專利名稱：：一種抑制黃曲霉危害花生生產(chǎn)、貯藏的工藝技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種微生態(tài)黃曲霉抑菌劑及其用于花生生產(chǎn)和貯藏的用途，更具體地說本發(fā)明提供了阻斷黃曲霉污染花生多條途徑的方法，大大地降低黃曲霉毒素在花生中的含量。屬于防治黃曲霉危害花生作物的
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：黃曲霉菌在生長過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素是一種強致癌物質(zhì)，已被世界衛(wèi)生組織列為已知最強的致癌物。由于花生易感染黃曲霉菌，為保障本國人民的食品安全和身心健康，世界各國均制訂了嚴格的黃曲霉毒素限量標(biāo)準，花生出口"門檻"由此提高。中國早在20世紀80年代初期便制訂了花生黃曲霉毒素限量國家標(biāo)準，如1981年制訂了GB2761《食品中黃曲霉毒素B1允許量標(biāo)準》，規(guī)定花生仁、花生油及花生制品中黃曲霉毒素S2(^g/kg，之后又制訂了黃曲霉毒素的測定方法等。2005年中國重新修訂了黃曲霉毒素限量國家標(biāo)準，并于2005年1月25日發(fā)布了GB2761-2005《食品中真菌毒素限量》標(biāo)準，代替1981年發(fā)布的GB2761《食品中黃曲霉毒素Bl允許量標(biāo)準》。同期國家還發(fā)布了GB19641-2005《植物油料衛(wèi)生標(biāo)準》[l]和GB2716-2005《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準》[2]。同時規(guī)定黃曲霉毒素的測定要按照08/丁5009.22-2003[7]規(guī)定的方法執(zhí)行，這些標(biāo)準中均包括花生及制品的黃曲霉毒素的限量指標(biāo)。另外，這3個新標(biāo)準在修訂時均參考了國際食品法典委員會(CAC)的標(biāo)準，并要求全文強制執(zhí)行，新標(biāo)準于2005年10月1日起實施，均有一年的過渡期，即2005年10月1日前生產(chǎn)并符合相應(yīng)標(biāo)準要求的產(chǎn)品，允許銷售至2006年9月30日[3]。2003年8月國家標(biāo)準委還重新修訂發(fā)布了3個關(guān)于黃曲霉毒素測定方法標(biāo)準，分別是GB/T5009.22-2003《食品中黃曲霉毒素B1的測定》，規(guī)定了花生及其制品中黃曲霉毒素B1的測定方法，該方法黃曲霉毒素B1的檢出限為5pg/kg[4];GB/T5009.23-2003《食品中黃曲霉毒素B1、B2、Gl、G2的測定》，規(guī)定了花生及其制品中的黃曲霉毒素B1、B2、Gl、G2的測定方法，該方法檢出限黃曲霉毒素B1、Gl為5(ig/kg，B2、G2為2.5pg/kg[5]。花生從田間到收獲、貯存以及加工各環(huán)節(jié)都有感染黃曲霉毒素的風(fēng)險，由于黃曲霉毒素的強致癌作用，世界衛(wèi)生組織及各國都加強了對花生及制品中黃曲霉毒素的檢測工作。目前世界發(fā)達地區(qū)和國家以保護健康為由，對花生及制品制訂了非常苛刻的黃曲霉毒素B1限量值，并設(shè)有明確的限量要求(見表1)。<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>主要花生進口國對黃曲霉毒素限量要求也不盡一致，但總體趨勢是越來越嚴，含量要求越來越低，有的國家要求不得檢出黃曲霉毒素。大部分發(fā)達國家花生黃曲霉毒素限量從20pg/kg已降低到4pg/kg，其他國家或地區(qū)的限量要求也小于5pg/kg,目前國際上將低于5pg/kg的檢驗結(jié)果視為無黃曲霉毒素污染風(fēng)險[6]。世界衛(wèi)生組織(WHO)制定的食品中黃曲霉毒素的最高允許量為小于15pg/kg;食品法典委員會(CAC)推薦食品中黃曲霉毒素允許總量(B1+B2+G1+G2)小于15pg/kg;美國食物藥品管理局(FDA)要求小于15pg/kg。2001年歐盟制定了新的花生黃曲霉毒素限量標(biāo)準，規(guī)定黃曲霉毒素Bl為《pg/kg,B1+B2+G1+G2為^4ng/kg,取樣方法要根據(jù)98/53/EC(7)，分析標(biāo)準要根據(jù)98/53/EC;2002年歐盟決議對從中國進口或委托從中國進口的花生和制品實施黃曲霉毒素強制性檢測；2003年又要求中國花生出口商每3個月提供一次官方花生黃曲霉毒素控制分析報告并啟動對中國出口花生產(chǎn)地的調(diào)查世界主要花生進出口國家及地區(qū)黃曲霉毒素的限量指標(biāo)程序，公布調(diào)査報告；在2004年歐盟每周預(yù)警通報不合格產(chǎn)品中，花生黃曲霉毒素超標(biāo)所占比例最大，其中山東輸歐盟花生及其制品被預(yù)警的共計43批次。黃曲霉及其毒素的防治目前主要采用化學(xué)藥物處理，PassoneMA等[7]認為食品級的抗氧化劑丁基羥甲苯(Butylatedydroxytoluene，BHT)、三羥基丁酰苯(Trihydroxybutyrophenone，THB)、羥苯甲酸丙酯(Propylparaben，PP)、叔丁基畫4畫羥基茴香醚(Butylatedydroxyanisole，BHA)在濃度lmmol/L、10mmol/L和20mmol/L情況下對黃曲霉菌的萌芽、生長及黃曲霉菌孢子Flavi菌系的黃曲霉毒素B1(AFB1)產(chǎn)生的效力有一定的影響。BHA和PP能在比較寬的水分活度(wateractivity)范圍內(nèi)對花生曲霉菌是有效真菌抑制劑。目前，美國以批準納他霉素作為食品防腐劑防治有害真菌對食品的污染。而黃曲霉防腐劑主要使用在最后貯藏階段，沒有從源頭根治食品中黃曲霉及其毒素的產(chǎn)生，從而不能有效對黃曲霉進行全生態(tài)的根除。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一整套防止黃曲霉生長繁殖的生產(chǎn)工藝技術(shù)，從而有效降低花生農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素的含量，減少花生從田間到收獲、貯存以及加工各環(huán)節(jié)感染黃曲霉毒素的風(fēng)險。提高食品安全性，促進花生進出口貿(mào)易。因此，本發(fā)明第一個發(fā)明目的是提供一種包含枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)的微生態(tài)黃曲霉抑菌劑，其中所述菌株已于2008年05月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo.2495。其中，所述的枯草芽孢桿菌篩選過程從各地采集土壤樣品，采用不同的培養(yǎng)基進行篩選，篩選到多個菌株，逐一進行黃曲霉抑制實驗，得到黃曲霉抑制菌株，進行菌種簽定和毒理實驗。生理學(xué)特征是0.70.8微米，單個或鏈狀排列，著色均勻，無莢膜，運動，革蘭氏染色陽性。芽孢0.60.9微米，橢圓到柱狀，中生到近中生，芽孢囊不明顯膨大。菌落粗糙、不透明，不閃光，擴張，污白色或微帶黃色。它可使液化明膠、胨化牛奶，還原硝酸鹽、水解淀粉，是好氧性細菌。在一個具體實施方案中，所述的微生態(tài)黃曲霉抑菌劑還包括該菌培養(yǎng)基質(zhì)及該菌代謝產(chǎn)物。本發(fā)明第二個發(fā)明目的是抑菌劑在花生生產(chǎn)及其產(chǎn)品加工中用于抑制黃曲霉的用途。其中所述的用途包括用微生態(tài)黃曲霉抑菌劑(液體制劑)拌種(花生種子)育苗工藝；用微生態(tài)黃曲霉抑菌劑噴施花生花期的田間管理工藝；用微生態(tài)黃曲霉抑菌劑噴霧收割的花生作物的貯存工藝。在一個具體實施方案中，使用上述的微生態(tài)黃曲霉抑菌劑(液體制劑)適量清水稀釋拌種(現(xiàn)拌現(xiàn)播花生種子)育苗工藝，可抑制黃曲霉在苗期侵害花生幼苗，提高出芽率，減少病苗。其中，用微生態(tài)黃曲霉抑菌劑拌種(花生作物)育苗工藝采用微生態(tài)黃曲霉抑菌制劑(固體粉劑)，每克含抑制黃曲霉生長繁殖的微生物數(shù)量lxl010cfo以上，先用清水將作物種子拌濕，撒上固體菌粉拌勻，現(xiàn)拌現(xiàn)播。采用微生態(tài)黃曲霉抑菌制劑(液體制劑)，每毫升含抑制黃曲霉生長繁殖的微生物數(shù)量lxl07cfo以上，用菌劑將作物種子拌濕，攪拌拌勻，現(xiàn)拌現(xiàn)播。用量是每畝的種子用黃曲霉抑菌劑0.5kg1.0kg。另外，使用微生態(tài)黃曲霉抑菌制劑，每畝可降低10%以上的用種量和10。％用肥量。該育苗工藝作用和特征是抑制黃曲霉在苗期侵害花生幼苗，提高出芽率10%15%，減少病苗。在另一個具體實施方案中，其中用微生態(tài)黃曲霉抑菌劑噴施花生花期的田間管理工藝；該花期田間管理工藝作用和特征是抑制黃曲霉在花期侵害花期生長繁殖，防止或減少黃曲霉侵入花蕾。其中，用微生態(tài)黃曲霉抑菌劑噴施花生花期的田間管理工藝花初期，每l公斤黃曲霉抑菌劑用500800清水混勻，噴施花蕾及頁面。盛花期每l公斤黃曲霉抑菌劑用300500倍清水混勻噴施花蕾及頁面；花謝期每1公斤黃曲霉抑菌劑用300500清水混勻噴施花蕾及頁面；每1公斤黃曲霉抑菌劑用300500清水混勻噴施花蕾及頁面，5天噴施1次微生態(tài)黃曲霉抑菌劑。該花期田間管理工藝作用和特征是抑制黃曲霉在花期侵害花期生長繁殖，防止或減少黃曲霉侵入花蕾，以及防止黃曲霉?fàn)柡笤诨ㄉ猩L繁殖并產(chǎn)生毒素?？梢允够ㄉ悬S曲霉毒素含量從原來的21^ig/kg以上已降低到5pg/kg以下，從而降低花生果實中黃曲霉毒素的含量。還在另一個具體實施方案中，其中用微生態(tài)黃曲霉抑菌劑噴霧收割后花生的貯存工藝，可防止黃曲霉在花生粒保藏過程中生長繁殖、產(chǎn)生毒素，從而降低果實中黃曲霉毒素的含量。其中，收果期，用微生態(tài)黃曲霉抑菌劑(固體制劑)拌勻生果，盡快干燥保藏。用量是每噸花生用黃曲霉抑菌劑2.5kg4.0kg。該收割期管理工藝作用和特征是抑制黃曲霉在收割后在花生中生長繁殖并產(chǎn)生毒素?？梢允够ㄉ悬S曲霉毒素含量從原來的21pg/kg以上己降低到6pg/kg以下，從而降低果實中黃曲霉毒素的含量。具體實施方案實施例h枯草芽孢桿菌的篩選從各地采集土壤樣品，采用不同的培養(yǎng)基進行篩選，篩選到多個菌株，逐一進行黃曲霉抑制實驗，得到黃曲霉抑制菌株，進行菌種簽定和毒理實驗。實施例2:枯草芽孢桿菌的生理生活特征及其保藏將篩選的菌株于2008年05月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo.2495。該菌株的生理學(xué)特征-細胞形態(tài)學(xué)非運動的，革蘭氏陽性，棒狀的多形性桿菌(1.14x0.38pm)。在生長周期中發(fā)生初級分枝，但不產(chǎn)生菌絲體。不存在明顯的桿狀-球狀生長周期。不產(chǎn)生內(nèi)生孢子。培養(yǎng)和生理學(xué)特征。嗜溫性的，在28"C和37'C下生長。耐熱性好，60。C加熱30分鐘后的仍然存活。嚴格需氧菌，過氧化氫酶陽性，氧化酶陰性。雖然也可以進行發(fā)酵代謝，但主要是呼吸代謝。從下列碳水化合物代謝產(chǎn)酸纖維二糖，果糖，半乳糖，D-葡萄糖，甘油，甘露糖，麥芽糖，D-核糖，蔗糖，海藻糖，和D-木糖，不能從下列碳水化合物代謝產(chǎn)酸阿拉伯糖，肌醇，乳糖，蜜二糖，D-棉子糖，鼠李糖，可溶性淀粉，D-山梨醇，L-山梨糖，或L-木糖。對明膠有微弱的水解液化作用，但不水解殼多糖，淀粉，酪蛋白，尿素，或纖維素。復(fù)合性營養(yǎng)，能在蛋白胨基本培養(yǎng)基中生長。生長還可能需要B-復(fù)合維生素和氨基酸。在蛋白胨基本培養(yǎng)基上，菌落直徑l-3mm,黃色，透明，隆起，并具有光滑的邊緣。菌落表面有閃光，呈粘液狀結(jié)構(gòu)。不產(chǎn)生擴散性色素。實施例3:微生態(tài)黃曲霉抑菌劑的制備(1)菌株的培養(yǎng)配制細菌斜面培養(yǎng)基，接種，放入37"C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，保存?zhèn)溆谩?2)制備抑菌劑，其中根據(jù)不同的應(yīng)用方面和不同劑型(液體制劑和固體粉劑)液體制劑參照細菌搖瓶培養(yǎng)基的配制，滅菌前分裝三角瓶(500mL瓶、裝100mL液)，常規(guī)滅菌，冷卻后在超凈工作臺上，用水洗法直接洗下斜面菌體接入發(fā)酵三角瓶中，搖瓶培養(yǎng)，37°C,200r/min，培養(yǎng)48h。馬上轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐發(fā)酵，參照細菌發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配制，滅菌，冷卻后接種與發(fā)酵，37。C，200r/min，培養(yǎng)48h中止發(fā)酵，馬上用罐裝塑料袋包裝發(fā)酵液。固體粉劑參照細菌搖瓶培養(yǎng)基的配制，滅菌前分裝三角瓶(500mL瓶、裝lOOmL液)，常規(guī)滅菌，冷卻后在超凈工作臺上，用水洗法直接洗下斜面菌體接入發(fā)酵三角瓶中，搖瓶培養(yǎng)，37。C，200r/min，培養(yǎng)48h。馬上轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐發(fā)酵，參照細菌發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配制，滅菌，冷卻后接種與發(fā)酵，37°C，200r/miri，培養(yǎng)48h中止發(fā)酵，離心發(fā)酵液，得到菌體，向其中加入草木炭吸附菌體，用罐裝塑料袋進行包裝。實施例4:微生態(tài)黃曲霉抑菌劑用于拌種的育苗工藝采用微生態(tài)黃曲霉抑菌制劑(液體制劑)，用菌劑將作物種子拌濕，攪拌拌勻，現(xiàn)拌現(xiàn)播。用量是每畝的種子用黃曲霉抑菌劑0.5kg1.0kg。使用后，使花生的出芽率提高10%以上，并使花生中黃曲霉毒素含量從原來的21pg/kg已降低到7pg/kg。實施例5:微生態(tài)黃曲霉抑菌劑噴施花生花期的田間管理工藝采用微生態(tài)黃曲霉抑菌制劑(液體制劑)，在花初期，每1公斤黃曲霉抑菌劑用500800清水混勻，噴施花蕾及頁面。盛花期每1公斤黃曲霉抑菌劑用300500倍清水混勻噴施花蕾及頁面；花謝期每1公斤黃曲霉抑菌劑用300500清水混勻噴施花蕾及頁面；每1公斤黃曲霉抑菌劑用300500清水混勻噴施花蕾及頁面，5天噴施1次微生態(tài)黃曲霉抑菌劑。使用后，使花生中黃曲霉毒素含量從原來的21pg/kg已降低到5pg/kg。實施例6:用微生態(tài)黃曲霉抑菌劑噴霧收割后花生的貯存工藝。收果期，用微生態(tài)黃曲霉抑菌劑(固體制劑)拌勻生果，盡快干燥保藏。用量是每噸花生用黃曲霉抑菌劑2.5kg4.0kg。使用后，使花生中黃曲霉毒素含量從原來的21嗎/kg已降低到6ng/kg。實施例7:用微生態(tài)黃曲霉抑菌劑處理花生的育苗期、花期和貯存工藝。用微生態(tài)黃曲霉抑菌劑對花生的育苗期、花期和貯存期都進行處理，使用后，使花生中黃曲霉毒素含量從原來的21pg/kg己降低到2pg/kg。參考文獻中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標(biāo)準化管理委員會.GBGB19641-2005，植物油料衛(wèi)生標(biāo)準[S].北京:中國標(biāo)準出版社，2005.12中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標(biāo)準化管理委員會.GB2716-2005，食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準[S].北京:中國標(biāo)準出版社，2005.12中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標(biāo)準化管理委員會.GB2761-2005，食品中真菌毒素限量[S].北京:中國標(biāo)準出版社，2005.12[4]中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標(biāo)準化管理委員會^8/丁5009.22-2003，食品中黃曲霉毒素B1的測定[S].北京:中國標(biāo)準出版社，2003.177187[5]中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標(biāo)準化管理委員會.GB/T5009.23-2003，食品中黃曲霉毒素B1、B2、Gl、G2的測定[S].北京中國標(biāo)準出版社，2003.189195萬書波，單世華，等.我國花生安全生產(chǎn)現(xiàn)狀與策略[J]，花生學(xué)報，2005，34(1):14.PassoneMA，ResnikSL，EtcheverryMG.Invitroeffectofphenolicantioxidantsongermination，growthandflatoxinB1accumulationbypeanutAspergillussectionFlavi[J].JournalofAppliedMicrobiology,2005，99(3):682-69權(quán)利要求1.一種具有抑制黃曲霉的枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)，所述菌株已于2008年5月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNO2495。2.—種包含權(quán)利要求l所述枯草芽孢桿菌的微生態(tài)黃曲霉抑菌劑。3.權(quán)利要求2所述的微生態(tài)黃曲霉抑菌劑，其中還包括該菌株所代謝的產(chǎn)物。4.權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌或權(quán)利要求2或3所述的抑菌劑在花生生產(chǎn)及其產(chǎn)品加工中用于抑制黃曲霉的用途。5.權(quán)利要求4所述的用途，其中用微生態(tài)黃曲霉抑菌劑(含液體制劑和固體粉齊U)適量清水稀釋拌種(現(xiàn)拌現(xiàn)播花生種子)育苗工藝，可抑制黃曲霉在苗期侵害花生幼苗，提高出芽率，減少病苗。6.權(quán)利要求4所述的用途，其中將微生態(tài)黃曲霉抑菌劑用于噴施花生花期的田間管理工藝；該花期田間管理工藝作用和特征是抑制黃曲霉在花期侵害花期生長繁殖，防止或減少黃曲霉侵入花蕾。7.權(quán)利要求4所述的用途，其中將微生態(tài)黃曲霉抑菌劑用于噴霧收割的花生作物的忙存工藝，可防止黃曲霉在花生粒保藏過程中生長繁殖、產(chǎn)生毒素，從而降低果實中黃曲霉毒素的含量。8.權(quán)利要求4所述的用途，其中在收果期，用黃曲霉抑菌劑拌勻花生鮮果，盡快干燥保藏，該收割期管理工藝作用和特征是抑制黃曲霉在收割苗期生長繁殖、產(chǎn)生毒素。從而降低果實中黃曲霉毒素的含量。全文摘要本發(fā)明針對現(xiàn)有防治黃曲霉危害作物對技術(shù)的不足，提供一整套防止黃曲霉在花生生長繁殖及貯存過程中的生產(chǎn)工藝技術(shù)，從而有效降低花生中黃曲霉毒素的含量，減少花生從田間播種到收獲、貯存以及加工各環(huán)節(jié)感染黃曲霉毒素的風(fēng)險。降低黃曲霉毒素在花生中的含量，提高食品安全性，促進花生進出口貿(mào)易。是一種抑制黃曲霉危害花生生產(chǎn)和貯藏的生產(chǎn)工藝技術(shù)。文檔編號C12N1/20GK101481664SQ20081013782公開日2009年7月15日申請日期2008年7月3日優(yōu)先權(quán)日2008年7月3日發(fā)明者林元山申請人:林元山