專利名稱：皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載體及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是指皮膚損傷創(chuàng)面修復(fù)過程中應(yīng)用 的低免疫原性皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒栽體及用途。
背景技術(shù)：
皮膚是覆蓋和保護體表的重要組織器官。由于各種原因造成的皮膚損傷 都需要進行及時的修復(fù)。對于這種缺損的修復(fù)常規(guī)多采用自體皮膚移植的方 法，但是這種方法不僅造成供皮區(qū)新的組織缺損，而且還經(jīng)常受到供皮區(qū)來 源的限制。
近年來利用組織工程技術(shù)制作組織工程皮膚已成為皮膚缺損移植治療 的熱點。組織工程皮膚一般是在體外將種子細胞接種到支架材料上，在體 外進行培養(yǎng)形成含有活細胞的皮膚樣結(jié)構(gòu)，然后用于臨床使用。所用的種 子細胞可來源于自體，也可來源于異體。自體細胞由于需要在體外經(jīng)過相 當(dāng)長時間的培養(yǎng)擴增，容易延誤治療時間，因此目前組織工程皮膚的種子 細胞一般來源于異體包皮環(huán)切術(shù)或手術(shù)中廢棄的皮膚分離出來的表皮細胞 和成纖維細胞。異體來源的種子細胞可以事先在體外進行大規(guī)模的擴增， 這樣就縮短了患者等待自體細胞擴增的時間，為組織工程皮膚的商品化提
供了重要的條件。但是異體來源的種子細胞也存在不足異體來源的種子細 胞始終存在免疫原性，移植到患者后不可避免的存在免疫排斥反應(yīng)，嚴重影 響使用效果。
皮膚移植的免疫排斥反應(yīng)是典型的細胞性排斥反應(yīng)，活化的T細胞在皮 膚移植排斥反應(yīng)中起著決定性作用。而近幾年的研究表明，T細胞必須在
7TCR/MHC識別及輔助刺激信號的共同作用下才能完全活化，起到排斥作用；而 阻斷輔助刺激信號，將會引起T細胞的無反應(yīng)或細胞凋亡(apoptosis),抑
制排斥作用的發(fā)生。迄今為止已發(fā)現(xiàn)多種輔助刺激信號系統(tǒng)，如 B7/CD28-CTLA4系統(tǒng)，CD40/CD40L系統(tǒng)，CD95 (Fas) /FasL系統(tǒng)等，而作為 皮膚組織工程的種子細胞-—人皮膚成纖維細胞中含有免疫抑制基因CTLA4Ig 和/或CD40Ig (包括利用病毒載體、非病毒載體、轉(zhuǎn)基因等各種細胞修飾技術(shù) 實現(xiàn)人皮膚成纖維細胞含有CTLA4Ig和/或CD40Ig基因，或者實現(xiàn)人皮膚成 纖維細胞表達CTLA4Ig和/或CD40Ig蛋白)，因此如何通過CTLA4Ig和CD40Ig 基因的表達來阻斷T細胞的活化信號通道，并抑制免疫排斥的發(fā)生是需要解 決的難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種低免疫原性皮趺組織工程種子細胞及其構(gòu)建方
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種低免疫原性皮膚組織工程種子細胞
的構(gòu)建方法，包括
培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞并構(gòu)建含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因腺病毒載體； 所述含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因腺病毒栽體體外轉(zhuǎn)染所述人皮膚成纖維細胞。
所述培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞具體為將人皮膚成纖維細胞采用酶消化法 將組織消化散開，制備成單個細胞懸液，按5xl()3個/厘米2細胞密度接種于 培養(yǎng)瓶中，置于溫度為37°C、含有體積百分比為5%(:02細胞培養(yǎng)箱中以含有 重量百分比為10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，當(dāng)細胞生長至80 %融合時進行傳代、擴增。
所述構(gòu)建含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因腺病毒載體具體為
構(gòu)建CTLA4Ig融合蛋白表達栽體；構(gòu)建CD40Ig融合蛋白表達載體；
構(gòu)建CTLA4Ig和CD40Ig雙基因克隆載體；
構(gòu)建pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒；
構(gòu)建含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病毒載體。
所述構(gòu)建CTLA4Ig融合蛋白表達載體具體為
分離、活化人外周血單個核細胞；
提取、鑒定所述人外周血單個核細胞的RNA;
設(shè)計引物，第一引物包括CTLA-4基因胞外區(qū)N末端7個氨基酸殘基和抑 瘤素M信號肽C端15個氨基酸殘基，第二引物對應(yīng)CTLA-4基因119-125位 氨基酸殘基，并引入BclI酶切位點，第三引物包括抑瘤素M信號肽其余氨基 酸殘基并與第一引物的抑瘤素M信號肽部分重疊，在第三引物的5，端引入Hind
m酶切位點；
反轉(zhuǎn)錄所述人外周血單個核細胞的RNA合成CTLA-4基因胞外區(qū)cDNA第 一鏈，以CTLA-4基因胞外區(qū)cDNA第一鏈為模板，采用第一引物和第二引物 進行第一輪擴增，以第一輪擴增的反應(yīng)產(chǎn)物為模板，采用第二引物和第三引 物進行第二輪擴增，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物；
構(gòu)建pUC19-CTLA4融合質(zhì)粒；
用HindIII和Bcll雙酶切所述pUC19-CTLA4融合質(zhì)4立后，與經(jīng)HindIII和 Bcll雙酶切pX/Ig載體片段混合并連接，用連接后的產(chǎn)物再轉(zhuǎn)化MC1061感受 態(tài)菌，得到含有質(zhì)粒pUC19的CTLA4Ig融合蛋白表達栽體，用HindIII和XbaI 酶切鑒定陽性轉(zhuǎn)化克隆插入的片段長度；
測定所述陽性轉(zhuǎn)化克隆插入的片段的序列。
所述構(gòu)建CD40Ig融合蛋白表達載體具體為
分離、活化人外周血單個核細胞；
提取所述人外周血單個核細胞的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為CD40基因胞外區(qū)cDNA; 用特異性引物擴增所述CD40基因胞外區(qū)cDNA，將擴增產(chǎn)物克隆到T載體上；所述特異性引物為第四引物5 ， -CGTCCTCGAGCCACCATGGTTCGTCTGCCTC-3 ， ，第五引物 5 ， -GCGATGATCAGATCTCAGCCGATCCTGGG-3，；
用HindIII和Bcll雙酶切pX/Ig栽體，將回收的Ig基因的序列與克隆到 T載體上的CD40基因的序列連接，得到CD40Ig融合蛋白表達載體。
所述構(gòu)建CTLA4Ig和CD40Ig雙基因克隆載體具體為-.
設(shè)計重疊延伸的擴增引物，使得所述重疊延伸的擴增引物去除CTLA4Ig 基因中末尾的非編碼區(qū)，保留CD40Ig基因中末尾的非編碼區(qū)；所述重疊延伸 的擴增引物為第六引物5， -ATATGGCCACAACCATGGTTCGTCTGCCT-3，，第七 引物5， -AGGCTCTAGAAGCATCCTCGTG-3';
用所述重疊延伸的擴增引物擴增所述含有質(zhì)粒pUC19的CTLA4Ig融合蛋 白表達載體中的CTLA4Ig基因和IRES2序列，將產(chǎn)物CTLA4Ig-IRES2序列回 收純化；
用所述重疊延伸的擴增引物擴增所述CTLA4Ig-IRES2和所述CD40Ig融合 蛋白表達載體中的CD40-Ig基因，將擴增產(chǎn)物克隆入T栽體，得到 CTLA4Ig-CD40Ig雙基因克隆載體。
所述構(gòu)建pDC 316-CTLA41 g-CD4 01 g質(zhì)粒具體為
用HindIII和BamHI雙酶切載體質(zhì)粒pcDNA3，回收所述栽體質(zhì)粒pcDNA3 的酶切產(chǎn)物；
用HindIII和BamHI雙酶切所述CTLA4Ig-CD40Ig雙基因克隆栽體中的目的 基因CTLA4Ig-CD40Ig,回收所述目的基因CTLA4Ig-CD40Ig的酶切產(chǎn)物；
連接所述載體質(zhì)粒pcDNA3的酶切產(chǎn)物和所述目的基因CTLA4Ig-CD40Ig 的酶切產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化，挑取單克隆培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)化后的pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig
質(zhì)粒；
用Hindffl和Xhol雙酶切pcDM3-CTU4Ig-CD40Ig質(zhì)粒，回收所述 pcDM3-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物；用HindIII和Sail雙酶切載體質(zhì)粒pDC316,回收所述載體質(zhì)粒pDC316的 酶切產(chǎn)物；
連接所述pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物和所述栽體質(zhì)粒 pDC316的酶切產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化，挑取單克隆培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)化后的 pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒；
用EcoRI單酶切pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒進行鑒定。
所述構(gòu)建含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病毒載體具體為
轉(zhuǎn)染前一天，將293細胞按5xl()5個/孔細胞密度接種于六孔板中，置于 溫度為37°C、含有體積百分比為5%0)2的培養(yǎng)箱中以含有重量百分比為10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜；
轉(zhuǎn)染當(dāng)天換液，用新鮮的含有重量百分比為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基 繼續(xù)培養(yǎng)；當(dāng)293細胞生長至孔底面積的80 - 90%時，取嵌合腺病毒Ad5F35 和所述pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒，用脂質(zhì)體進行轉(zhuǎn)染；
轉(zhuǎn)染后第二天，將長滿的細胞于細胞培養(yǎng)瓶中進行傳代，觀察細胞出毒 現(xiàn)象，當(dāng)70 - 80%細胞出毒并脫落時進行收毒；所述出毒現(xiàn)象為細胞變大、 變圓，呈葡萄狀，出現(xiàn)明顯噬斑；
將出毒的細胞培養(yǎng)瓶凍融三次，將凍融液離心，收集上清液，得到含有 CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病毒載體的第一代毒種；
在細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)293細胞，當(dāng)293細胞生長至瓶底面積的90%時， 取所述第一代毒種接種于所述293細胞上；當(dāng)接種后的293細胞完全出毒時， 凍融三次，將凍融液離心，收集上清液，得到含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因 Ad5F35腺病毒載體的第二代毒種；
用Western Blotting方法鑒定CTLA4Ig基因和CD40Ig基因的表達。
所述含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因腺病毒載體體外轉(zhuǎn)染所述人皮膚成纖維 細胞具體為取所述人皮膚成纖維細胞，用DMEM細胞培養(yǎng)液洗滌，按感染復(fù) 數(shù)為50的劑量加入為病毒液轉(zhuǎn)染液，置于溫度為37°C、含有體積百分比為5%(:02的細胞培養(yǎng)箱中孵育2小時，再加入含有重量百分比為10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種采用所述低免疫原性皮膚組織工 程種子細胞的構(gòu)建方法構(gòu)建的低免疫原性皮膚組織工程種子細胞。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種用于轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細胞的腺
基因的Ad5F35嵌合型腺病毒載體。在上述技術(shù)方案中，所述CTLA4Ig重組基 因中的CTLA4是全長的CTLA4或CTLA4片段，重組基因可以不含有Ig片段， 優(yōu)選為含有Ig片段的CTLA4Ig重組基因；所述CD40Ig重組基因中的CD40是 全長的CD40或CD40片段，重組基因可以不含有Ig片段，優(yōu)選為含有Ig片 ,殳的CD40重組基因；所述啟動子包括CMV、 CAG、 SV40或K14;
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種釆用所述的腺病毒栽體在制備修 復(fù)損傷皮膚的轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細胞中的用途。
本發(fā)明提供了 一種低免疫原性皮膚組織工程種子細胞及其構(gòu)建方法，具 有以下優(yōu)點本發(fā)明使用的含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病毒載體 在體外可對人皮膚成纖維細胞進行有效轉(zhuǎn)染，得到低免疫原性皮膚組織工程 種子細胞；本發(fā)明低免疫原性皮膚組織工程種子細胞的構(gòu)建方法能有效降低 種子細胞的免疫原性，實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后的成纖維細胞與未處理的成纖 維細胞相比，其免疫原性下降了 31. 67 ±2. 25%;且轉(zhuǎn)染后的人皮膚成纖維細 胞不影響其體外增殖性能，因此，該方法可有效的用于低免疫原性組織工程 皮膚的種子細胞。
下面通過附圖和實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的詳細描述。


圖1為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載體及用途中 低免疫原性皮膚組織工程種子細胞的構(gòu)建方法實施例的流程圖；圖2為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載體及用途中方 法實施例步驟1中構(gòu)建含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因腺病毒載體流程圖3為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載體及用途中 構(gòu)建CTLA4Ig融合蛋白表達載體流程圖4為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒栽體及用途中 構(gòu)建CD40Ig融合蛋白表達栽體流程圖5為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒栽體及用途中 構(gòu)建CTLA4Ig和CD40Ig雙基因克隆載體流程圖6為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載體及用途中 構(gòu)建pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒流程圖7為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載體及用途中構(gòu) 建含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病毒載體^^呈圖8為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載體及用途中 pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒經(jīng)HindiII和Xhol雙酶切鑒定圖，其中，DNA 分子量標準(M)從小到大依次為250bp、 1000bp、 2500bp、 5000bp、 7500bp、 l畫Obp、 15000bp; 1: HindIII和Xhol雙酶切pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒;
圖9為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載體及用途中 pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒經(jīng)EcoRI單酶切鑒定圖，其中，DNA分子量標準 (M)從小到大依次為:250bp、 1000bp、 2500bp、 5000bp、 7500bp、 10000bp、 15000bp; 1: EcoRI單酶切pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒;
圖10為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載體及用途中 含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病毒載體感染293細胞出毒照片；
圖11為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載體及用途 中含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病毒載體模式圖，其中CMV為啟動子，啟動子之后依次是CTLA4Ig重組基因、IRES2序列和CD40Ig重組基因； 圖12A為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載體及用途中
正常人皮膚成纖維細胞圖片；
圖12B為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載體及用途
中被含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病毒載體轉(zhuǎn)染后的人皮膚成纖維圖片。
具體實施例方式
方法實施例
圖1為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載體及用途中 低免疫原性皮膚組織工程種子細胞的構(gòu)建方法實施例的流程圖，具體為
步驟1、培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞并構(gòu)建含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因腺病 毒載體；
步驟2、含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因腺病毒載體體外轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維 細胞。
本發(fā)明步驟1中的培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞和構(gòu)建含有CTLA4Ig-CD40Ig雙 基因腺病毒載體在操作上無先后順序，既可以先培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞，也 可以先構(gòu)建含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因腺病毒載體，目的都是為本發(fā)明步驟 2提供人皮膚成纖維細胞和含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因腺病毒載體，以構(gòu)建 含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因腺病毒載體體外轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細胞。
圖2為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載體及用途中 方法實施例步驟1中構(gòu)建含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因腺病毒載體流程圖，在 圖l所示技術(shù)方案中，步驟l具體為
步驟ll、構(gòu)建CTLA4Ig融合蛋白表達載體；
步驟12、構(gòu)建CD40Ig融合蛋白表達栽體；
步驟13、構(gòu)建CTLA4Ig和CD40Ig雙基因克隆載體；
14步驟14、構(gòu)建pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒；
步驟15、構(gòu)建含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病毒栽體。
圖3為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載體及用途中
構(gòu)建CTLA4Ig融合蛋白表達載體流程圖，在圖2所示技術(shù)方案中，步驟ll具
體為
步驟lll、分離、活化人外周血單個核細胞； 步驟112、提取、鑒定人外周血單個核細胞的RNA;
步驟113、設(shè)計引物，第一引物包括CTLA-4基因胞外區(qū)N末端7個氨基 酸殘基和抑瘤素M信號肽C端15個氨基酸殘基，第二引物對應(yīng)CTLA-4基因 119-125位氨基酸殘基，并引入BclI酶切位點，第三引物包括抑瘤素M信號 肽其余M酸殘基并與第一引物的抑瘤素M信號肽部分重疊，在第三引物的5， 端引入HindIII酶切位點；
步驟114、反轉(zhuǎn)錄人外周血單個核細胞的RM合成CTLA-4基因胞外區(qū)cDM 第一鏈，以CTLA-4基因胞外區(qū)cDNA第一鏈為模板，采用第一引物和第二引 物進行第一輪擴增，以第一輪擴增的反應(yīng)產(chǎn)物為模板，采用第二引物和第三 引物進行第二輪擴增，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物；
步驟115、構(gòu)建pUC19-CTLA4融合質(zhì)粒；
步驟116、用HindIII和BclI雙酶切所述pUC19-CTLA4融合質(zhì)粒后，與經(jīng) HindIII和Bcll雙酶切pX/Ig載體片段混合并連接，用連接后的產(chǎn)物再轉(zhuǎn)化 MC1061感受態(tài)菌，得到含有質(zhì)粒pUC19的CTLA4Ig融合蛋白表達載體，用Hind m和Xbal酶切鑒定陽性轉(zhuǎn)化克隆插入的片段長度；
步驟117、測定陽性轉(zhuǎn)化克隆插入的片段的序列。
圖4為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載體及用途中 構(gòu)建CD40Ig融合蛋白表達載體流程圖，在圖2所示技術(shù)方案中，步驟12具 體為
步驟121、分離、活化人外周血單個核細胞；步驟122、提取人外周血單個核細胞的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為CD40基因胞外 區(qū)cDNA;
步驟123、用特異性引物擴增CD40基因胞外區(qū)cDNA，將擴增產(chǎn)物克隆到 T載體上；特異性引物為第四引物5 ， _ CGTCCTCGAGCCACCATGGTTCGTCTGCCTC-3 ， ， 第五引物 5 ， -GCGATGATCAGATCTCAGCCGATCCTGGG-3";
步驟124、用HindIII和Bcll雙酶切pX/Ig載體，將回收的Ig基因的序 列與克隆到T載體上的CD40基因的序列連接，得到CD40Ig融合蛋白表達載體。
圖5為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒栽體及用途中 構(gòu)建CTLA4Ig和CD40Ig雙基因克隆載體流程圖，在圖2所示技術(shù)方案中，步 驟13具體為
步驟131、設(shè)計重疊延伸的擴增引物，使得重疊延伸的擴增引物去除 CTLA4Ig基因中末尾的非編碼區(qū)，保留CD40Ig基因中末尾的非編碼區(qū)；重疊 延伸的擴增引物為第六引物5， -ATATGGCCACAACCATGGTTCGTCTGCCT-3，， 第七引物5， -AGGCTCTAGAAGCATCCTCGTG-3，；
步驟132、用重疊延伸的擴增引物擴增含有質(zhì)粒pUC19的CTLA4Ig融合蛋 白表達載體中的CTLA4Ig基因和IRES2序列，將產(chǎn)物CTLA4Ig-IRES2序列回 收純化；
步驟133、用重疊延伸的擴增引物擴增CTLA4Ig-IRES2和CD40Ig融合蛋 白表達載體中的CD40-Ig基因，將擴增產(chǎn)物克隆入T載體，得到 CTLA4Ig-CD40Ig雙基因克隆載體。
圖6為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載體及用途中 構(gòu)建pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒流程圖，在圖2所示技術(shù)方案中，步驟14 具體為
步驟141、用HindIII和BamHI雙酶切載體質(zhì)粒pcDNA3，回收載體質(zhì)粒 pcDNA3的酶切產(chǎn)物；步驟142、用HindIII和BamHI雙酶切CTLA4Ig-CD40Ig雙基因克隆栽體中 的目的基因CTLA4Ig-CD40Ig，回收目的基因CTLA4Ig-CD40Ig的酶切產(chǎn)物；
步驟143、連接載體質(zhì)粒pcDNA3的酶切產(chǎn)物和目的基因CTLA4Ig-CD40Ig 的酶切產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化，4兆取單克隆培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)化后的pcDM3-CTLA4Ig-CD40Ig
質(zhì)粒；
步驟144、用HindIII和XhoI雙酶切pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒，回收 pcDNA3-CTLA41 g-CD401g質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物；
圖8為本發(fā)明皮趺組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒栽體及用途中 pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒經(jīng)HindIII和Xhol雙酶切鑒定圖，其中，DNA 分子量標準(M)從小到大依次為250bp、 1000bp、 2500bp、 5000bp、 7500bp、 10000bp、 15000bp; 1: HindIII和Xhol雙酶切pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒。 pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒經(jīng)HindIII和Xhol雙酶切預(yù)期能產(chǎn)生大小分別 5.4kb和3. lkb兩條帶，而電泳結(jié)果與預(yù)期相符，該質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確；
步驟145、用Hindffl和SalI雙酶切載體質(zhì)粒pDC316，回收栽體質(zhì)粒pDC316 的酶切產(chǎn)物；
步驟146、連接pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物和載體質(zhì)粒 pDC316的酶切產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化，挑取單克隆培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)化后的 pDC316-CTLA41 g-CD401g質(zhì)粒；
步驟147、用EcoRI單酶切pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒進行鑒定；
圖9皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載體及用途中為本發(fā)明 pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒經(jīng)EcoRI單酶切鑒定圖，pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig 質(zhì)粒經(jīng)EcoRI單酶切鑒定，正確則可切出約3. lkb的一條帶和3, 9kb的pDC316 載體片段，實驗結(jié)果與預(yù)期相符，該質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確。
圖7為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒栽體及用途中構(gòu) 建含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病毒載體it^呈圖，在圖2所示技術(shù)方案 中，步驟15具體為步驟151、轉(zhuǎn)染前一天，將293細胞按5xl(^個/孔細胞密度接種于六孔 板中，置于溫度為3"C、含有體積百分比為5%0)2的培養(yǎng)箱中以含有重量百 分比為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜；
步驟152、轉(zhuǎn)染當(dāng)天換液，用新鮮的含有重量百分比為10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；當(dāng)293細胞生長至孔底面積的80 - 90%時，取嵌合腺 病毒Ad5F35和pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒，用脂質(zhì)體進行轉(zhuǎn)染；
步驟153、轉(zhuǎn)染后第二天，將長滿的細胞于細胞培養(yǎng)瓶中進行傳代，觀察 細胞出毒現(xiàn)象，當(dāng)70 - 80%細胞出毒并脫落時進行收毒；出毒現(xiàn)象為細胞變 大、變圓，呈葡萄狀，出現(xiàn)明顯噬斑；圖IO為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞 及構(gòu)建方法、腺病毒載體及用途中含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病 毒栽體感染293細胞出毒照片；
步驟154、將出毒的細胞培養(yǎng)瓶凍融三次，將凍融液離心，收集上清液， 得到含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病毒栽體的第一代毒種；
步驟155、在細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)293細胞，當(dāng)293細胞生長至瓶底面積的 90%時，取第一代毒種接種于293細胞上；當(dāng)接種后的293細胞完全出毒時， 凍融三次，將凍融液離心，收集上清液，得到含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因 Ad5F35腺病毒載體的第二代毒種；圖11為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞及 構(gòu)建方法、腺病毒栽體及用途中含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病毒 載體模式圖，其中CMV為啟動子，啟動子之后依次是CTLA4Ig重組基因、 IRES2序列和CD40Ig重組基因；
步驟156、用Western Blotting方法鑒定CTLA4Ig基因和CD40Ig基因的 表達。
下面通過具體實施例進一 步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。 第一實施例
步驟1001、將取自包皮環(huán)切術(shù)的人皮膚移入超凈操作臺，用雙抗PBS(含
18有l(wèi)QGu/ml青霉素和lQGu/ml鏈霉素；pH為7. 2 )溶液漂洗5次，在培養(yǎng)亞 中修剪皮下筋膜細胞及多余的皮下脂肪，將修剪后的人皮膚標本剪成0.3cm x 2cm皮條，然后放入濃度為2. 5g/L的Dispase II酶中浸沒，于溫度4。C下消 化12小時。將DispaseII酶消化后的人皮膚標本揭除表皮，用眼科剪將分離 的真皮剪成糊狀后，加入濃度為200U/ml膠原酶于溫度37。C的孵箱內(nèi)消化1 小時，將組織基本消化散開，以看不到組織塊為度，制備成單個細胞懸液。將 消化物轉(zhuǎn)移至10ml離心管中，用PBS在1500轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速下離心洗滌5次，每 次離心5分鐘，以除去膠原酶，隨后將收集的細胞加入到含有重量百分比為 10%胎牛血清(FBS)的DMEM細胞培養(yǎng)液中重懸，按5 x 103個/厘米2細胞密 度接種于75ci^培養(yǎng)瓶中，再添加10ml含有重量百分比為10。/。胎牛血清(FBS) 的DMEM細胞培養(yǎng)液后置于溫度為37。C、含有體積百分比為5%0)2細胞培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)，每3日換1次細胞培養(yǎng)液；當(dāng)細胞生長至80%融合時，按常規(guī)細胞 培養(yǎng)方法進行傳代、擴增培養(yǎng)。
步驟1002、常規(guī)分離健康人外周血單個核細胞(PBMC)，用RPMI16"調(diào) 節(jié)細胞密度為1 x 106個/毫升，再加入濃度為15nM的PMA和濃度為10微克/ 毫升的抗CD3單抗，置于溫度為37°C、含有體積百分比為5%0)2細胞培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)6小時，使細胞活化，高表達CTLA-4 mRNA;
步驟1003、離心收集活化后的外周血單個核細胞(PBMC)，用PBS(DEPC) 漂洗細胞2次，按每1 x 107個外周血單個核細胞(PBMC)加入1毫升Tripure 的比例混勻，RT 5分鐘后加入0. 2毫升氯仿，劇烈震蕩15秒，再RT 5分鐘 后于10000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，將上層無色水相移至另一離心管，加 入O. 5毫升異丙醇，混勻，于溫度-2(TC下放置10分鐘，再于10000轉(zhuǎn)/分 轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，加入1毫升質(zhì)量分數(shù)為75%乙醇洗滌沉淀，待沉淀干燥 后加入200微升DEPC水溶解，于溫度-20。C下保存；
用質(zhì)量分數(shù)為1. 5%曱醛變性瓊脂糖凝膠到板制膠，凝固后置于1 x MOPS 電泳液中，將5微升RNA樣品和15微升栽樣緩沖液于溫度為95。C水浴中變性2分鐘，再于電壓50V下電泳，紫外檢測RNA完整性；
將RNA樣品稀釋后再紫外分光光度儀上測0. D. 26。和0. D. 28。值，RNA濃度
(微克/毫升)=0.D. 26。X40X稀釋倍數(shù)；
步驟1004、通過計算機輔助分析，根據(jù)基因庫中人CTLA-4基因序列，設(shè) 計如下三條引物，第一引物包括CTLA-4基因胞外區(qū)N末端7個氨基酸殘基和 抑瘤素M信號肽C端15個氨基酸殘基，第二引物對應(yīng)CTLA-4基因119-125 位氨基酸殘基，并引入BclI酶切位點，第三引物包括抑瘤素M信號肽其余氨 基酸殘基并與第一引物的抑瘤素M信號肽部分重疊，在第三引物的5'端引入 HindIII酶切位點；以上三條引物由中科院上海細胞所合成，PAGE純化；第一 引物的序列如SEQ IDN0:5，第二引物的序列如SEQ ID NO: 6，第三引物的 序列如SEQ ID NO: 7;
第一引物CTCAGTCTGGTCCTTGACCTCCTGTTTCCAAGCATGGCGA GCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC
第二引物TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTC
----Bell
第三引物GCAAGCTTCAATGGGTTGACTGCTCACACAGAGGACGCTG ——HindIII CTCAGTTCGGTCCTTGCATCT 步驟1005、將IO微升提取的RNA、 2微升0ligo(dTt2)和11. 5微升ddH20 (DEPC)混勻后于溫度65。C下水浴變性10分鐘，然后迅速置于冰上，再加入 8微升5 x逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、2微升濃度為lOOmM DTT、 0. 5微升RNasin、 4微升 濃度為2mM dNTP和2微升AMV (總體積共40微升)，于溫度42。C下放置1 小時，得到CTLA-4基因胞外區(qū)cDNA第一鏈，于溫度-20。C保存；
先以cDNA第一鏈為模板，采用第一引物和第二引物進行第一輪擴增，條 件為:將5微升cDNA第一鏈、5微升10 x PCR緩沖液、4微升濃度為腦dNTP、 終濃度為lOOnM第一引物和第二引物各3微升、29. 5微升ddH20混勻后于溫度95。C下變性7分鐘，再加入0. 5微升Taq酶(總體積共50微升)，循環(huán)條 件為94°C l分鐘，55°C 1分鐘，72°C 1分鐘，30個循環(huán)后72。C 7分鐘； 隨后以第一輪擴增的反應(yīng)產(chǎn)物為模板，采用第二引物和第三引物進行第二輪 擴增，反應(yīng)條件同前，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物；
步驟1006 、按試劑盒說明書(TAKARA， JAPANESE )操作來構(gòu)建 pUC19-CTLA4融合質(zhì)粒；參照《分子克隆》(金冬雁，黎孟楓譯，《分子克 隆實驗指南》，第二版北京科學(xué)出版社1996; P852 -,。7) CaCh制備大腸 桿菌感受態(tài)，加入終濃度為10-15%甘油，于溫度-70。C凍存；取凍存大 腸桿菌感受態(tài)細菌，加入l微升質(zhì)粒，輕輕混勻后，冰浴30分鐘，再于溫 度42。C下水浴2分鐘，加入900微升LB培養(yǎng)基，于溫度37。C下水浴60 分鐘，取適量涂布于含有濃度為100微克/毫升氨千青霉素的LB瓊脂板上， 于溫度37。C孵箱培養(yǎng)過夜；按DNA片段回收試劑盒說明書操作回收DNA片 段；將第二輪擴增的反應(yīng)產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，回收所需片段；
步驟1007、用HindIII和BclI雙酶切pUC19-CTLA4融合質(zhì)粒后，與經(jīng)Hind III和Bell雙酶切pX/Ig載體片段按3: 1的比例混合，根據(jù)DNA快速連接試 劑盒說明連接，用連接后的產(chǎn)物再轉(zhuǎn)化MC1061 (ATCC，USA)感受態(tài)菌，得到 含有質(zhì)粒pUC19的CTLA4Ig融合蛋白表達栽體，用HindIII和Xbal酶切鑒定陽 性轉(zhuǎn)化克隆插入的片段長度；
步驟1008、酶切鑒定插入片段長度正確的重組質(zhì)粒，經(jīng)HindIII和Xbal 雙酶切后定向插入pUC19質(zhì)粒(TAKARA， JAPANESE )中，采用Sanger雙脫氧 測序法，以質(zhì)粒雙鏈DNA為模版，在pUC19通用引物引導(dǎo)下，ABI Prism377 全自動測序儀自動測定插入片段的序列；其中CTLA4Ig重組基因表達系列如 SEQ ID NO: 1所示；
步驟1009、從人的外周血中分離單個核細胞；
步驟IOIO、提取人的外周血單個核細胞的RNA,并反轉(zhuǎn)錄為CD40基因胞 外區(qū)cDNA;步驟IOII、用特異性引物擴增CD40基因胞外區(qū)cDNA，并將擴增產(chǎn)物克 隆到T載體上；第四引物的序列如SEQ ID NO: 8，第五引物的序列如SEQ ID NO: 9;
第四引物5， - CGTCCTCGAGCCACCATGGTTCGTCTGCCTC-3， 第五引物5, -GCGATGATCAGATCTCAGCCGATCCTGGG-3， 步驟1012、用HindIII和BclI雙酶切pX/Ig栽體，并將回收的Ig基因的 序列與克隆到T載體上的CD40基因的序列連接，得到CD40Ig融合蛋白表達 載體；其中，CD40Ig重組基因的表達序列如SEQ ID N0:2所示；
步驟1013、設(shè)計重疊延伸的擴增引物，使得重疊延伸的擴增引物去除 CTLA4Ig基因中末尾的非編碼區(qū)，保留CD40Ig基因中末尾的非編碼區(qū)；第六 引物的序列如SEQ ID NO: 10，第七引物的序列如SEQ ID NO: 11; 第六引物:5， -ATATGGCCACAACCATGGTTCGTCTGCCT-3' 第七引物5， -AGGCTCTAGAAGCATCCTCGTG-3'
步驟1014、用重疊延伸的擴增引物擴增含有質(zhì)粒pUC19的CTLA4Ig融合 蛋白表達載體中的CTLA4Ig基因和IRES2序列，將產(chǎn)物CTLA4Ig-IRES2序列 回收純化；CTLA4Ig重組基因如SEQ ID NO: 1所示，IRES2序列如SEQ ID NO: 3 所示；
步驟1015、用重疊延伸的擴增引物擴增CTLA4Ig-IRES2和CD40Ig融合蛋 白表達載體中的CD40-Ig基因，將擴增產(chǎn)物克隆入T載體，得到 CTLA4Ig-IRES2-CD40Ig基因，其序列如SEQ ID NO: 4所示，由于IRES2是 一段連接序列，為便于表述，以下的CTLA4Ig-IRES2-CD40Ig都表述為 CTLA4Ig-CD40Ig,即為CTLA4Ig-CD40Ig雙基因克隆載體；
步驟1016、用HindIII和BamHI( TAKARA， JAPANESE )雙酶切栽體質(zhì)粒pcDNA3 (invitrogen, USA)，回收載體質(zhì)粒pcDNA3的酶切產(chǎn)物；
步驟1017、用HindIII和BamHI雙酶切CTLA4Ig-CD40Ig雙基因克隆載體 中的目的基因CTLA4Ig-CD40Ig，回收目的基因CTLA4Ig-CD40Ig的酶切產(chǎn)物；
22步驟1018 、連接栽體質(zhì)粒pcDM 3的酶切產(chǎn)物和目的基因CTLA41 g-CD4 01 g 的酶切產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化，挑取單克隆培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)化后的pcDM3-CTLA4Ig-CD40Ig 質(zhì)粒；
步驟1019、用 Hind III和Xhol ( TAKARA， JAPANESE )雙酶切 pcDNA3-CTLA41g-CD401g質(zhì)粒，回收pcDNA3-CTLA41g-CD401g質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物；
步驟1020、用HindIII和Sail ( TAKARA， JAPANESE )雙酶切栽體質(zhì)粒 pDC316(Miscrobix biosystems， Inc)，回收載體質(zhì)粒pDC316的酶切產(chǎn)物；
步驟1021、連接pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物和栽體質(zhì)粒 pDC316的酶切產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化，挑取單克隆培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)化后的 pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒；
步驟1022、用EcoRI單酶切pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒進行鑒定；
步驟1023、轉(zhuǎn)染前一天，將293細胞按5 x 105個/孔細胞密度接種于六孔 板中，置于溫度為37°C、含有體積百分比為5%(]02的培養(yǎng)箱中以含有重量百 分比為10 % Hyclone胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜；
步驟1024、轉(zhuǎn)染當(dāng)天換液，用新鮮的含有重量百分比為10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；當(dāng)293細胞生長至孔底面積的80%時，取嵌合腺病毒 Ad5F35和pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒，用Lipofectamine2000脂質(zhì)體按其 所附說明書進行轉(zhuǎn)染。具體步驟為
1)每個轉(zhuǎn)染孔取骨架質(zhì)粒4jag，穿梭質(zhì)粒ljag,混和均勻；
2 )質(zhì)粒用300 |i 1的DMEM培養(yǎng)液進行稀釋，室溫放置5min;
3) 取10jLil的脂質(zhì)體用300 |il的DMEM培養(yǎng)液進行稀釋，室溫放置5min;
4) 將兩者混和，室溫避光放置30min;然后將混合物加入到細胞中； 步驟1025、轉(zhuǎn)染后第二天，將長滿的細胞傳代于25cii^細胞培養(yǎng)瓶中，用
含有重量百分比為5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細胞生長 情況，當(dāng)細胞長滿瓶底時，再傳入75 cm'細胞培養(yǎng)瓶中，每天觀察細胞出毒 現(xiàn)象；出毒現(xiàn)象為細胞變大、變圓，呈葡萄狀，并開始出現(xiàn)明顯噬斑；當(dāng)70%細胞出毒并從底部脫落時進行收毒；
步驟1026、將出毒的細胞培養(yǎng)瓶先置于溫度為-70。C水箱，再置于溫度 37。C水浴鍋中，如此凍融三次，使病毒從出毒細胞中充分釋放；將凍融液于 3000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，收集含病毒的上清液，棄沉淀，該上清液即為 含有CTLAHg-CDMIg雙基因Ad5F35腺病毒載體的第一代毒種，作為隨后大 量病毒擴增的毒種；
步驟1027、在25cii^細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)293細胞，當(dāng)293細胞生長至瓶底 面積的90%時，取500微升上述第一代毒種接種于293細胞上；當(dāng)接種后的 "3細胞完全出毒時，按上述凍融方法凍融細胞三次，將凍融液離心收集病毒 上清液，即為含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病毒栽體的第二代毒種；
步驟102S、用Western Blotting方法鑒定CTLA4Ig基因和CD40Ig基因 的表達；
步驟1029、取生長至80%融合、生長狀態(tài)良好、增殖活躍的人皮膚成纖 維細胞，用DMEM細胞培養(yǎng)液輕輕洗滌細胞2次，按感染復(fù)數(shù)(MOI)為50的劑 量加入為病毒液轉(zhuǎn)染液，使其完全覆蓋細胞培養(yǎng)面積，然后置于溫度為37°C、 含有體積百分比為5%0)2的細胞培養(yǎng)箱中孵育2小時，再加入含有重量百分 比為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時；如圖所示圖12A為本發(fā) 明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載體及用途中正常人皮膚成纖 維細胞圖片和圖12B為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載 體及用途中被含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病毒栽體轉(zhuǎn)染后的人皮 膚成纖維圖片。
一種采用上述低免疫原性皮膚組織工程種子細胞的構(gòu)建方法構(gòu)建的低免 疫原性皮膚組織工程種子細胞。
一種用于轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細胞的腺病毒載體，腺病毒栽體是含有與啟 動子有效連接的CTLA4Ig基因和CD40Ig基因的Ad5F35嵌合型腺病毒載體。
一種采用上述腺病毒載體在制備修復(fù)損傷皮膚的轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細胞中的用途。
第二實施例
步驟2001、將取自包皮環(huán)切術(shù)的人皮膚移入超凈操作臺，用雙抗PBS(含 有100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；pH為7. 2 )溶液漂洗5次，在培養(yǎng)皿 中修剪皮下筋膜細胞及多余的皮下脂肪，將修剪后的人皮膚標本剪成0.3cm x^m皮條，然后放入濃度為2. 5g/L的DispaseII酶中浸沒，于溫度4。C下消 化14小時。將DispaseII酶消化后的人皮膚標本揭除表皮，用眼科剪將分離 的真皮剪成糊狀后，加入濃度為200U/ml膠原酶于溫度37'C的孵箱內(nèi)消化2 小時，將組織基本消化散開，以看不到組織塊為度，制備成單個細胞懸液。將 消化物轉(zhuǎn)移至10ml離心管中，用PBS在1500轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速下離心洗滌5次，每 次離心5分鐘，以除去膠原酶，隨后將收集的細胞加入到含有重量百分比為 10%胎牛血清(FBS)的DMEM細胞培養(yǎng)液中重懸，按5 x 103個/厘米2細胞密 度接種于75cn^培養(yǎng)瓶中，再添加10ml含有重量百分比為10。/。胎牛血清(FBS) 的DMEM細胞培養(yǎng)液后置于溫度為37。C、含有體積百分比為5%(]02細胞培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)，每3日換1次細胞培養(yǎng)液；當(dāng)細胞生長至80Q/。融合時，按常規(guī)細胞 培養(yǎng)方法進行傳代、擴增培養(yǎng)。
步驟2002、常規(guī)分離健康人外周血單個核細胞(PBMC),用RPMI1640調(diào) 節(jié)細胞密度為1 x 106個/毫升，再加入濃度為15nM的PMA和濃度為10微克/ 毫升的抗CD3單抗，置于溫度為37°C、含有體積百分比為5%002細胞培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)6小時，使細胞活化，高表達CTLA-4 mRNA;
步驟2003、離心收集活化后的外周血單個核細胞(PBMC)，用PBS(DEPC) 漂洗細胞2次，按每1 x 107個外周血單個核細胞(PBMC )加入1毫升Tripure 的比例混勻，RT 5分鐘后加入0. 2毫升氯仿，劇烈震蕩15秒，再RT 5分鐘 后于10000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，將上層無色水相移至另一離心管，加 入O. 5毫升異丙醇，混勻，于溫度-20。C下放置10分鐘，再于10000轉(zhuǎn)/分 轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，加入1毫升質(zhì)量分數(shù)為75%乙醇洗滌沉淀，待沉淀干燥后加入200 ;敞升DEPC水溶解，于溫度-2(TC下保存；
用質(zhì)量分數(shù)為1. 5 %甲醛變性瓊脂糖凝膠到板制膠，凝固后置于1 x MOPS 電泳液中，將5微升RNA樣品和15微升載樣緩沖液于溫度為95。C水浴中變性 2分鐘，再于電壓50V下電泳，紫外才會測RM完整性；
將RNA樣品稀釋后再紫外分光光度儀上測0. D. 26。和0. D. 28。值，RNA濃度 (微克/毫升)=0.D. "。x40x稀釋倍數(shù)；
步驟2004、通過計算機輔助分析，根據(jù)基因庫中人CTLA-4基因序列，設(shè) 計如下三條引物，第一引物包括CTLA-4基因胞外區(qū)N末端7個氨基酸殘基和 抑瘤素M信號肽C端15個氨基酸殘基，第二引物對應(yīng)CTLA-4基因119-125 位氨基酸殘基，并引入BclI酶切位點，第三引物包括抑瘤素M信號肽其余氨 基酸殘基并與第一引物的抑瘤素M信號肽部分重疊，在第三引物的5，端引入 HindIII酶切位點；以上三條引物由中科院上海細胞所合成，PAGE純化；第一 引物的序列如SEQ IDN0:5，第二引物的序列如SEQ ID NO: 6，第三引物的 序列如SEQ ID NO: 7;
第一引物CTCAGTCTGGTCCTTGACCTCCTGTTTCCAAGCATGGCGA GCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC
第二引物TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTC
----Bell
第三引物GCAAGCTTCAATGGGTTGACTGCTCACACAGAGGACGCTG ——HindIII CTCAGTTCGGTCCTTGCATCT 步驟2005 、將10微升提取的RNA、 2微升ol igo ( dT12)和11. 5微升細20 (DEPC)混勻后于溫度65。C下水浴變性IO分鐘，然后迅速置于冰上，再加入 8微升5x逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、2微升濃度為100mMDTT、 0. 5微升RNasin、 4微升 濃度為2mM dNTP和2微升AMV (總體積共40微升)，于溫度42。C下放置1 小時，得到CTLA-4基因胞外區(qū)cDNA第一鏈，于溫度-20。C保存；先以cDNA第一鏈為模板，采用第一引物和第二引物進行第一輪擴增，條 件為將5微升cDNA第一鏈、5微升10 x PCR緩沖液、4微升濃度為10mM dNTP、 終濃度為100nM第一引物和第二引物各3微升、29. 5微升ddH20混勻后于溫 度95。C下變性7分鐘，再加入0. 5微升Taq酶(總體積共50微升)，循環(huán)條 件為94°C l分鐘，55°C 1分鐘，72°C 1分鐘，30個循環(huán)后72。C 7分鐘； 隨后以第一輪擴增的反應(yīng)產(chǎn)物為模板，采用第二引物和第三引物進行第二輪 擴增，反應(yīng)條件同前，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物；
步驟2006 、按試劑盒說明書(TAKARA， JAPANESE )操作來構(gòu)建 pUC19-CTLA4融合質(zhì)粒；參照《分子克隆》(金冬雁，黎孟楓譯，《分子克 隆實驗指南》，第二版北京科學(xué)出版社1996; P852 - 9。7) CaCl2制備大腸 桿菌感受態(tài)，加入終濃度為10-15%甘油，于溫度-70。C凍存；取凍存大 腸桿菌感受態(tài)細菌，加入1微升DNA連接產(chǎn)物，輕輕混勻后，水浴30分鐘， 再于溫度42。C下水浴2分鐘，加入900微升LB培養(yǎng)基，于溫度37。C下水 浴60分鐘，取適量涂布于含有濃度為100微克/毫升氨千青霉素的LB瓊脂 板上，于溫度37。C孵箱培養(yǎng)過夜；按DNA片段回收試劑盒說明書操作回收 DNA片段；將第二輪擴增的反應(yīng)產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，回收所需片段；
步驟2007、用HindIII和Bcll雙酶切pUC19-CTLA4融合質(zhì)粒后，與經(jīng)Hind III和Bell雙酶切pX/Ig載體片段按3: 1的比例混合，根據(jù)DNA快速連接試 劑盒說明連接，用連接后的產(chǎn)物再轉(zhuǎn)化MC1061 (ATCC,USA)感受態(tài)菌，得到 含有質(zhì)粒PUC19的CTLA4Ig融合蛋白表達載體，用HindIII和Xbal酶切鑒定陽 性轉(zhuǎn)化克隆插入的片段長度；
步驟2008、酶切鑒定插入片段長度正確的重組質(zhì)粒，經(jīng)HindIII和Xbal 雙酶切后定向插入pUC19質(zhì)粒(TAKARA， JAPANESE )中，采用Sanger雙脫氧 測序法，以質(zhì)粒雙鏈DNA為模版，在pUC19通用引物引導(dǎo)下，ABI Prism377
全自動測序儀自動測定插入片段的序列；其中CTLA4Ig重組基因表達系列如 SEQ ID NO: 1所示；
27步驟2009、從人的外周血中分離單個核細胞；
步驟2010、提取人的外周血單個核細胞的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為CD40基因胞 外區(qū)cDNA;
步驟20U、用特異性引物擴增CD40基因胞外區(qū)cDNA，并將擴增產(chǎn)物克 隆到T栽體上；第四引物的序列如SEQ ID NO: 8,第五引物的序列如SEQ ID NO: 9;
第四引物5， - CGTCCTCGAGCCACCATGGTTCGTCTGCCTC-3， 第五引物5， -GCGATGATCAGATCTCAGCCGATCCTGGG-3' 步驟2012、用HindIII和BclI雙酶切pX/Ig栽體，并將回收的Ig基因的 序列與克隆到T栽體上的CD40基因的序列連接，得到CD40Ig融合蛋白表達 栽體；其中，CD40Ig重組基因的表達序列如SEQ ID N0:2所示；
步驟2013、設(shè)計重疊延伸的擴增引物，使得重疊延伸的擴增引物去除 CTLA4Ig基因中末尾的非編碼區(qū)，保留CD40Ig基因中末尾的非編碼區(qū)；第六 引物的序列如SEQ ID NO: 10，第七引物的序列如SEQ ID NO: 11; 第六引物5' -ATATGGCCACAACCATGGTTCGTCTGCCT-3， 第七引物5， -AGGCTCTAGAAGCATCCTCGTG-3'
步驟2014、用重疊延伸的擴增引物擴增含有質(zhì)粒pUC19的CTLA4Ig融合 蛋白表達載體中的CTLA4Ig基因和IRES2序列，將產(chǎn)物CTLA4Ig-IRES2序列 回收純化；CTLA4Ig重組基因如SEQ ID NO: 1所示，IRES2序列如SEQ ID NO: 3 所示；
步驟2015、用重疊延伸的擴增引物擴增CTLA4Ig-IRES2和CD40Ig融合蛋 白表達栽體中的CD40-Ig基因，將擴增產(chǎn)物克隆入T載體，得到 CTLA4Ig-IRES2-CD40Ig基因，其序列如SEQ ID NO: 4所示，由于IRES2是 一段連接序列，為便于表述，以下的CTLA4Ig-IRES2-CD40Ig都表述為 CTLA4Ig-CD40Ig，即為CTLA4Ig-CD40Ig雙基因克隆栽體;
步驟2016、用HindIII和BamHI( TAKARA, JAPANESE )雙酶切栽體質(zhì)粒pcDNA3(invitrogen, USA),回收栽體質(zhì)粒pcDNA3的酶切產(chǎn)物；
步驟2017、用HindIII和BamHI雙酶切CTLA4Ig-CD40Ig雙基因克隆載體
中的目的基因CTLA4Ig-CD40Ig，回收目的基因CTLA4Ig-CD40Ig的酶切產(chǎn)物； 步驟2018、連接載體質(zhì)粒pcDNA3的酶切產(chǎn)物和目的基因CTLA4Ig-CD40Ig
的酶切產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化，才兆取單克隆培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)化后的pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig
質(zhì)粒；
步驟2019 、用 Hind III和Xhol ( TAKARA, JAPANESE )雙酶切 pcDNA3-CTLA41g-CD401g質(zhì)粒，回收pcDNA3-CTLA41g-CD401g質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物；
步驟2020、用HindIII和Sail ( TAKARA, JAPANESE )雙酶切載體質(zhì)粒 pDC316(Miscrobix biosystems， Inc),回收載體質(zhì)粒pDC316的酶切產(chǎn)物；
步驟2021、連接pcDM3-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物和載體質(zhì)粒 pDC316的酶切產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化，挑取單克隆培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)化后的 pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒；
步驟2022、用EcoRI單酶切pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒進行鑒定；
步驟2023、轉(zhuǎn)染前一天，將293細胞按5 x 105個/孔細胞密度接種于六孔 板中，置于溫度為37°C、含有體積百分比為5%0)2的培養(yǎng)箱中以含有重量百 分比為10%Hyclone胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜；
步驟2024、轉(zhuǎn)染當(dāng)天換液，用新鮮的含有重量百分比為10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；當(dāng)293細胞生長至孔底面積的85%時，取嵌合腺病毒 Ad5F35和pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒，用Lipofectamine2000脂質(zhì)體按其 所附說明書進行轉(zhuǎn)染。具體步驟為
1)每個轉(zhuǎn)染孔取骨架質(zhì)粒4jig，穿M粒lng,混和均勻；
2 )質(zhì)粒用300 ja 1的DMEM培養(yǎng)液進行稀釋，室溫放置5min;
3 )取10 m 1的脂質(zhì)體用300 ji 1的DMEM培養(yǎng)液進行稀釋，室溫放置5min; 4)將兩者混和，室溫避光放置30min;然后將混合物加入到細胞中； 步驟2025、轉(zhuǎn)染后第二天，將長滿的細胞傳代于25cn^細胞培養(yǎng)瓶中，用含有重量百分比為5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細胞生長 情況，當(dāng)細胞長滿瓶底時，再傳入75 cr^細胞培養(yǎng)瓶中，每天觀察細胞出毒 現(xiàn)象；出毒現(xiàn)象為細胞變大、變圓，呈葡萄狀，并開始出現(xiàn)明顯噬斑；當(dāng)75 %細胞出毒并從底部脫落時進行收毒；
步驟2026、將出毒的細胞培養(yǎng)瓶先置于溫度為-7(TC冰箱，再置于溫度 37。C水浴鍋中，如此凍融三次，使病毒從出毒細胞中充分釋放；將凍融液于 3000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，收集含病毒的上清液，棄沉淀，該上清液即為 含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病毒載體的第一代毒種，作為隨后大 量病毒擴增的毒種；
步驟2027、在25cm2細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)293細胞，當(dāng)293細胞生長至瓶底 面積的90%時，取50(M敬升上述第一代毒種接種于293細胞上；當(dāng)接種后的 293細胞完全出毒時，按上述凍融方法凍融細胞三次，將凍融液離心收集病毒 上清液，即為含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病毒載體的第二代毒種；
步驟2028、用Western Blotting方法鑒定CTLA4Ig基因和CD40Ig基因 的表達；
步驟2029、取生長至80%融合、生長狀態(tài)良好、增殖活躍的人皮膚成纖 維細胞，用DMEM細胞培養(yǎng)液輕輕洗滌細胞2次，按感染復(fù)數(shù)(MOI)為50的劑 量加入為病毒液轉(zhuǎn)染液，使其完全覆蓋細胞培養(yǎng)面積，然后置于溫度為37°C、 含有體積百分比為5%0)2的細胞培養(yǎng)箱中孵育2小時，再加入含有重量百分 比為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時；如圖所示圖12A為本發(fā) 明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載體及用途中正常人皮膚成纖 維細胞圖片和圖12B為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載 體及用途中被含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病毒栽體轉(zhuǎn)染后的人皮 膚成纖維圖片。
一種采用上述低免疫原性皮膚組織工程種子細胞的構(gòu)建方法構(gòu)建的低免 疫原性皮膚組織工程種子細胞。一種用于轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細胞的腺病毒載體，腺病毒載體是含有與啟
動子有效連接的CTLA4Ig基因和CD40Ig基因的Ad5F35嵌合型腺病毒栽體。 一種采用上述腺病毒載體在制備修復(fù)損傷皮膚的轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細胞
中的用途。
第三實施例
步驟3001 、將取自包皮環(huán)切術(shù)的人皮膚移入超凈操作臺，用雙抗PBS (含 有100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；pH為7. 2 )溶液漂洗5次，在培養(yǎng)皿 中修剪皮下筋膜細胞及多余的皮下脂肪，將修剪后的人皮膚標本剪成0.3cm x 2cm皮條，然后放入濃度為2. 5g/L的Dispase II酶中浸沒，于溫度4。C下消 化16小時。將DispaseII酶消化后的人皮膚標本揭除表皮，用眼科剪將分離 的真皮剪成糊狀后，加入濃度為200U/ml膠原酶于溫度37。C的孵箱內(nèi)消化4 小時，將組織基本消化散開，以看不到組織塊為度，制備成單個細胞懸液。將 消化物轉(zhuǎn)移至10ml離心管中，用PBS在1500轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速下離心洗滌5次，每 次離心5分鐘，以除去膠原酶，隨后將收集的細胞加入到含有重量百分比為 10%胎牛血清(FBS)的DMEM細胞培養(yǎng)液中重懸，按5 x 103個/厘米2細胞密 度接種于75cW培養(yǎng)瓶中，再添加10ml含有重量百分比為10。/。胎牛血清(FBS) 的DMEM細胞培養(yǎng)液后置于溫度為37。C 、含有體積百分比為5 % C02細胞培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)，每3日換1次細胞培養(yǎng)液；當(dāng)細胞生長至80%融合時，按常規(guī)細胞 培養(yǎng)方法進行傳代、擴增培養(yǎng)。
步驟3002、常規(guī)分離健康人外周血單個核細胞(PBMC)，用RPMI1640調(diào) 節(jié)細胞密度為1 x 106個/毫升，再加入濃度為15nM的PMA和濃度為10微克/ 毫升的抗CD3單抗，置于溫度為37°C、含有體積百分比為5%0)2細胞培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)6小時，使細胞活化，高表達CTLA-4 mRNA;
步驟3003、離心收集活化后的外周血單個核細胞(PBMC)，用PBS(DEPC) 漂洗細胞2次，1 x 107個外周血單個核細胞(PBMC)加入1毫升Tripure 的比例混勻，RT 5分鐘后加入0. 2毫升氯仿，劇烈震蕩15秒，再RT 5分鐘后于10000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，將上層無色水相移至另一離心管，加 入O. 5毫升異丙醇，混勻，于溫度-20。C下放置10分鐘，再于10000轉(zhuǎn)/分 轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，加入1毫升質(zhì)量分數(shù)為75%乙醇洗滌沉淀，待沉淀干燥 后加入200 ;f鼓升DEPC水溶解，于溫度-20。C下保存；
用質(zhì)量分數(shù)為1. 5 %甲醛變性瓊脂糖凝膠到板制膠，凝固后置于1 x MOPS 電泳液中，將5微升RNA樣品和15微升栽樣緩沖液于溫度為95。C水浴中變性 2分鐘，再于電壓50V下電泳，紫外檢測RNA完整性；
將RNA樣品稀釋后再紫外分光光度儀上測0. D. 26。和0. D. 28。值，RNA濃度 (微克/毫升)=0.0.26^4(^稀釋倍數(shù);
步驟3004、通過計算機輔助分析，根據(jù)基因庫中人CTLA-4基因序列，設(shè) 計如下三條引物，第一引物包括CTLA-4基因胞外區(qū)N末端7個氨基酸殘基和 抑瘤素M信號肽C端15個氨基酸殘基，第二引物對應(yīng)CTLA-4基因119 - 125 位氨基酸殘基，并引入BclI酶切位點，第三引物包括抑瘤素M信號肽其余氨 基酸殘基并與第一引物的抑瘤素M信號肽部分重疊，在第三引物的5'端引入 HindIII酶切位點；以上三條引物由中科院上海細胞所合成，PAGE純化；第一 引物的序列如SEQ IDNO:5，第二引物的序列如SEQ ID NO: 6,第三引物的 序列如SEQ ID NO: 7;
第一引物CTCAGTCTGGTCCTTGACCTCCTGTTTCCAAGCATGGCGA GCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC
第二引物TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTC
——Bell
第三引物GCAAGCTTCAATGGGTTGACTGCTCACACAGAGGACGCTG ——Hindffl CTCAGTTCGGTCCTTGCATCT 步驟3005、將10微升提取的RNA、 2微升ol igo (dT12)和11. 5微升卿 (DEPC)混勻后于溫度65。C下水浴變性10分鐘，然后迅速置于水上，再加入
328微升5 x逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、2微升濃度為lOOmM DTT、 0. 5微升RNasin、 4微升 濃度為2mM dNTP和2微升AMV (總體積共40微升)，于溫度42。C下放置1 小時，得到CTLA-4基因胞外區(qū)cDNA第一鏈，于溫度-20。C保存；
先以cDM第一鏈為模板，采用第一引物和第二引物進行第一輪擴增，條 件為將5微升cDNA第一鏈、5微升10 x PCR緩沖液、4微升濃度為10mM dNTP、 終濃度為100nM第一引物和第二引物各3微升、29. 5微升ddH20混勻后于溫 度95。C下變性7分鐘，再加入0. 5微升Taq酶(總體積共50微升)，循環(huán)條 件為94°C l分鐘，55°C 1分鐘，72°C 1分鐘，30個循環(huán)后72。C 7分鐘； 隨后以第一輪擴增的反應(yīng)產(chǎn)物為模板，采用第二引物和第三引物進行第二輪 擴增，反應(yīng)條件同前，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物；
步驟3006 、按試劑盒說明書(TAKARA， JAPANESE )操作來構(gòu)建 pUC19-CTLA4融合質(zhì)粒；參照《分子克隆》(金冬雁，黎孟楓譯，《分子克 隆實驗指南》，第二版北京科學(xué)出版社1996; PS52 —9。7) CaCh制備大腸 桿菌感受態(tài)，加入終濃度為10-15%甘油，于溫度-70。C凍存；取凍存大 腸桿菌感受態(tài)細菌，加入2微升質(zhì)粒，輕輕混勻后，冰浴30分鐘，再于溫 度42。C下水浴2分鐘，加入900微升LB培養(yǎng)基，于溫度37。C下水浴60 分鐘，取適量涂布于含有濃度為100微克/毫升氨千青霉素的LB瓊脂板上， 于溫度37。C孵箱培養(yǎng)過夜；按DNA片段回收試劑盒說明書操作回收DNA片 段；將第二輪擴增的反應(yīng)產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，回收所需片段；
步驟3007、用HindIII和BclI雙酶切pUC19-CTLA4融合質(zhì)粒后，與經(jīng)Hind in和BclI雙酶切pX/Ig載體片段按3: l的比例混合，根據(jù)DM快速連接試 劑盒i兌明連接，用連接后的產(chǎn)物再轉(zhuǎn)化MC1061 (ATCC，USA)感受態(tài)菌，得到 含有質(zhì)粒pUC19的CTLA4Ig融合蛋白表達載體，用HindIII和Xbal酶切鑒定陽 性轉(zhuǎn)化克隆插入的片段長度；
步驟3008、酶切鑒定插入片段長度正確的重組質(zhì)粒，經(jīng)HindIII和Xbal 雙酶切后定向插入pUC19質(zhì)粒(TAKARA， JAPANESE )中，采用Sanger雙脫氧測序法，以質(zhì)粒雙鏈DNA為模版，在pUC19通用引物引導(dǎo)下，ABI Prism377 全自動測序儀自動測定插入片段的序列；其中CTLA4Ig重組基因表達系列如 SEQ ID NO: 1所示；
步驟3009、從人的外周血中分離單個核細胞；
步驟3010、提取人的外周血單個核細胞的RNA,并反轉(zhuǎn)錄為CD40基因胞 外區(qū)cDM;
步驟3011、用特異性引物擴增CD40基因胞外區(qū)cDNA，并將擴增產(chǎn)物克 隆到T載體上；第四引物的序列如SEQ ID NO: 8,第五引物的序列如SEQ ID NO: 9;
第四引物5， - CGTCCTCGAGCCACCATGGTTCGTCTGCCTC-3' 第五引物5， -GCGATGATCAGATCTCAGCCGATCCTGGG-3' 步驟3012、用HindIII和BclI雙酶切pX/Ig載體，并將回收的Ig基因的 序列與克隆到T載體上的CD40基因的序列連接，得到CD40Ig融合蛋白表達 載體；其中，CD40Ig重組基因的表達序列如SEQ ID N0:2所示；
步驟3013、設(shè)計重疊延伸的擴增引物，使得重疊延伸的擴增引物去除 CTLA4Ig基因中末尾的非編碼區(qū)，保留CD40Ig基因中末尾的非編碼區(qū)；第六 引物的序列如SEQ ID NO: 10，第七引物的序列如SEQ ID NO: 11; 第六引物5' -ATATGGCCACAACCATGGTTCGTCTGCCT-3' 第七引物5， -AGGCTCTAGAAGCATCCTCGTG-3'
步驟3014、用重疊延伸的擴增引物擴增含有質(zhì)粒pUC19的CTLA4Ig融合 蛋白表達栽體中的CTLA4Ig基因和IRES2序列，將產(chǎn)物CTLA4Ig-IRES2序列 回收純化；CTLA4Ig重組基因如SEQ ID NO: 1所示，IRES2序列如SEQ ID NO: 3 所示；
步驟3015、用重疊延伸的擴增引物擴增CTLA4Ig-IRES2和CD40Ig融合蛋 白表達栽體中的CD40-Ig基因，將擴增產(chǎn)物克隆入T載體，得到 CTLA4Ig-IRES2-CD40Ig基因，其序列如SEQ ID NO: 4所示，由于IRES2是一段連接序列，為便于表述，以下的CTLA4Ig-IRES2-CD40Ig都表述為 CTLA4Ig-CD40Ig，即為CTLA4Ig-CD40Ig雙基因克隆載體；
步驟3016、用HindIII和BamHI( TAKARA， JAPANESE )雙酶切栽體質(zhì)粒pcDNA3 (invitrogen， USA )，回收載體質(zhì)粒pcDNA3的酶切產(chǎn)物；
步驟3017、用HindIII和BamHI雙酶切CTLA4Ig-CD40Ig雙基因克隆栽體 中的目的基因CTLA4Ig-CD40Ig，回收目的基因CTLA4Ig-CD40Ig的酶切產(chǎn)物；
步驟3018、連接載體質(zhì)粒pcDNA3的酶切產(chǎn)物和目的基因CTLA4Ig-CD40Ig 的酶切產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化，挑取單克隆培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)化后的pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig 質(zhì)粒；
步驟 3019 、 用 Hind III和Xhol ( TAKARA， JAPANESE )雙酶切 pcDNA3-CTLA41g-CD401g質(zhì)粒，回收pcDNA3-CTLA41g-CD401g質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物；
步驟3020、用HindIII和Sail ( TAKARA， JAPANESE )雙酶切栽體質(zhì)粒 pDC316(Miscrobix biosystems， Inc),回收栽體質(zhì)粒pDC316的酶切產(chǎn)物；
步驟3021、連接pcDM3-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物和載體質(zhì)粒 pDC316的酶切產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化，挑取單克隆培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)化后的 pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒；
步驟3022、用EcoRI單酶切pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒進4亍鑒定；
步驟3023、轉(zhuǎn)染前一天，將293細胞按5 x 105個/孔細胞密度接種于六孔 板中，置于溫度為37°C、含有體積百分比為5%0)2的培養(yǎng)箱中以含有重量百 分比為10。/。Hyclone胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜；
步驟3024、轉(zhuǎn)染當(dāng)天換液，用新鮮的含有重量百分比為10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；當(dāng)293細胞生長至孔底面積的90%時，取嵌合腺病毒 Ad5F35和pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒，用Lipofectamine2000脂質(zhì)體按其 所附說明書進行轉(zhuǎn)染。具體步驟為
1)每個轉(zhuǎn)染孔取骨架質(zhì)粒4jig，穿M粒l)ag，混和均勻；
2 )質(zhì)粒用300 n 1的DMEM培養(yǎng)液進行稀釋，室溫放置5rain;3 )取10 ja 1的脂質(zhì)體用300 n 1的DMEM培養(yǎng)液進行稀釋，室溫放置5min;
4)將兩者混和，室溫避光放置30min;然后將混合物加入到細胞中；
步驟3025、轉(zhuǎn)染后第二天，將長滿的細胞傳代于2Scn^細月包培養(yǎng)^f瓦中，用 含有重量百分比為5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細胞生長 情況，當(dāng)細胞長滿瓶底時，再傳入75 cr^細胞培養(yǎng)瓶中，每天觀察細胞出毒 現(xiàn)象；出毒現(xiàn)象為細胞變大、變圓，呈葡萄狀，并開始出現(xiàn)明顯噬斑；當(dāng)80 %細胞出毒并從底部脫落時進行收毒；
步驟3026、將出毒的細胞培養(yǎng)瓶先置于溫度為- (TC水箱，再置于溫度 37。C水浴鍋中，如此凍融三次，使病毒從出毒細胞中充分釋放；將凍融液于 3000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，收集含病毒的上清液，棄沉淀，該上清液即為 含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病毒載體的第一代毒種，作為隨后大
量病毒擴增的毒種；
步驟3027、在25ci^細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)293細胞，當(dāng)293細胞生長至瓶底 面積的90%時，取500微升上述第一代毒種接種于293細胞上；當(dāng)接種后的 293細l包完全出毒時，按上述凍融方法凍融細胞三次，將凍融液離心收集病毒 上清液，即為含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病毒載體的第二代毒種；
步驟3028、用Western Blotting方法鑒定CTLA4Ig基因和CD40Ig基因 的表達；
步驟3029、取生長至80%融合、生長狀態(tài)良好、增殖活躍的人皮膚成纖 維細胞，用DMEM細胞培養(yǎng)液輕輕洗滌細胞2次，按感染復(fù)數(shù)(MOI)為50的劑 量加入為病毒液轉(zhuǎn)染液,使其完全覆蓋細胞培養(yǎng)面積，然后置于溫度為37°C、 含有體積百分比為5%(:02的細胞培養(yǎng)箱中孵育2小時，再加入含有重量百分 比為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時；如圖所示圖為本發(fā) 明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載體及用途中正常人皮膚成纖 維細胞圖片和圖12B為本發(fā)明皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒栽 體及用途中被含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病毒載體轉(zhuǎn)染后的人皮膚成纖維圖片。
一種采用上述低免疫原性皮膚組織工程種子細胞的構(gòu)建方法構(gòu)建的低免 疫原性皮膚組織工程種子細胞。
一種用于轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細胞的腺病毒載體，腺病毒栽體是含有與啟
動子有效連接的CTLA4Ig基因和CD40Ig基因的Ad5F35嵌合型腺病毒載體。
一種采用上述腺病毒載體在制備修復(fù)損傷皮膚的轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細胞 中的用途。
下面通過具體的免疫性能實驗檢測了病毒轉(zhuǎn)染后細胞和未處理細胞的免 疫原性。
取培養(yǎng)48小時后轉(zhuǎn)染后的人皮膚成纖維細胞，用質(zhì)量分數(shù)為0. 25%胰酶 消化，再用含有重量百分比為10%胎牛血清(已滅活)的RPMI1640細胞培養(yǎng) 液調(diào)整細胞濃度至1 x 104個/毫升；將人淋巴細胞分離液與健康人全血按1:1 比例先后加入50毫升離心管中，于溫度4。C、轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘 后，吸取中間云霧層細胞，用PBS離心洗滌3次，離心轉(zhuǎn)速分別為2000轉(zhuǎn)/ 分、1500轉(zhuǎn)/分和1000轉(zhuǎn)/分，每次離心10分鐘，重懸細胞并鏡下計數(shù)，用 質(zhì)量分數(shù)為0.4%臺盤蘭染色計數(shù)細胞活率，再用含有重量百分比為10%胎 牛血清(已滅活)的RPMI1640細胞培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至1 x 106個/毫升； 將上述淋巴細胞懸液和成纖維細胞懸液各100微升加入96孔板，然后置于溫 度為37°C、含有體積百分比為5%(:02的細胞培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)48小時；將96 孔板于轉(zhuǎn)速1000轉(zhuǎn)/分下離心5分鐘；吸除培養(yǎng)液，每孔加入20微升濃度為 0. 5mg/ml MTT溶液，于溫度37。C下賻育4小時；再加入100微升DMSO溶解 振蕩20分鐘，放入酶標儀570nm下檢測。以未經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染的人皮膚成纖維細 胞(不含病毒液的DMEM作為轉(zhuǎn)染液)作為陰性對照。
實驗結(jié)果顯示病毒轉(zhuǎn)染后的人皮膚成纖維細胞和未經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染的人皮 膚成纖維細胞相比，其免疫原性下降了 31. 67 ±2. 25%。
下面通過具體的細胞增殖性能實驗檢測了病毒轉(zhuǎn)染后細胞和未處理細胞
37的增殖性能。
取生長至80%左右融合、生長狀態(tài)良好、增殖活躍的人皮膚成纖維細胞， 用質(zhì)量分數(shù)為0. 25%的胰蛋白酶消化，再用含有重量百分比為10%胎牛血清 的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至1 x 105個/毫升，按100 4效升/孔接種于96孔 板；按感染復(fù)數(shù)(MOI)為50的劑量加入為病毒液轉(zhuǎn)染液，使其完全覆蓋細胞培 養(yǎng)面積，置于溫度為37°C、含有體積百分比為5%(:02的細胞培養(yǎng)箱中孵育2 小時；再加入含有重量百分比為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小 時；吸除培養(yǎng)液，每孔加入20微升濃度為0. 5mg/ml MTT液，于溫度37。C下 孵育4小時后加入100微升DMSO溶解振蕩20分鐘，放入酶標儀570nm下檢 測。以未經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染的人皮膚成纖維細胞(不含病毒液的DMEM作為轉(zhuǎn)染液) 作為陰性對照。
實l^結(jié)果顯示對照組成纖維細胞活性值為0.9232 ± 0.0586，病毒轉(zhuǎn)染 組成纖維細胞活性值為0.9224 ± 0.0962,兩組無顯著性差異，說明病毒載體 轉(zhuǎn)染后不影響成纖維細胞的增殖性能。
因此，本發(fā)明使用的含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病毒栽體在 體外可對人皮膚成纖維細胞進行有效轉(zhuǎn)染，得到低免疫原性皮膚組織工程種 子細胞；本發(fā)明低免疫原性皮膚組織工程種子細胞的構(gòu)建方法能有效降低種 子細胞的免疫原性，且轉(zhuǎn)染后的人皮膚成纖維細胞不影響其體外增殖性能， 因此，該方法可有效的用于低免疫原性組織工程皮膚的種子細胞。
最后所應(yīng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制， 盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技 術(shù)方案的精神和范圍。序列表
<110> 重慶宗申軍輝生物技術(shù)有限公司
<120>皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載體及用途 <130> 081981GF <160> 11
<170> Patentln version 3. 5
<210> 1
<211〉 1152
<212> 腿
<213> Homo sapiens
<楊> 1
atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtUcca 60
agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120
ggcatcgcca gcUtgtgtg tgagtatgca tctccaggca aagccactga ggtccgggtg 180
acagtgcttc ggcaiggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240
gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300
gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360
gagctcatgt acccaccgcc atactacctg ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420
attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480
acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcttcccc 」^":ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 720
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900
ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140
ccgggtaaat ga
1152
<210> 2
<211> 625
<212> DM
<213> Homo sapiens
<400> 2
ttcgaattct gcagtcgacg gtaccgcggg cccgggatcc gcccctctcc ctcccccccc 60
cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt gtgcgtUgt ctatatgtta 120
ttUccacca tattgccgtc UUggcaat gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc 180
ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat 240
40gtxgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc 300
ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc tctgcggcca aaagccacgt 360
gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt 420
gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag 480
aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt gcacatgctt tacatgtgtt 540
tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga 600
aaaacacgat gataatatgg ccaca 625
<210> 3
<211〉 1287
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400〉 3
atggUcgtc tgcctctgca gtgcgtcctc tggggctgct tgctgaccgc tgtccatcca 60
gaaccaccca ctgcatgcag agaaaaacag tacctaataa acagtcagtg ctgttctUg 120
tgccagccag gacagaaact ggtgagtgac tgcacagagt tc汪ctgaaac ggaatgcctt 180
ccttgcggtg aaagcgaatt cctagacacc tggaacagag agacacactg ccaccagcac 240
汪aatactgcg accccaacct agggcttcgg gtccagcaga agggcacctc agaaacagac 300
accatctgca cctgtgaaga aggctggcac tgtacgagtg aggcctgtga gagctgtgtc 360
ctgcaccgct catgctcgcc cggctttggg gtcaagcaga ttgctacagg ggUtctgat 420accatctgcg agccctgccc agtcggcttc ttctccaatg tgtcatctgc tttcgaaaaa 480
tgtcaccctt ggacaagctg tgagaccaaa gacctggttg tgcaacaggc aggcacaaac 540
aagactgatg ttgtctgtgg tccccaggat cggctgagat ctgatcagga gcccaaatct 600
tctgacaaaa ctcacacatc cccaccgtcc ccagcacctg aactcctggg gggatcgtca 660
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 720
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 780
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 840
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagUc 900
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 960
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1020
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1080
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aac'tacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1140
tccgacggct ccUcUcct ctacagcaag ctxaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1200
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1260
agcctctccc tgtctccggg taaatga
1287
<210> 4
<211> 3067
〈212〉 ■
<213> Homo sapiens<400〉 4
atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca
60
agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120
ggcatcgcca gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aagccactga ggtccgggtg 180
acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240
gggaatgagt tgaxcttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300
gtgaacctca ctatccaagg actgaggjgcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360
gagctcatgt acccaccgcc atactacctg ggcataggca acggaaxcca gatttatgta 420
attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480
acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcUcccc 540
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600
gacgtgagcc acga卿ccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 720
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctxca aagccaaagg gcagccccga 840
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900
ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgac"cg ccgtggagtg ggag辜aat 960
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccUc 1020
ttcctctaca gc鄉(xiāng)'ctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 湖O
43tgctccgtga tgcatgaiggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140
ccgggtaaat gattcgaatt ctgcagtcga cggtaccgcg ggcccgggat ccgcccctct 1200
ccctcccccc cccctaacgt Uctggccga agccgcttgg aataaggccg gtgtgcgttt 1260
gtctatatgt tattttccac catattgccg tcttttggca atgtgagggc ccggaaacct 1320
ggccctgtct tcttgacgag cattcctagg ggtctttccc ctctcgccaa aggaatgcaa 1380
ggtctgttga atgtcgtgaa ggaagcagtt cctctggaag cUcttgaag acaaacaacg 1440
tctgtagcga ccctttgcag gcagcggaac cccccacctg gcgacaggtg cctctgcggc 1500
caaaagccac gtgtataaga Ucacctgca aaggcggcac aaccccagtg ccacgttgtg 1560
agUggatag ttgtggaaag agtcaaatgg ctctcctcaa gcgtattcaa caaggggctg 1620
aaggatgccc agaaggtacc ccattgtatg ggatctgatc tggggcctcg gtgcacatgc 1680
tttacatgtg tttagtcgag gttaaaaaaa cgtctaggcc ccccgaacca cggggacgtg 1740
gttttccttt gaaaaacacg atgataatat ggccacaacc atggttcgtc tgcctctgca 1800
gtgcgtcctc tggggctgct tgctgaccgc tgtccatcca gaaccaccca ctgcatgcag 1860
agaaaaacag tacctaaUa acagtcagtg ctgttcUtg tgccagccag gacagaaact 1920
ggtgagtgac tgcacagagt tcactgaaac ggaatgcctt ccttgcggtg aaagcgaatt 1980
cctagacacc tggaacagag agacacactg ccaccagcac aaatactgcg accccaacct 2040
agggcttcgg gtccagcaga agggcacctc agaaacagac accatctgca cctgtgaaga 2100
aggctggcac tgtacgagtg aggcctgtga gagctgtgtc ctgcaccgct catgctcgcc 2160cggcUtggg gtcaagcaga ttgctacagg ggutctgat accatctgcg agccctgccc 2220
agtcggcttc ttctccaatg tgtcatctgc tttcgaaaaa tgtcaccctt ggacaagctg 2280
tgagaccaaa gacctggttg tgcaacaggc aggcacaaac aagactgatg Ugtctgtgg 2340
tccccaggat cggctgagat ctgatcagga gcccaaatct tctgacaaaa ctcacacatc 2400
cccaccgtcc ccagcacctg aactcctggg gggatcgtca gtcttcctct tccccccaaa 2460
acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt 2520
gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggUcgtg gacggcgtgg aggtgcataa 2580
tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg Uccgtgtgg tcagcgtcct 2640
caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa 2700
agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc 2760
acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac 2820
ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca 2880
gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccUcttcct 2940
cUcagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc 3000
cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg 3060
t,tga 3067
<210〉 5 <211> 65<212> 腿
<213> Artificial
<220>
<223> PCR擴增CTLA-4的胞外區(qū)的引物
<400> 5
ctcagtctgg tccttgacct cctgtttcca agcatggcga g.catggcaat gcacgtggcc 60 cagcc 65
<210> 6
〈211> 33
<212> 隱
<213> Artificial
<220>
<223> PCR擴增CTLA-4的胞外區(qū)的引物
<400> 6
Utgggctcc tgatcagaat ctgggcacgg Uc 33
<210> 7
<211> 61
<212> DM
<213> Artificial
<220>
< 2 2 3 〉 PCR擴增CTLA-4的胞外區(qū)的引物
<400> 7
gcaagcttca atgggttgac tgctcacaca gaggacgctg ctcagttcgg tccttgcatc 60
t 61<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR擴增CD40的胞外區(qū)的引物
<400> 8
cgtcctcgag ccaccatggt tcgtctgcct c 31
<210> 9
<211> 29
<212> DM
<213> Artificial
<220〉
<223> PCR擴增CD40的胞外區(qū)的引物
<400> 9
gcgatgatca gatctcagcc gatcctggg 29
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 擴增CTLA4-Ig與IRES2的引物
<400> 10
atatggccac aaccatggtt cgt'ctgcct 29<210> 11
<211〉 22
<212> 腿
<213> Artificial
<220>
<223> 擴增CTLA4-Ig與IRES2的引物
<400> 11
aggctctaga agcatcctcg tg 2權(quán)利要求
1、一種低免疫原性皮膚組織工程種子細胞的構(gòu)建方法，其特征在于，包括培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞并構(gòu)建含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因腺病毒載體；所述含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因腺病毒載體體外轉(zhuǎn)染所述人皮膚成纖維細胞。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的低免疫原性皮膚組織工程種子細胞的構(gòu)建方法， 其特征在于，所述培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞具體為將人皮膚成纖維細胞采用 酶消化法將組織消化散開，制備成單個細胞懸液，按5 x 103個/厘米2細胞密 度接種于培養(yǎng)瓶中，置于溫度為37°C、含有體積百分比為5。/。C02細胞培養(yǎng)箱 中以含有重量百分比為10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，當(dāng)細胞生 長至80%融合時進行傳代、擴增。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的低免疫原性皮膚組織工程種子細胞的構(gòu)建方法， 其特征在于，所述構(gòu)建含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因腺病毒載體具體為構(gòu)建CTLA4Ig融合蛋白表達載體；構(gòu)建CD40Ig融合蛋白表達載體；構(gòu)建CTLA4Ig和CD40Ig雙基因克隆載體；構(gòu)建pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒；構(gòu)建含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病毒載體。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的低免疫原性皮膚組織工程種子細胞的構(gòu)建方法， 其特征在于，所述構(gòu)建CTLA4Ig融合蛋白表達載體具體為分離、活化人外周血單個核細胞；提取、鑒定所述人外周血單個核細胞的RNA;設(shè)計引物，第一引物包括CTLA-4基因胞外區(qū)N末端7個氨基酸殘基和抑 瘤素M信號肽C端15個氨基酸殘基，第二引物對應(yīng)CTLA-4基因119 - 125位 氨基酸殘基，并引入BclI酶切位點，第三引物包括抑瘤素M信號肽其余氨基酸殘基并與第一引物的抑瘤素M信號肽部分重疊，在第三引物的5，端引入Hind III酶切位點；反轉(zhuǎn)錄所述人外周血單個核細胞的RNA合成CTLA-4基因胞外區(qū)cDNA第 一鏈，以CTLA-4基因胞外區(qū)cDM第一鏈為模板，采用第一引物和第二引物 進行第一輪擴增，以第一輪擴增的反應(yīng)產(chǎn)物為模板，采用第二引物和第三引 物進行第二輪擴增，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物；構(gòu)建pUC19-CTLA4融合質(zhì)粒；用HindIII和Bcll雙酶切所述pUC19-CTLA4融合質(zhì)粒后，與經(jīng)HindIII和 Bc 11雙酶切pX/1 g載體片段混合并連接，用連接后的產(chǎn)物再轉(zhuǎn)化MC1061感受 態(tài)菌，得到含有質(zhì)粒pUC19的CTLA4Ig融合蛋白表達載體，用HindIII和XbaI 酶切鑒定陽性轉(zhuǎn)化克隆插入的片段長度；測定所述陽性轉(zhuǎn)化克隆插入的片段的序列。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的低免疫原性皮膚組織工程種子細胞的構(gòu)建方法， 其特征在于，所述構(gòu)建CD40Ig融合蛋白表達載體具體為分離、活化人外周血單個核細胞；提取所述人外周血單個核細胞的RM，并反轉(zhuǎn)錄為CD40基因胞外區(qū)cDNA;用特異性引物擴增所述CD40基因胞外區(qū)cDNA，將擴增產(chǎn)物克隆到T載體 上；所述特異性引物為第四引物:5， -CGTCCTCGAGCCACCATGGTTCGTCTGCCTC -3，，第五引物5， -GCGATGATCAGATCTCAGCCGATCCTGGG-3，；用HindIII和Bcll雙酶切pX/Ig載體，將回收的Ig基因的序列與克隆到 T載體上的CD40基因的序列連接，得到CD40Ig融合蛋白表達載體。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的低免疫原性皮膚組織工程種子細胞的構(gòu)建方法， 其特征在于，所述構(gòu)建CTLA4Ig和CD40Ig雙基因克隆載體具體為設(shè)計重疊延伸的擴增引物，使得所述重疊延伸的擴增引物去除CTLA4Ig 基因中末尾的非編碼區(qū)，保留CD40Ig基因中末尾的非編碼區(qū)；所述重疊延伸 的擴增引物為第六引物:5， -ATATGGCCACAACCATGGTTCGTCTGCCT-3，，第七引物5， -AGGCTCTAGAAGCATCCTCGTG-3';用所述重疊延伸的擴增引物擴增所述含有質(zhì)粒pUC19的CTLA4Ig融合蛋 白表達載體中的CTLA4Ig基因和IRES2序列，將產(chǎn)物CTLA4Ig-IRES2序列回 收純化；用所述重疊延伸的擴增引物擴增所述CTLA4Ig-IRES2和所述CD40Ig融合 蛋白表達載體中的CD40-Ig基因，將擴增產(chǎn)物克隆入T載體，得到 CTLA4Ig-CD40Ig雙基因克隆載體。
7.其特征在于，所述構(gòu)建pDC316-CTLA41g-CD401g質(zhì)粒具體為用HindIII和BamHI雙酶切載體質(zhì)粒pc醒3，回收所述載體質(zhì)粒pcDNA3 的酶切產(chǎn)物；用HindlII和BamHI雙酶切所述CTLA4Ig-CD40Ig雙基因克隆載體中的目的 基因CTLA4Ig-CD40Ig，回收所述目的基因CTLA4Ig-CD40Ig的酶切產(chǎn)物；連接所述載體質(zhì)粒pcDNA3的酶切產(chǎn)物和所述目的基因CTLA4Ig-CD40Ig 的酶切產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化，挑取單克隆培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)化后的pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig 質(zhì)粒；用HindIII和Xhol雙酶切pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒，回收所述 pcDNA3-CTLA41g-CD4 01g質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物；用HindIII和Sail雙酶切載體質(zhì)粒pDC316，回收所述載體質(zhì)粒pDC316的 酶切產(chǎn)物；連4矣所述pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物和所述栽體質(zhì)粒 pDC316的酶切產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化，挑取單克隆培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)化后的 pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒；用EcoRI單酶切pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒進行鑒定。
8、根據(jù)權(quán)利要求3所述的低免疫原性皮膚組織工程種子細胞的構(gòu)建方法， 其特征在于，所述構(gòu)建含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病毒栽體具體為轉(zhuǎn)染前一天，將293細胞按5xl()S個/孔細胞密度接種于六孔板中，置于 溫度為37°C、含有體積百分比為5%0)2的培養(yǎng)箱中以含有重量百分比為10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜；轉(zhuǎn)染當(dāng)天換液，用新鮮的含有重量百分比為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基 繼續(xù)培養(yǎng)；當(dāng)293細胞生長至孔底面積的80 - 90%時，取嵌合腺病毒Ad5F35 和所述pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig質(zhì)粒，用脂質(zhì)體進行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染后第二天，將長滿的細胞于細胞培養(yǎng)瓶中進行傳代，觀察細胞出毒 現(xiàn)象，當(dāng)70 - 80%細胞出毒并脫落時進行收毒；所述出毒現(xiàn)象為細胞變大、 變圓，呈葡萄狀，出現(xiàn)明顯噬斑；將出毒的細胞培養(yǎng)瓶凍融三次，將凍融液離心，收集上清液，得到含有 CTLA4Ig-CD40Ig雙基因Ad5F35腺病毒載體的第一代毒種；在細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)293細胞，當(dāng)293細胞生長至瓶底面積的90%時， 取所述第一代毒種接種于所述293細胞上；當(dāng)接種后的293細胞完全出毒時， 凍融三次，將凍融液離心，收集上清液，得到含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因 Ad5F35腺病毒載體的第二代毒種；用Western Blotting方法鑒定CTLA4Ig基因和CD40Ig基因的表達。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的低免疫原性皮膚組織工程種子細胞的構(gòu)建方法， 其特征在于，所述含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因腺病毒載體體外轉(zhuǎn)染所述人皮 膚成纖維細胞具體為取所述人皮膚成纖維細胞，用DMEM細胞培養(yǎng)液洗滌， 按感染復(fù)數(shù)為50的劑量加入為病毒液轉(zhuǎn)染液，置于溫度為37°C、含有體積百 分比為5%0)2的細胞培養(yǎng)箱中孵育2小時，再加入含有重量百分比為10%胎 牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時。
10、 一種采用權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述低免疫原性皮膚組織工 程種子細胞的構(gòu)建方法構(gòu)建的低免疫原性皮膚組織工程種子細胞。
11、 一種用于轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細胞的腺病毒載體，其特征在于，所述腺病毒載體是含有與啟動子有效連接的CTLA4Ig基因和CD40Ig基因的Ad5F35 嵌合型腺病毒栽體。
12、 一種采用權(quán)利要求11所述的腺病毒載體在制備修復(fù)損傷皮膚的轉(zhuǎn)染 人皮膚成纖維細胞中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種皮膚組織工程種子細胞及構(gòu)建方法、腺病毒載體及用途，構(gòu)建方法包括培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞并構(gòu)建含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因腺病毒載體；所述含有CTLA4Ig-CD40Ig雙基因腺病毒載體體外轉(zhuǎn)染所述人皮膚成纖維細胞。低免疫原性皮膚組織工程種子細胞，由上述構(gòu)建方法制成。用于轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細胞的腺病毒載體，是含有與啟動子有效連接的CTLA4Ig基因和CD40Ig基因的Ad5F35嵌合型腺病毒載體。一種采用腺病毒載體在制備修復(fù)損傷皮膚的轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細胞中的用途。本發(fā)明能有效降低種子細胞的免疫原性，且轉(zhuǎn)染后的人皮膚成纖維細胞不影響其體外增殖性能。
文檔編號C12N15/62GK101619322SQ20081012656
公開日2010年1月6日 申請日期2008年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月1日
發(fā)明者軍 吳, 勇 孔, 葛良鵬, 泓 魏, 黃正根 申請人:重慶宗申軍輝生物技術(shù)有限公司