燁呂,肖冬光,欣郝,郭學(xué)武申請人:天津科技大學(xué)被以下專利引用(1),