專利名稱：：耐高溫木聚糖酶XynA2和編碼該酶的基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種木聚糖酶，特別涉及在嗜熱脫氮芽孢桿菌(Ceo6acW7"st力e^K^e"^ri/Yca/^)NG80-2中對木聚糖酶XynA2基因進行克隆表達、功能鑒定以及構(gòu)建大腸桿菌高效表達的耐高溫木聚糖酶和編碼該酶的基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著當今社會的飛速發(fā)展，人口增長和資源消耗使得可再生資源的開發(fā)與利用成為國際社會和學術(shù)界共同關(guān)注的問題。木聚糖是半纖維素的主要組成成份，廣泛分布于高等植物的細胞壁中，是自然界中一種巨大的可再生生物資源，也是最容易提取、降解和利用的一類半纖維素。木聚糖酶和0-木糖苷酶是降解木聚糖最主要的酶。在能源工業(yè)中，工農(nóng)業(yè)廢棄物中的木聚糖可被木聚糖酶和木糖苷酶轉(zhuǎn)化為木糖，而木糖又可被細菌及真菌轉(zhuǎn)化成酒精等有價值的燃料；在造紙工業(yè)的紙漿漂白中，e-木糖苷酶與木聚糖酶協(xié)同作用可以有效提高漂白性能；在醫(yī)藥行業(yè)中，木聚糖酶和木糖苷酶水解特定底物可產(chǎn)生在醫(yī)藥行業(yè)具有重要應(yīng)用價值的中間轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。因此對于木聚糖酶和木糖苷酶的研究具有廣泛而重要的用途。半纖維素是僅次于纖維素含量第二豐富的可利用自然資源，半纖維素中的木聚糖(xylan)根據(jù)來源不同，分枝程度不同，其主鏈和支鏈帶有多種不同的取代基團。由于木聚糖結(jié)構(gòu)的復雜性，它的完全降解需要多種水解酶的參與共同作用完成。其中的4-內(nèi)切木聚糖酶(EC.3.2.1.8)是木聚糖降解酶中最關(guān)鍵的酶。該酶以內(nèi)切方式作用于木聚糖主鏈內(nèi)部的e-1,4-木糖苷鍵，使木聚糖降解為短鏈的寡聚木聚糖，并有少量木糖生成；而e-D-木糖苷酶(e-xylosidase，EC.3.2.1.37.)則作用于短鏈的寡聚木聚糖，通過催化寡聚木聚糖的末端來釋放木糖殘基。木聚糖酶在生物轉(zhuǎn)化、制漿造紙工業(yè)、食品工業(yè)、飼料工業(yè)上等都具有很大的應(yīng)用潛力和價值。它在自然界廣泛分布，海洋及陸地細菌、海洋藻類、真菌(包括酵母)、瘤胃和反芻動物細菌、蝸牛、甲殼動物、陸地植物組織和各種無脊椎動物中都存在。由于微生物來源的木聚糖降解酶普遍存在于自然界且種類繁多應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，因此對于微生物木聚糖酶研究報道很多。目前，人們研究和應(yīng)用得最多的是細菌和霉菌來源的木聚糖酶。木聚糖酶來源不同，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不盡相同，且其pH適用范圍和最適范圍也各異。一般來說，真菌來源的木聚糖酶多在酸性條件下具有最大活力，pH最適范圍為4.(f6.0，屬于酸性木聚糖酶；細菌和放線菌木聚糖酶屬中性或堿性木聚糖酶，其最適pH在6.08.0之間。同時，木聚糖酶的耐熱性和最適作用溫度也隨其來源不同而不同。一般而言，真菌來源的木聚糖酶最適作用溫度在50'C左右，而多數(shù)細菌和放線菌所產(chǎn)木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度在5(T6(TC之間，耐熱性比真菌木聚糖酶稍好一些。在木聚糖酶研究方面，涉及的嗜熱菌種有白腐菌(Ceri/^ri叩w^5T/力mr歷i5^ora)、(5a"'77wst力enz/a/7tarc"cus)、嗜熱偵!j孢霉(S/arotrz'c/7"歷t力er/nop力"e)、短梗霉(」"reo/7aw'di咖/"W〃Ja/AsATCC20524)、藍色鏈霉菌(5Yr印t(9歷ycescja/e〃5"SN32)、疏棉狀嗜熱絲孢菌(7力er歷o歷yce517a"〃^7770SfACAU44)、小單胞菌(CW7w7ow.肌'，Zj'咖sp.HY-12)、纖維單胞菌屬(6W7i/7o歷麵s、嗜熱毛殼菌(C力aeto油"力er卿力ii咖)、腸桿菌(￡>tero6actarsp.MTCC5112)、丙酮丁醇梭菌(C7ostrW咖acetoZ"W，ATCC824)、高溫單孢菌(T7e扁yz歸，rasp.)、(CaWAacj77i/sce/7w7oKor朋51)、熱纖梭菌(c7osm't/f脂z^/er歷。ce77咖)、芽孢桿菌(Saw'—7-7jassp.NG-27)、枯草芽孢桿菌(5aci'i7"s6'"力"7isC-01)、嗜熱溶胞芽孢桿菌(feo6a"'77ussp.MT-1)、堅強芽孢桿菌(feci〃"s/Y」rMis)、耐熱芽孢桿菌(7y/ermoac^z'"o/z7ycest/zaJ;o;力j'JiAs)。關(guān)于木聚糖酶基因最新的專利報道。國內(nèi)專利有詹志春報道了一種木聚糖酶及其基因(第200510018452.3號，申請日期2005.03.25);袁建國等人報道了短小芽孢桿菌(fe^77"wmw'7m)木聚糖酶及其基因(第200510042557.2號，申請日期2005.03.10);董志揚等人分別報道了短小芽孢桿菌BP19的木聚糖酶及其基因(第02131439.X號，申請日期2002.10.14)和巴氏畢赤酵母(尸J'c力yaPGX722木聚糖酶及其基因(第200310103246.3號，申請日期2003.11.03);江正強等人報道了海棲熱袍菌(7力e/7Ho^卵/Hari"鵬)MSB8木聚糖酶及其基因(第02156022.6號，申請日期2002.12.11);李穎等人報道了一種木聚糖酶及其基因(第200310113562.9號，申請日期2003.11.17);屠俊等人報道了酵母基因工程菌GS115/HB705木聚糖酶及其基因(第200510018574.2號，申請日期2005.04.19);宋永霖報道了里氏木霉(Trichodermareesei)木聚糖酶及其基因(第02823195.3號，申請日期2002.11.20);張桂敏等人報道了一種木聚糖酶及其基因(第200610020049.9號，申請日期2006.08.29);V格羅比爾等人報道了一種從厭氧嗜熱細菌獲得熱穩(wěn)定性木聚糖酶及其基因(第95190553.8號，申請日期1995.06.14)。國際專利有DeBuyl等人報道了一種從芽孢桿菌(5acy""ssp.)720/1獲得的木聚糖酶及其基因(第09/909，207號，申請日期2001.7.19);Sung等人報道了一種熱穩(wěn)定性木聚糖酶及其基因(第09/856，025號，申請日期1999.11.16);Bhosle等人報道了一種從施氏假單胞菌(/^e^yo/Z7o/7asst""eri)獲得的嗜熱耐堿木聚糖酶及其基因(第10/223，852號，申請日期2002.8.20);Bentzien等人報道了一種嗜熱耐堿木聚糖酶及其基因(第09/570，856號，申請日期2000.5.12);Dunlop等人報道了一種從枯草芽孢桿菌(^3w77mm力"7&)獲得的嗜熱耐堿木聚糖酶及其基因(第09/639，354號，申請日期2000.4.16);DeBuyl等人報道了一種從芽孢桿菌(5aw77"ssp.)720/1獲得的寬pH范圍的木聚糖酶及其基因(第08/470,953號，申請日期1995,6.6);Williams等人報道了一種從嗜堿性細菌中獲得的嗜熱耐堿木聚糖酶及其基因(第08/501，126號，申請日期1995.12.29);Morgan等人報道了一種從柔曲小四孢菌(Wor"etrs邵ora/7e;nyosa)獲得的嗜熱耐堿木聚糖酶及其基因(第08/732，242號，申請日期1997.4.7);Gronberg等人報道了一種嗜熱木聚糖酶及其基因(第08/591,685號，申請日期1997.2.5);0uttrup等人報道了一種從嗜堿性芽孢桿菌(5a"77iASsp.)AC13獲得的耐堿木聚糖酶及其基因(第08/470,398號，申請日期1995.6.6);Vehmaa叩era等人報道了一種從放線菌(v4cW/7o鵬^/raspp.)獲得的熱穩(wěn)定性木聚糖酶及其基因(第08/468，812號，申請日期1995.6.6);Rele等人報道了一種從頭胞菌(Ccp力Wo印oW咖)中獲得的堿性木聚糖酶及其基因(第08/294,068號，申請日期1994.8.22);Casimir-Schenkel等人報道了一種從褐色高溫單胞菌(r力e777o歷oyKW/7ara/ksca)中獲得的熱穩(wěn)定性木聚糖酶及其基因(第08/292，147號，申請日期1994.4.17);Rosenberg等人報道了一種從嗜熱脂肪芽孢桿菌(泡"〃m"earot力er歷叩/l7"s)NCIMB40221中獲得的嗜熱耐堿木聚糖酶及其基因(第08/063，551號，申請日期1993.5.18);Campbell等人報道了一種從環(huán)狀芽孢桿菌(feci7^ascirc"7朋s)中獲得的熱穩(wěn)定性木聚糖酶及其基因(第08/044,621號，申請日期1993.4.8);Yu等人報道了一種熱穩(wěn)定性木聚糖酶及其基因(第07/340，307號，申請日期1989.4.19)等等。盡管關(guān)于木聚糖酶基因的專利報道有多篇，但從嗜熱脫氮芽孢桿菌中獲得熱穩(wěn)定性木聚糖酶及其編碼的基因尚未見文獻報道。本發(fā)明人首次公開了在嗜熱石油降解細菌中，采用嗜熱脫氮芽孢桿菌(6^^aw7^^^e77zo(/e/7^ri/yca/7s)NG80-2對木聚糖酶基因進行克隆表達、功能鑒定以及構(gòu)建大腸桿菌高效表達工程菌株。通過氨基酸序列比對和分析，證明本發(fā)明的木聚酶XynA2基因編碼的蛋白與已知的嗜熱脂肪芽孢桿菌(feo力a"77iAsWear"力e/m^/l7"WT6中的編碼木聚糖酶XynA2的基因(GenBankaccessionno.ABI49937)相似性最高(氨基酸序列一致性為87%),但feoZa"77us"earot力erffl叩h7usT6中的木聚糖酶XynA2未進行酶活力測定。與其他已知的木聚糖酶最相似的為土壤芽孢桿菌(6^^a"77"ssp.)MT-1中的木聚糖酶，相似性為86%(GenBankaccessionno.AAZ74783)。該酶屬于GH10族。本發(fā)明木聚糖酶XynA2的氨基酸序列第3位、128位、134位、330位是纈氨酸，第4位、31位、38位、115位、143位、148位、325位是絲氨酸，第5位、308位是谷氨酰胺，第12位、274位、288位、32位2是谷氨酸，第43位是亮氨酸，第60位、74位是精氨酸，第64位、236位是天冬氨酸，第65位、104位、160位、333位是異亮氨酸，第77位、168位、254位、304位是組氨酸，第119位、331位是丙氨酸，第145位是色氨酸，第166位是半胱氨酸，第187位、256位是賴氨酸，第263位是天冬酰胺，第193位、299位是酪氨酸，第194位、218位、278位是蘇氨酸，第295位是甲硫氨酸，第315位是苯丙氨酸。這與6"eo力aw77^ssp.MT-1的木聚糖酶的氨基酸序列不同(見圖12)，因此表現(xiàn)出更好的熱穩(wěn)定性。對這個XynA2基因進行了進一步功能鑒定，并與"eo力aw77"ssp.MT-1中的木聚糖酶活性進行了比較，實驗結(jié)果表明本發(fā)明的木聚糖酶XynA2是一種新型的酶，這種酶不但耐高溫，而且熱穩(wěn)定性優(yōu)良，從而完成了本發(fā)明的工作。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明一個目的是公開了一種耐高溫重組木聚糖酶XynA2。本發(fā)明另一目的是公開了編碼本發(fā)明的木聚糖酶XynA2基因。本發(fā)明再一目的是公開了一種表達木聚糖酶的重組質(zhì)粒，其中至少包括上述的木聚糖酶XynA2的編碼基因。本發(fā)明還一目的是公開了一種導入了上述的木聚糖酶XynA2編碼基因，產(chǎn)生木聚糖酶的重組菌，例如含有重組質(zhì)粒的重組菌株H1398。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種編碼木聚糖酶XynA2的基因，該基因具有選自下組的核苷酸序列-a)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或b)不同于SEQIDNO:1但編碼的氨基酸序列與SEQIDNO:1所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列；或c)在嚴格雜交條件下與所述的a)或b)中的序列雜交，并且編碼具有活性的木聚糖酶核苷酸序列。應(yīng)當指出的是，上述提到的術(shù)語"嚴格條件"在本說明書中的含義是指在該條件下形成了所謂特異雜交而沒有形成非特異的雜交。例如，該嚴格條件可以是，相互之間的同源性不小于70%的DNA之間可以雜交而低于上述數(shù)值的DNA之間不能雜交，優(yōu)選的是同源性不少于90%的DNA之間可以雜交。相對于Southern雜交中普通洗滌條件而言，可以例如為如下的雜交條件將雜交膜置于預(yù)雜交液(O.25mol/L磷酸鈉緩沖液，PH7.0，7%SDS)中，50'C預(yù)雜交30min;棄預(yù)雜交液，加入雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.0，7%SDS，同位素標記的核苷酸片段)，5(TC雜交12hr;棄雜交液，加入洗膜液I(2XSSC和0.1%SDS)，50。C洗膜2次，每次30min;加入洗膜液II(0.5XSSC和0.1%SDS)，50。C洗膜30min。本發(fā)明進一步公開了一種木聚糖酶XynA2，該酶具有核苷酸序列編碼的氨基酸序列?；蛘咦詈镁哂蠸EQIDNO:2所示的氨基酸序列；或上述中缺失、替換或插入一個或多個氨基酸后、并且具有所述木聚糖酶活性的氨基酸序列。本發(fā)明再進一步公開了重組表達質(zhì)粒及重組菌，它含有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的基因。所述的重組質(zhì)粒的載體為pET-28a(+)，重組質(zhì)粒為pLW1178。含有重組質(zhì)粒的重組菌株H1380，這些均屬于本發(fā)明的保護范圍。擴增木聚糖酶XynA2中任意片段的引物對，也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的較佳實施例中，上述木聚糖酶XynA2的最適底物為山毛櫸木聚糖；本發(fā)明的較佳實施例中，上述木聚糖酶的反應(yīng)溫度為30-C-10(TC，優(yōu)選7(TC。本發(fā)明的較佳實施例中，上述木聚糖酶反應(yīng)pH值為7.6-10.6，優(yōu)選最適反應(yīng)pH值為9.0。本發(fā)明提供的表達木聚糖酶的重組質(zhì)粒為pLW1178，至少包括上述的木聚糖酶XynA2的編碼基因。本發(fā)明的較佳實施例中，上述的重組質(zhì)粒的載體為pET-28a(+)。本發(fā)明的較佳實施例中，木聚糖酶的重組菌內(nèi)導入了木聚糖酶XynA2的編碼基因。所述的重組菌為大腸桿菌。優(yōu)選為大腸桿菌BL21菌株。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員應(yīng)該知道，本發(fā)明編碼木聚糖酶的DNA序列，還包括編碼對SEQIDNO:1所示核苷酸序列所表達的酶分子的氨基酸序列進行一個或多個氨基酸替換、插入或缺失并仍具有該酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。另外，對本發(fā)明的木聚糖酶基因所表達的酶分子的氨基酸進行一個或多個氨基酸替換、插入或缺失所得到的蛋白質(zhì)，也能達到本發(fā)明的目的。因而本發(fā)明還包括與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少70%的同源性，優(yōu)選具有至少90%的同源性，但同時具有木聚糖酶活性的蛋白質(zhì)。上面使用的術(shù)語"多個"可以是小于IOO的數(shù)目，優(yōu)選為小于10的數(shù)目。本發(fā)明所述的XynA2基因，它是以從嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2中分離的木聚糖酶XynA2(GTNG—1774基因編碼)基因組DNA為模板，根據(jù)XynA2基因全序列，設(shè)計兩對引物，有效地擴增出了XynA2基因片段并進行拓撲、克隆和DNA序列測定，進一步實驗顯示木聚糖酶XynA2將木聚糖的長鏈打斷為寡聚木聚糖，然后通過木糖苷酶將寡聚木聚糖徹底降解(如圖1)。本發(fā)明提出的XynA2和已知的木聚糖酶相比，本發(fā)明提出的XynA2木聚糖酶屬于新型酶，不但耐高溫，而且熱穩(wěn)定性優(yōu)良。目前已公開發(fā)表的文章介紹木聚糖酶熱穩(wěn)定性較長的有嗜熱脂肪芽孢桿菌(feo力acW7"s"ear"力e頂o/^7"s)T6中的木聚糖酶在65。C中能保存10小時(Khasin，A.，etal,Purificationandcharacterizationofathermostablexylanasefromfec_z'7_Zf/sstearot力ei"歷cip力J'7i/51T—6.Appl.Environ.Microbiol.1993.59:1725-30.);放線菌(5Yre/^o/zycescja/ews)SN32中的木聚糖酶在60。C中倉旨保存1小時(Ni麗e，S.，etal，Purificationandcharacterizationofextracellularxylanasefrom5Yre/to/7yces1cya/2ei/51SN32,Bioresour.Technol.2007.);纖維單胞菌(CeL^/o忍o/asxaiaie朋)中的木聚糖酶在55或60。C中能保存1小時(Santiago—Herndndez，A.，etal，Purificationandcharacterizationoftwosugarcanebagasse—absorbablethermophilicxylanasesfromthemesophilicCe77w7,腦J脂'《e/a，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.2007.34:331-338);陰溝腸桿菌(&teroZactersp.)MTCC5112中的木聚糖酶在50'C中能保存50小時(Khandeparkax,R.，etal，Purificationandcharacterizationofthermoalkalophilicxylanaseisolatedfromthe^/tero力3"ersp.MTCC5112，Res.Microbiol.2006.157:315-325);出芽短梗霉(J"reo6asJ't/j'"歷p"77"7朋s)ATCC20524中的木聚糖酶在65。C中能保存半小時(Tanaka，H.，etal，Purificationandpropertiesofafamily-lOxylanasefromJ"i-eo力357W咖/w77i/7s"51ATCC20524andcharacterizationoftheencodinggene,Appl.Microbiol.Biotechnol.2006.70:202-211);堅強芽孢桿菌(&cj77"s/YrM/s)中的木聚糖酶在62'C中能保存16小時(Chang,P.,etal，Cloningandcharacterizationoftwothermostablexyianasesfromanalkaliphilic5a"77us/Yraus,BiochenuBioph.Res.Co.2004.319:1017-1025);嗜熱芽孢桿菌(fecj77wt力er歷朋ter"ic〃s)中的木聚糖酶在60。C中能保存24小時(Lama，L,etal,PurificationandcharacterizationofthermostablexyianaseandP—xylosidasebythethermophilicbacterium5aci77i/st力er翻tarc",，Res.Microbiol.2004.155:283-289);丙酮丁醇梭菌("ostrW咖ace"力"Wic柳)ATCC82中的木聚糖酶在60。C中能保存1小時(Ali，M.K.etal，Thermostablexyl肌ase10BfromC7ostrjW咖scetoZt/0^'c"/zATCC824,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.2004.31:229-234);高溫單孢菌(T力e擺羅卿orasp.)中的木聚糖酶在60。C中能保存8小時(Geore,S.P.，etal,Anovelthermostablexylanasefromr力er歷cyz0/70s/Qrasp.:influenceofadditivesonthermostability,Bioresour.TechnoL2001.78:22卜224);高溫放線菌(r力e層sc"層，st力a7一D中的木聚糖酶在65。C中能保存2小時(Kohli，U.etal,Thermostable,alkalophilicandcellulasefreexyianaseproductionbyT^er/ffosct/no/Hycest力a7o/力j7iASsubgroupC，EnzymeMicrob.Technol.2001.28:606-610)。本發(fā)明的木聚糖酶XynA2與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果在于與已知的木聚糖酶相比該酶的熱穩(wěn)定性高，且在55'C下孵育24小時后仍具有5C^以上的活性，在70'C下活性能保存2小時，在75。C下活性能保存30分鐘。本發(fā)明的木聚糖酶XynA2性能不同于已報道的木聚糖酶，該木聚糖酶XynA2具有在高溫、高pH條件下保持高活性的特征。木聚糖酶XynA2最適反應(yīng)溫度為7(TC;最適反應(yīng)pH9.0。在堿性環(huán)境中熱穩(wěn)定性好。適合分解半纖維素中的木聚糖生產(chǎn)功能性寡聚木聚糖。圖1是本發(fā)明的木聚糖瞎降解木聚糖作用示意圖2為本發(fā)明實施例中的木聚糖酶基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建模式圖圖3表示本發(fā)明木聚糖酶SDS-PAGE電泳圖。圖4表示本發(fā)明木聚糖酶對不同底物的相對活力。圖5表示本發(fā)明木聚糖酶在不同溫度下的相對活力。圖6表示本發(fā)明木聚糖酶在不同pH值下的相對活力。圖7表示本發(fā)明木聚糖酶的在55'C下的熱穩(wěn)定性。圖8表示本發(fā)明木聚糖酶的在7(TC下的熱穩(wěn)定性。圖9表示本發(fā)明木聚糖酶的在75'C下的熱穩(wěn)定性。圖IO表示本發(fā)明木聚糖酶SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。圖11表示本發(fā)明木聚糖酶SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。圖12表示本發(fā)明木聚糖酶XynA2與feo力ac/77w印.MT-1中的木聚糖酶氨基酸序列的比較。具體實施例方式為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，并配合附圖，作詳細說明。下面的具體實施例僅僅是用于說明而不是限制本發(fā)明。實施例一1.嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2(CGMCCNo.1228)總DNA的提取嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2(CGMCCNo.1228)總DNA的提取研究證明由嗜熱脫氮芽孢桿菌(6"eo力aci77i/s"e/wo^e/H'tri/yca/w)NG80-2基因組能夠分離出編碼醇脫氫酶的基因。因此，在本實施例中，采用從中國天津大港油田官69-8區(qū)塊油井地層水分離獲得的嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2(其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCCNo.1228，保藏日期為2004年10月09日，已申請國內(nèi)發(fā)明專利并獲得授權(quán)，發(fā)明名稱嗜熱脫氮芽孢桿菌及其篩選和應(yīng)用，專利號ZL200410072759.7),取其過夜培養(yǎng)的新鮮培養(yǎng)物3ml,離心收集菌體，菌體懸于250u150mMTris緩沖液中(pH8.0)，加入lOul0.4MEDTA(pH8.0),混勻后37。C保溫20min，之后加入30u120mg/ml溶菌酶，混勻后37。C再保溫20min，再加入5u120mg/ml蛋白酶K，溫柔混勻后，再加入20!U1(^SDS，5(TC保溫至溶液澄清，分別用等體積酚氯仿:異戊醇抽提兩次，氯仿:異戊醇抽提一次，最后一次的上清溶液，加入2.5倍體積預(yù)冷的無水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，沉淀溶于10011lTE緩沖液(pH8.0,10mMTris，lraMEDTA),加入10mg/mlRNase2p1，65。C保溫30min，分別用酚氯仿異戊醇、氯仿異戊醇各抽提一次，上清液加入2.5倍體積預(yù)冷的無水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，真空干燥，沉淀溶于50U1TE緩沖液。DNA溶液的紫外分光光度計測定結(jié)果為A260/A280=1.95,A260=0.73。2.木聚糖酶基因XynA2的克隆和篩選取嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2(CGMCCNo.1228)總DNA溶液0.5u1(約10ng)作為模板，以下列寡核苷酸序列作為引物，進行PCR擴增。反應(yīng)混合物(50ul)如下ddH20，34ul;10XPCRBuffer,5ul;MgCl2Buffer,5ul;dNTPMix,2ul;上游引物，lul;下游引物，lul;NG80-2基因組DNA，lul;TaqDNApolymerase,lul。引物序列如下上游引物為SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，下游引物為SEQIDNO:4所示的核苷酸序列設(shè)定的PCR循環(huán)參數(shù)如下-95。C，5min;95°C，30s;50°C，45s:72°C，2min;72°C，lOmin;4°C，2hr。按上述設(shè)定的PCR循環(huán)參數(shù)進行25個循環(huán)PCR。上述PCR產(chǎn)物用7Vfco[和Z力ol雙酶切，經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收酶切產(chǎn)物片斷。與經(jīng)同樣限制型內(nèi)切酶酶解并切膠回收的質(zhì)粒pET-28a(+)連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)DH5a后，涂于含50ug/mlKan(卡那霉素)的LB固體培養(yǎng)基上。37'C培養(yǎng)12小時，挑取單克隆轉(zhuǎn)接到20mlLB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)(50ug/mlKan)，37'C培養(yǎng)12小時后，提取質(zhì)粒鑒定，插入有SEQIDNO:1的DNA序列的pET-28a(+)質(zhì)粒為重組質(zhì)粒pLW1178(見圖2)，將重組質(zhì)粒pLW1178轉(zhuǎn)入表達宿主大腸桿菌BL21(該菌株可向天津開發(fā)區(qū)厚普生物技術(shù)開發(fā)有限公司訂購,貨號為69387-3)中，得到含有該重組質(zhì)粒的重組菌株為H1398,此重組質(zhì)粒pLW1178可高頻轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21表達木聚糖酶活性和抗卡那霉素性能。其中的酶切及連接反應(yīng)均參照表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>g10XBuffer3.OpL載體DNA片斷550ng限制性內(nèi)切酶110~20U1OXT4ligasebuffer1限制性內(nèi)切酶21(T20UTi腿ligase10UddH20X總體積lOuL總體積303.XynA2DNA片段的測定采用Sanger法對此DNA片段進行了測序，測序結(jié)果顯示PLW1178中的插入片段含有長1002bp(SEQIDNO:1)的開放閱讀框架，編碼由333(SEQIDNO:2)個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。實施例二重組木聚糖酶的表達純化和特性將上述重組菌H1398單克隆接入20ml含50ug/mlKan的LB培養(yǎng)基中，37°C，180rpm培養(yǎng)12小時，然后將培養(yǎng)物按1%(v/v)接種量接入200ml含50iig/mlKan的LB培養(yǎng)基，37°C,220rpm培養(yǎng)至0D600為0.6時，加入IPTG至終濃度為0.lmM，在37。C、180rpm誘導3小時。5000rpm離心5min收集菌體，懸于含50mMTris-HC1(pH8.0)緩沖液中，利用超聲波破碎細胞，14000g離心20min，上清液為醇脫氫酶的粗提液。此上清液經(jīng)螯合瓊脂糖凝膠(ChelatingS印harose)鎳親合柱層析純化，得到的酶制劑在SDS-PAGE上顯示一條帶(見圖3)。利用已知的蛋白質(zhì)化學標準方法測定此酶系的基本特性。用SDS-PAGE測得的重組酶的分子量為40kDa，與理論上推算的分子量(39027Da)相似；等電點沉淀法測得的重組酶的等電點pl為5.7。實施例三1.測定本發(fā)明木聚糖酶作用于不同來源的底物時的比活力將木聚糖酶添加于動物飼料或者造紙紙漿中，應(yīng)當考慮其對不同來源的木聚糖的活性及專一性對應(yīng)用的影響，燕麥木聚糖作為麥類作物(小麥、黑麥和小黑麥)木聚糖模式底物，山毛櫸木聚糖和樺樹木聚糖作為木材來源木聚糖模式底物考察其對不同來源木聚糖的比活力。上述實施例二中制得的木聚糖酶能降解不同來源的木聚糖，本實驗對目前可購買到的三種木聚糖底物燕麥木聚糖(Sigma貨號為X0627)、山毛櫸木聚糖(Sigma貨號為X4252)、樺樹木聚糖(Sigma貨號為X0502),進行了酶活力檢測。具體方法為配制木聚糖酶XynA2反應(yīng)體系(100ul)為加入燕麥木聚糖、山毛櫸木聚糖、樺樹木聚糖底物至終濃度1%(w/v)，一定濃度的木聚糖酶XynA2，用50mMpH9.0的glycine-NaOH緩沖液補至100ul?；靹颍?0'C水浴中反應(yīng)15分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，冰浴終止反應(yīng)，加入150ul的WDNS試劑(3，5二硝基水楊酸1%;苯酚0.2%;硫酸鈉O.05%;酒石酸鉀鈉20%;氫氧化鈉1%。避光放置兩周后使用。)沸水浴10分鐘，然后在540nm處測定光吸收。以木糖為標準曲線，計算每分鐘生成lixmol還原糖所需酶量，定義為l個酶活力單位。測定結(jié)果參見圖4，從該圖中可以看出，木聚糖酶對三種不同來源的商品化木聚糖均能降解，其最適底物為山毛櫸木聚糖。2.測定本發(fā)明木聚糖酶在不同溫度下的比活力-對上述實施例二中制得的木聚糖酶進行最適反應(yīng)溫度的測定，具體方法為配制木聚糖酶XynA2反應(yīng)體系(100ul)為加入燕麥木聚糖底物至終濃度1%(w/v)，一定濃度的木聚糖酶XynA2，用50mMpH9.0的glycine-NaOH緩沖液補至lOOP1?；靹颍謩e于25、00'C水浴中反應(yīng)15分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，冰浴終止反應(yīng)。加入150y1的DNS試劑沸水浴10分鐘，然后在540nm處測定光吸收。以木糖為標準曲線，計算每分鐘生成lumol還原糖所需酶量，定義為l個酶活力單位。測定結(jié)果參見圖5。從該圖中可以看出，木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度約為70'C。3.測定本發(fā)明木聚糖酶在不同pH下的比活力對上述實施例二中制得的木聚糖酶進行最適反應(yīng)pH值的測定，具體方法為配制100u1反應(yīng)體系，底物燕麥木聚糖的終濃度為1%(M/V)，一定濃度的木聚糖酶XynA2，分別用50mMpH3-11.9的緩沖液(配方見表2)補至100u1?；靹?，在70'C水浴中反應(yīng)15分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，冰浴終止反應(yīng)。加入150pl的DNS試劑沸水浴10分鐘，然后在540mn處測定光吸收。以木糖為標準曲線，計算每分鐘生成1ymol還原糖所需酶量，定義為1個酶活力單位。測定結(jié)果參見圖6,從該圖中可以看出，木聚糖酶的pH值為7.6-10.6，優(yōu)選最適反應(yīng)pH值為9.0。這種在堿性范圍內(nèi)穩(wěn)定的特性有利于工業(yè)上應(yīng)用。表2木聚糖酶活測定中所用的緩沖液pH范圍緩沖液pH3-6citrate—sodiumcitratepH6-8K2HP04-KH2P04pH8-9Tris-HC1pH8.6-10.6glycine-NaOHpH11-11.9Na細廣NaOH4.測定本發(fā)明木聚糖酶的熱穩(wěn)定性-對上述實施例二中制得的木聚糖酶進行熱穩(wěn)定性的測定，具體方法為將一定濃度的木聚糖酶XynA2放入55和70"C水浴中溫浴，每隔一小時取出一部分酶做酶活反應(yīng)。配制木聚糖酶XynA2反應(yīng)體系(100u1)為加入燕麥木聚糖底物至終濃度1%"/"，一定濃度的木聚糖酶XynA2，用50mMpH9.0的Glycine-NaOH緩沖液補至lOOu1?；靹?，在7(TC水浴中反應(yīng)15分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，冰浴終止反應(yīng)。加入150ul的DNS試劑沸水浴IO分鐘，然后在540nm處測定光吸收。以木糖為標準曲線，計算每分鐘生成lumol還原糖所需酶量，定義為l個酶活力單位。測定結(jié)果參見圖7、8、9。從圖中可以看出，木聚糖酶XynA2在55'C溫浴24小時后仍保持約5(^的酶活性，在7(TC溫浴2小時后有2.6%的酶活性，在75°。溫浴30分鐘后有6.3%的酶活性。實施例四1.將本發(fā)明木聚糖酶XynA2的氨基酸序列與feo力aw77"ssp.MT-1木聚糖酶的氨基酸序列進行比對，比對結(jié)果參見圖12。2.本發(fā)明木聚糖酶XynA2與6"eo力acj77wsstearot力eryzc!p力j7iAST6和CeoZacj7Jw51sp,MT-1中的木聚糖酶各項酶學參數(shù)均有不同，詳見表3。表3XynA2與6"eO;6acj77i/ssfearot/e77no//j'JiAsT6和Geote"'JJiAssp.MT-1中的木聚糖酶酶學參數(shù)的比較NG80—2T6MT-1最適反應(yīng)溫度rc)最適反應(yīng)pH707.6未鑒定未鑒定707.0熱穩(wěn)定性55'C溫浴24小時后仍有5(W以上活性，70'C下未鑒定75'C溫浴30分鐘活性能保存2小時，75'C下活性能保存30分鐘內(nèi)即失活比活力(U/mg)368.76未鑒定289從圖12和表3可以看出，由于氨基酸的變化，NG80-2中的木聚糖酶XynA2比fe"aci77"ssp.MT-l中的木聚糖酶活性更高，更耐堿嗜熱，更具熱穩(wěn)定性。雖然本發(fā)明己以較佳實施例披露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍所做的更動與改進，都將落入本發(fā)明的保護范圍。序列表<110>南開大學<120>耐高溫木聚糖酶XynA2和編碼該酶的基因與應(yīng)用<160>4<210>1<211>1002<212>DNA<213>嗜熱脫氮芽孢桿菌(Ge<6fl"7/WAerwfe"http://wyJaHW)NG80-2<220><221>gene<222>(1)..(1002)<400>1atgagcgtgagtcaatcgctcccctccctccgtgaagtatttgcgaatgactttcgcatt60ggagcggcagttaatccggtgaccattgaaagctgttgattagccacgtc120aacagccttacagccgaaaacca±atgaagttcgaacatccttcagccggaagaagggcgg180ttcacgtttgacatcgccgatcgaatcgtcgatttcgctcgttcccatcacatggcggtt240cgcgggcatacgctcgtatgacgccggattgggtgtttcaggatggtcaa300ggtcatttcatcagcagggatgtgttgcttgagcggatgaagtcccacatttctgcagtt360gtacggcggtacaaggggaaagtgtattgctgggatgtggtcaacgaagcggtggctgac420gaggggsgcg祖tggttgcgttcstcga^gtggcgcc站aitcsttggggeicgattttatt480gaacaggcgtttctctgtgctcatgaagccgacccagacgcgttgttgttttacaatgat540tataatgaatgttttccgaaaaaacgcgagaagatctatacactagttaaatctttgcga600gacaaagggattcccattcscggcatcggtatgcaggcgcattggagcctgacgcgcccg660tcattggacgaaattcgagcagccattgaacgatatgcgtctctcgatgtggttcttcac720attacggagcttgatgtatctatgtttgaatttcacgaccatcgcaaggacttagctgcc780cctacaaacgaaatgatcgaacgacaggcagagcggtacg站ca站ttttcsctctattc840aaggagtatcgtgacgtaattgaaagtgtaacattttggggaatggccgatgactatacg900tggctcgatcactttccggtgcaagggagaaaaaactggccatttttgtttgatgaacaa960cacgaaccgaagtcagctttttggagagtggcgagtatct站1002<210>2<211>333bp<212>PRT<213>嗜熱脫氮芽孢桿菌(feo6a"J7〃st力er/zoc/e/n'^ri/Yc朋s)NG80-2<220><221>CHAIN<222>(1)..(333)<400>2MetSerValSerGinSerLeuProSerLeuArgGluValPheAlaAsn151015AspPheArglieGly20LysGinLeuI^eulie35MetLysPheGluHis50lieAlaAspArglie6570ArgGlyHisThrLeu85GinAspGlyGinGly100MetLysSerHislie115TyrCysTrpAspVal130TrpIjeuArgSerSerAlaAlaValAsnProValThrlieGluSerGin2530SerHisValAsnSerLeuThrAlaGluAsnHis4045LeuGinProGluGluGlyArgPheThrPheAsp5560ValAspPheAlaArgSerHisHisMetAlaVal7580ValTrpHisAsnGinThrProAspTrpValPhe9095HisPhelieSerArgAspVall<eulieuGluArg105110SerAlaValValArgArgTyrLysGlyLysVal120125ValAsnGluAlaValAlaAspGluGlySerGlu135140LysTrpArgGinlielieGlyAspAspPhelie145150155160GluGinAlaPheLeuCysAlaHisGluAlaAspProAspAlaLeuLeu165170175PheTyrAsnAspTyrAsnGluCysPheProLysLysArgGluLyslie180185190TyrThrLeuValLysSerLeuArgAspLysGlylieProlieHisGly200205GinAlaHisTrpSerLeuThrArgProSerLeuAspGlu215220AlalieGluArgTyrAlaSerLeuAspValValLeuHis230235240LeuAspValSerMetPheGluPheHisAspHisArgLys245250255AlaProThrAsnGluMetlieGluArgGinAlaGluArg265270PheThrLeuPheLysGluTyrArgAspVallieGlu280285TrpGlyMetAlaAspAspTyrThrTrpLeuAspHis295300GlyArgLysAsnTrpProPheLeuPheAspGluGin310315320SerAlaPheTrpArgValAlaSerlie325330<210>3<211>32bp<212>DNA195lieGlyMet210lieArgAla225lieThrGluAspLeuAla260TyrGluGinlie275SerValThrPhe290PheProValGin305HisGluProLys<213>人工序列<4(,0>3acgaccatggtgagcgtgagtcaatcgctccc32<210>4<211>32bp<212>DNA<213>人工序列<400>4tgcactcgsgtg3tsctcgcC3ctctcc站ss3權(quán)利要求1、一種編碼木聚糖酶XynA2的基因，該基因具有選自下組的核苷酸序列a)SEQIDNO1所示的核苷酸序列；或b)不同于SEQIDNO1但編碼的氨基酸序列與SEQIDNO1所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列；或c)在嚴格雜交條件下與所述的a)或b)中的序列雜交，并且編碼具有活性的木聚糖酶核苷酸序列。2、一種木聚糖酶XynA2，它具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；3、一種重組表達質(zhì)粒，它含有權(quán)利要求l所述的木聚糖酶XynA2編碼基因。4、權(quán)利要求3所述的重組表達質(zhì)粒，所述的重組質(zhì)粒的載體為pET-28a(+)。5、權(quán)利要求l所述的木聚糖酶XynA2編碼基因，其特征在于所述的木聚糖酶于嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2中分離得到。6、權(quán)利要求l所述的木聚糖酶XynA2編碼基因，其特征在于所述的木聚糖酶的最適底物為山毛櫸木聚糖；最適反應(yīng)溫度均為70°C。7、權(quán)利要求1所述的木聚糖酶XynA2編碼基因，其特征在于所述的木聚糖酶pH值為9.08、一種產(chǎn)生木聚糖酶的重組菌，其特征在于它含有權(quán)利要求1所述的木聚糖酶XynA2編碼基因。9、權(quán)利要求8所述的木聚糖酶XynA2的重組菌，其特征在于所述的重組菌為大腸桿菌BL21菌株。全文摘要本發(fā)明公開了由嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillusthermodenitrificans)NG80-2基因組DNA借助PCR擴增而得到的木聚糖酶XynA2構(gòu)建表達載體在大腸桿菌中表達出該基因編碼的重組木聚糖酶。該酶的最適反應(yīng)溫度為70℃，最適反應(yīng)pH為9.0，在堿性環(huán)境中熱穩(wěn)定性好。適合分解半纖維素中的木聚糖生產(chǎn)功能性寡聚木聚糖。文檔編號C12N1/21GK101429516SQ20081015307公開日2009年5月13日申請日期2008年11月14日優(yōu)先權(quán)日2008年11月14日發(fā)明者露馮,劉雪倩,磊王申請人:南開大學