專利名稱：：一種通用分子信標(biāo)核酸探針及其檢測(cè)dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及DNA分析檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種通過(guò)使用通用分子信標(biāo)核酸探針檢測(cè)DNA的方法。
背景技術(shù)：
：基因檢測(cè)可以做到疾病的早知道、早預(yù)防、早治療。因此臨床基因檢測(cè)受到了廣泛地重視，為了滿足快速準(zhǔn)確地檢測(cè)和/或定量感染物(如病毒、細(xì)菌等)中，以及正常和不正?；蛑械耐蛔兊幕蛐蛄?，大量的基因檢測(cè)技術(shù)正在不斷的發(fā)展和完善。這些DNA檢測(cè)不僅在疾病控制和治療中有重要的意義，還在群體遺傳學(xué)、藥物開(kāi)發(fā)、法學(xué)、癌癥和食品安全等研究領(lǐng)域有著很重要的意義。實(shí)現(xiàn)DNA定量及序列突變檢測(cè)，最常用的是核酸探針技術(shù)，其中分子信標(biāo)(MolecularBeacon)核酸探針應(yīng)用最為廣泛。分子信標(biāo)是呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的短鏈DNA,—端標(biāo)記熒光基團(tuán)，一端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，其呈莖環(huán)閉合結(jié)構(gòu)時(shí)不釋放熒光，莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，釋放熒光。在對(duì)DNA進(jìn)行檢測(cè)和/或定量時(shí)，一般采用分子信標(biāo)結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(Real-timePCR)。該方法中，分子信標(biāo)根據(jù)目標(biāo)DNA的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)和優(yōu)化，分子信標(biāo)探針在游離狀態(tài)下是莖環(huán)閉合結(jié)構(gòu)，不釋放熒光，在擴(kuò)增反應(yīng)的退火步驟，分子信標(biāo)與目標(biāo)序列雜交，特異性結(jié)合形成雙鏈，莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，釋放熒光，隨著擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行，熒光信號(hào)增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的檢領(lǐng)ij。盡管這個(gè)技術(shù)是檢測(cè)和鑒別樣品中目標(biāo)DNA分析的有力工具，但是所采用的分子信標(biāo)都是目標(biāo)序列特異性的，對(duì)于不同的體系都要根據(jù)目標(biāo)物重新設(shè)計(jì)分子信標(biāo)，重新優(yōu)化分子信標(biāo)序列，優(yōu)化反應(yīng)條件，這些問(wèn)題限制了其在臨床實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下用于常規(guī)操作時(shí)的應(yīng)用性，而且檢測(cè)費(fèi)用昂貴。最困難的問(wèn)題之一是，在不同實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)體系選用的分子信標(biāo)探針序列不一樣，檢測(cè)和定量的條件不同，不利于測(cè)試步驟的標(biāo)準(zhǔn)化。因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)普及性高、易用、靈敏、低廉、準(zhǔn)確地檢測(cè)和/或定量DNA的分析技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的局限性，提供一種可用于檢測(cè)和/或定量DNA分析的易用、靈敏、低廉、準(zhǔn)確的分析技術(shù)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下在本發(fā)明的第一方面，提供了一種通用分子信標(biāo)核酸探針，探針5'端標(biāo)記熒光基團(tuán)(比如FAM，TET，HEX,ROX，CY5，TAMRA)，3，端標(biāo)記淬滅基團(tuán)(如DABCYL)，該探針在游離狀態(tài)下形成莖環(huán)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，熒光淬滅，環(huán)部15-30個(gè)堿基，莖部4-7對(duì)互補(bǔ)堿基，其中環(huán)部或環(huán)部與5'端莖部或環(huán)部與兩端莖部的序列為一通用序列，當(dāng)探針與該通用序列的互補(bǔ)序列結(jié)合時(shí)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，釋放熒光。上述通用分子探針的環(huán)部?jī)?yōu)選為十個(gè)AG的重復(fù)序列，5'端莖部序列優(yōu)選為5'-CCGGG-3'。上面所列舉的各熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的中英文全稱見(jiàn)表1。表l.分子信標(biāo)5'和3'的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)標(biāo)記的中英文全稱<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于檢測(cè)DNA的通用DNA雜交對(duì)，所述雜交對(duì)包括上述的通用分子信標(biāo)和一通用序列引物，該通用序列引物又包括(a)通用區(qū)，該通用區(qū)位于通用序列引物的5，端并且與通用分子信標(biāo)核酸探針中的通用序列互補(bǔ)；(b)特異結(jié)合區(qū)，該特異結(jié)合區(qū)位于通用序列引物3'端，用于與目標(biāo)序列特異性結(jié)合。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種DNA定性和/或定量檢測(cè)方法，是在實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系中加入通用分子信標(biāo)核酸探針，用正反向引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)，并在PCR的每個(gè)擴(kuò)增熱循環(huán)中，延伸之后降溫至25。C檢測(cè)熒光信號(hào)，根據(jù)熒光信號(hào)的變化對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行DNA定性和/或定量分析，其中所述通用分子信標(biāo)核酸探針5，端標(biāo)記熒光基團(tuán)(比如FAM，TET，HEX,ROX，CY5，TAMRA)，3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)(如DABCYL)，該探針在游離狀態(tài)下形成莖環(huán)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，熒光淬滅，環(huán)部15-30個(gè)堿基，莖部4-7對(duì)互補(bǔ)堿基，其中環(huán)部或環(huán)部與5'端莖部或環(huán)部與兩端莖部的序列為一通用序列；所述正反向引物特異性結(jié)合于目標(biāo)DNA，其中之一為通用序列引物，它包括(a)通用區(qū)，該通用區(qū)位于通用序列引物的5'端，并且與通用分子信標(biāo)核酸探針中的通用序列互補(bǔ)；(b)特異結(jié)合區(qū)，該特異結(jié)合區(qū)位于通用序列引物3'端，用于與目標(biāo)DNA特異性結(jié)合。通用分子信標(biāo)核酸探針與通用序列引物結(jié)合的TJ1應(yīng)高于通用序列引物與目標(biāo)DNA結(jié)合的TJI。當(dāng)所述分子信標(biāo)核酸探針與通用序列引物特異性結(jié)合時(shí)釋放熒光，當(dāng)分子信標(biāo)核酸探針被反向延伸產(chǎn)物取代下來(lái)時(shí)熒光淬滅，從而在PCR循環(huán)過(guò)程中產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。在本發(fā)明的通用序列引物中，對(duì)所述的特異結(jié)合區(qū)的長(zhǎng)度沒(méi)有特別限制，通常長(zhǎng)度為5-25bp;對(duì)于通用區(qū)的長(zhǎng)度一般為25bp左右。通用分子信標(biāo)核酸探針與通用序列引物雜交可以有三種情況環(huán)部和5'莖部，環(huán)部和兩端莖部，或者僅環(huán)部與通用序列引物結(jié)合。通用分子信標(biāo)核酸探針與通用序列引物結(jié)合的Tm值通常比通用序列引物與目標(biāo)DNA結(jié)合的Tm值高出2-20。C，較佳的高出5-12。C。在本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系中，通用分子信標(biāo)、通用序列引物和反向引物的數(shù)量關(guān)系較佳的是通用分子信標(biāo)的數(shù)量等于通用序列引物的數(shù)量，而反向引物的數(shù)量大于通用序列引物的數(shù)量，三者最佳的比例為1:1丄6。這樣，在反應(yīng)體系中，通用分子信標(biāo)處于與通用序列引物結(jié)合的狀態(tài)，且在擴(kuò)增反應(yīng)中能完全的被反向引物延伸片段取代下來(lái)。在本發(fā)明對(duì)目標(biāo)DNA檢測(cè)體系中，通用序列引物和反向引物序列要進(jìn)行優(yōu)化，不要出現(xiàn)大于4bp的二聚體的形成，而且通用序列引物自身3'端不能形成大于4bp的自雜交的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這樣就可以避免假陽(yáng)性的現(xiàn)象。在本發(fā)明對(duì)DNA檢測(cè)的方法中，PCR每個(gè)擴(kuò)增熱循環(huán)中都有25nC降溫的步驟，并在該步檢測(cè)熒光信號(hào)，這樣可以保證通用分子信標(biāo)被取代后較好的恢復(fù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，熒光淬滅效率高。本發(fā)明的DNA檢測(cè)方法可應(yīng)用于DNA點(diǎn)突變(包括單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn))的檢測(cè)和DNA序列分析。在本發(fā)明對(duì)DNA點(diǎn)突變的檢測(cè)體系中，DNA聚合酶(Vent3'-excTDNA聚合酶)的數(shù)量對(duì)點(diǎn)突變準(zhǔn)確性檢測(cè)有較大的影響，在50^L的反應(yīng)體系中，一般來(lái)說(shuō)在1-1.8U6情況下，區(qū)分G，A，T的堿基的匹配和錯(cuò)配情況較好，更佳地為1U，這樣，在反應(yīng)體系中，DNA聚合酶就能在更大程度上發(fā)揮識(shí)別匹配和錯(cuò)配的差異性的功能。在本發(fā)明中，選用的DNA聚合酶必須具有鏈取代活性，而且沒(méi)有3'外切活性，這樣才可以實(shí)現(xiàn)對(duì)通用分子信標(biāo)的取代并保證分子信標(biāo)的完整性。在本發(fā)明中，對(duì)待測(cè)DNA樣品沒(méi)有限制，病毒DNA、癌癥樣品DNA、微生物DNA、轉(zhuǎn)基因DNA等都可用本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測(cè)。在本發(fā)明中，對(duì)于PCR反應(yīng)引物對(duì)擴(kuò)增的目標(biāo)序列長(zhǎng)度沒(méi)有特別的限制。按照通用序列引物和反向引物的特異結(jié)合區(qū)的3'端在模板上的距離表示，通常為lbp-10kb，較佳的為20bp-2kb。如本文所用，下列詞語(yǔ)/術(shù)語(yǔ)具有下列含義，除非另外說(shuō)明。"DNA":脫氧核糖核酸。"目標(biāo)物"待直接或間接檢測(cè)的分析物，主要是DNA。"模板"能夠被DNA聚合酶擴(kuò)增的DNA分子的全長(zhǎng)或部分序列。"通用序列引物"通用序列引物是合成的寡核苷酸序列，其3'端是特異結(jié)合區(qū)，通用序列引物該結(jié)合區(qū)與目標(biāo)DNA結(jié)合延伸擴(kuò)增；通用區(qū)位于5'端，與通用分子信標(biāo)結(jié)合。通用序列引物可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法合成。"通用分子信標(biāo)(Universalmolecularbeacon,U-MB)":是一種莖環(huán)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸片段，5'端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，所述的分子信標(biāo)在下列兩種情況下?tīng)顟B(tài)不同，從而產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)(i)結(jié)合于通用序列引物的通用區(qū)部分，(ii)分子信標(biāo)被核酸聚合酶作用產(chǎn)物片段延伸取代下來(lái)。本發(fā)明所公開(kāi)的方法原則上歸為引物擴(kuò)增取代分子信標(biāo)的反應(yīng)，其關(guān)鍵是使用通用適合的DNA雜交序列對(duì)作為分子信標(biāo)探針和引物的互補(bǔ)通用序列，該方法可靈敏、準(zhǔn)確和標(biāo)準(zhǔn)化地對(duì)目標(biāo)DNA分子進(jìn)行定性和/或定量檢測(cè)，可應(yīng)用于各種基因檢測(cè)體系，不僅操作方便，而且費(fèi)用也大大降低，特別是對(duì)于各種疾病早期檢測(cè)、療效評(píng)價(jià)、人群普査及遺傳分析等均有很高的實(shí)用價(jià)值。本發(fā)明具有明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，其主要優(yōu)點(diǎn)包括(l)通用性，本發(fā)明創(chuàng)造性地建立了實(shí)時(shí)熒光PCR通用型DNA檢測(cè)體系，通過(guò)將PCR反應(yīng)中的一條引物帶上通用區(qū)與分子信標(biāo)特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了分子信標(biāo)與目標(biāo)檢測(cè)體系沒(méi)有序列相關(guān)性，而又可以做為指示信號(hào)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的檢測(cè)。該體系為臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果可比性提供依據(jù)。(2)高準(zhǔn)確性，該體系分子信標(biāo)與通用序列引物特異性結(jié)合，特別是5'莖部也與通用序列引物的通用區(qū)結(jié)合的情況，比常規(guī)的分子信標(biāo)實(shí)時(shí)熒光PCR體系的結(jié)合更加穩(wěn)定，而且能減少與目標(biāo)序列的非特異性結(jié)合，減少假陽(yáng)性現(xiàn)象。(3)簡(jiǎn)化檢測(cè)，現(xiàn)有技術(shù)中，不同檢測(cè)體系的反應(yīng)最佳條件各不相同，因此，優(yōu)化檢測(cè)條件步驟繁瑣，費(fèi)用高，使用本發(fā)明，更換檢測(cè)體系不需要重新優(yōu)化分子信標(biāo)及引物濃度，便于對(duì)大量不同體系進(jìn)行DNA檢測(cè)，而且可實(shí)現(xiàn)各PCR反應(yīng)體系條件標(biāo)準(zhǔn)化，從而實(shí)現(xiàn)在一管中對(duì)多種目標(biāo)的檢測(cè)。(4)降低成本，在現(xiàn)有實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)中，對(duì)于不同檢測(cè)體系都有特異的分子信標(biāo)探針，而在本發(fā)明中，不同的目標(biāo)體系只需一種分子信標(biāo)探針，因此，大大降低設(shè)計(jì)、合成成本。圖l是本發(fā)明的通用序列引物與通用分子信標(biāo)核酸探針結(jié)合的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是本發(fā)明的DNA檢測(cè)PCR熱循環(huán)流程示意圖。圖3是本發(fā)明的一種DNA點(diǎn)突變檢測(cè)方法的步驟示意圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖，通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l、用通用分子信標(biāo)、通用序列引物和等位基因特異性反向引物進(jìn)行DNA點(diǎn)突變分析在該例子中，實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系中使用了通用分子信標(biāo)探針(U-MB)、通用序列引物和四個(gè)等位基因特異性引物(只有3'末端堿基不同，分別為CVRAXG)，在該例子中待檢測(cè)的樣品是DNA。PCR熱循環(huán)流程例如圖2所示，反應(yīng)步驟參見(jiàn)圖3。步驟l:將引物對(duì)、通用分子信標(biāo)和待測(cè)樣品置于反應(yīng)體系中，然后在合適的條件下發(fā)生退火(或雜交)，即通用分子信標(biāo)與通用序列引物的通用區(qū)結(jié)合，通用序列引物的3'端的特異結(jié)合區(qū)及反向引物結(jié)合于目標(biāo)DNA。步驟2:在DNA聚合酶的作用下，引物發(fā)生延伸反應(yīng)，形成DNA/DNA雙鏈，帶通用區(qū)的弓I物延伸后變成下一個(gè)循環(huán)的反應(yīng)模板分子。步驟3:形成的雙鏈DNA變性，形成單鏈帶有通用序列的互補(bǔ)序列的新模板。步驟4:在合適條件下，通用分子信標(biāo)與新模板上的通用序列互補(bǔ)序列結(jié)合，反向引物結(jié)合于新DNA模板的互補(bǔ)區(qū)域。步驟5:在DNA聚合酶的作用下，會(huì)發(fā)生2種情況(1)發(fā)生延伸反應(yīng)；(2)不發(fā)生延伸反應(yīng)。在第一種情況下，等位基因特異性反向引物3'端與目標(biāo)點(diǎn)匹配互補(bǔ)，發(fā)生延伸反應(yīng)，遇到通用分子信標(biāo)探針后將其取代下來(lái)，形成新的雙鏈DNA。第二種情況則是等位基因特異性反向引物3'端與目標(biāo)點(diǎn)不匹配，不發(fā)生延伸反應(yīng)，或者延伸效率低。步驟6:匹配體系，在通用分子信標(biāo)被取代后，降溫至25。C檢測(cè)熒光強(qiáng)度，分子信標(biāo)恢復(fù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，熒光淬滅，從而產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。不匹配體系，分子信標(biāo)沒(méi)有被取代，熒光強(qiáng)度基本不變或熒光下降較匹配體系有滯后現(xiàn)象。步驟7:重復(fù)步驟4，5和6。在經(jīng)過(guò)若干循環(huán)后，與PCR原理相同，因通用分子信標(biāo)被取代恢復(fù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的可檢測(cè)信號(hào)也是成指數(shù)級(jí)下降的。熒光信號(hào)用實(shí)時(shí)熒光PCR儀Strategene3000p進(jìn)行檢測(cè)。一個(gè)具體應(yīng)用上述方法檢測(cè)DNA點(diǎn)突變的例子是〈乳腺癌p53抑癌基因點(diǎn)突變G—A檢測(cè)〉在該實(shí)施例中，通用分子信標(biāo)、通用序列引物和四個(gè)反向等位基因特異性引物的序列如下通用分子信標(biāo)為5'-FAM-CCGGG(AG)k)CCCGG-DABCYL-3，(SEQIDNo.l)通用序列引物為5，-(CT)10CCGGGGTGTTGTCTCCTAGGTTGGC-3，(SEQIDNo.2)四個(gè)反向等位基因特異性引物5'-GTGGCTCCTGACCTGGAGTN-3，，N=C,T,A,G(SEQIDNo.3、4、5、6)50^L反應(yīng)體系通用序列引物100nM,反向等位基因特異性引物160nM,通用分子信標(biāo)100nM;DNA聚合酶(VentR(exo-)DNA聚合酶)1U，0.4mMdNTPs，6(含0.5嗎左右目標(biāo)DNA)乳腺癌組織樣品DNA提取液PCR方案是94。C預(yù)熱10min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)94°C變性50s，退火50。Clmin，72。C延伸lmin，降溫至25。Clmin檢測(cè)熒光信號(hào)。定義Qt為熒光淬滅5。/。時(shí)對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)。3個(gè)陰性對(duì)照樣分別為不含組織提取DNA的體系，不含反向等位基因特異性引物的體系、不含通用序列引物的體系。檢測(cè)時(shí)使用的檢測(cè)儀器為實(shí)時(shí)熒光PCR儀Strategene3000p，激發(fā)光源為石英鹵鎢燈，波長(zhǎng)為492nm。檢測(cè)結(jié)果用上述引物及相應(yīng)的通用分子信標(biāo)探針在Strategene3000p進(jìn)行擴(kuò)增。野生型樣品對(duì)應(yīng)的等位基因特異性引物3'端為C時(shí)在不同循環(huán)Cdt出現(xiàn)熒光下降信號(hào)，突變型樣品對(duì)應(yīng)的等位基因特異性引物3'端為T時(shí)在不同循環(huán)CdtU5至30個(gè)循環(huán))出現(xiàn)熒光下降信號(hào)，雜合型則等位基因特異性引物3，端為C和T時(shí)在不同循環(huán)Cdt(15至30個(gè)循環(huán))出現(xiàn)熒光下降信號(hào)，而陰性對(duì)照樣品及等位基因特異性引物3'端為G和A的體系下在擴(kuò)增結(jié)束時(shí)(Cdt>40)均未出現(xiàn)熒光下降信號(hào)。實(shí)施例2〈檢測(cè)HBV病毒DNA〉在該實(shí)施例中，通用序列引物、通用分子信標(biāo)和反向引物的序列如下通用分子信標(biāo)為5，-FAM-CCGGG(AG)1()CCCGG—DABCYL-3，(SEQIDNo.l)通用序列引物為5，-(CT)10CCGGGAGTTGGGGGAGGAGATTAG-3，(SEQIDNo.7)反向引物5，-GAAGTCAGAAGGCAAAAACG-3，(SEQIDNo.8)50pL反應(yīng)體系通用序列引物100nM，反向引物160nM,通用分子信標(biāo)100nM,DNA聚合酶(VentR(exo-)DNA聚合酶)1.5U，0.4mMdNTPs，5pL血清DNA提取液。PCR方案是94。C預(yù)熱10min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)94°C變性50s，退火55。C30s，72。C延伸lmin，降溫至25。C1min檢測(cè)熒光信號(hào)。定義(:也為熒光淬滅5%時(shí)對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)。3個(gè)陰性對(duì)照樣分別為不含血清提取DNA的體系，不含反向引物的體系、不含通用序列引物的體系檢測(cè)時(shí)使用的檢測(cè)儀器為實(shí)時(shí)熒光PCR儀Strategene3000p，激發(fā)光源為石英鹵鎢燈，波長(zhǎng)為492nm。檢測(cè)結(jié)果用上述引物及相應(yīng)的通用分子信標(biāo)探針在Strategene3000p進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果加入不同稀釋度陽(yáng)性樣品在不同循環(huán)Cdt(15至35個(gè)循環(huán))出現(xiàn)熒光下降信號(hào)，而陰性對(duì)照樣品在擴(kuò)增結(jié)束時(shí)(Cdt>40)均未出現(xiàn)熒光下降信號(hào)。序列表(SEQUENCELISTING)<110>北京大學(xué)<120>—種通用分子信標(biāo)核酸探針及其檢測(cè)DNA的方法<130>JSP080132<160>8<170>Patentlnversion3.1<210><211><212><213><400>130DNA人工序列1ccgggagagagagagagagagagagcccgg30<210>2<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>2ctctctctctctctctctctccggggtgttgtctcctaggttggc45<210>3<211>20<212>DNA<213〉人工序列<400>3gtggctcctgacctggagtc20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4gtggctcctgacctggagtt20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5gtggctcctgacctggagta20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6gtggctcctgacctggagtg20<210>7<211>44<212>DNA<213>人工序列<400>7ctctctctctctctctctctccgggagttggggg鄉(xiāng)agattag44<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8gaagtcagaaggcaaaaacg20權(quán)利要求1.一種通用分子信標(biāo)核酸探針，其5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，在游離狀態(tài)下形成莖環(huán)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，熒光淬滅，環(huán)部為15-30個(gè)堿基，莖部為4-7對(duì)互補(bǔ)堿基，其中環(huán)部或環(huán)部與5’端莖部或環(huán)部與兩端莖部的序列為一通用序列，當(dāng)探針與該通用序列的互補(bǔ)序列結(jié)合時(shí)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，釋放熒光。2.如權(quán)利要求1所述的通用分子信標(biāo)核酸探針，其特征在于所述環(huán)部為十個(gè)AG的重復(fù)序列。3.如權(quán)利要求1所述的通用分子信標(biāo)核酸探針，其特征在于所述5'端莖部序列為5，-CCGGG-3，。4.一種用于檢測(cè)DNA的通用DNA雜交對(duì)，由權(quán)利要求13中任一權(quán)利要求所述的通用分子信標(biāo)核酸探針和一通用序列引物組成，所述通用序列引物包括下述兩個(gè)部分a)通用區(qū)，位于通用序列引物的5'端并且與通用分子信標(biāo)核酸探針中的通用序列互補(bǔ);b)特異結(jié)合區(qū)，位于通用序列引物3'端，用于與目標(biāo)序列特異性結(jié)合。5.—種檢測(cè)DNA的方法，在實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系中加入通用分子信標(biāo)核酸探針，用正反向引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)，并在PCR的擴(kuò)增熱循環(huán)中，每次延伸之后降溫至25°C檢測(cè)熒光信號(hào)，根據(jù)熒光信號(hào)的變化對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行DNA定性和/或定量分析，其中所述通用分子信標(biāo)核酸探針5'端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，該探針在游離狀態(tài)下形成莖環(huán)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，熒光淬滅，環(huán)部為15-30個(gè)堿基，莖部為4-7對(duì)互補(bǔ)堿基，環(huán)部或環(huán)部與5'端莖部或環(huán)部與兩端莖部的序列為一通用序列；所述正反向引物特異性結(jié)合于目標(biāo)DNA，其中之一為通用序列引物，它包括通用區(qū)和特異結(jié)合區(qū)兩部分，所述通用區(qū)位于通用序列引物的5'端并且與通用分子信標(biāo)核酸探針中的通用序列互補(bǔ)，所述特異結(jié)合區(qū)位于通用序列引物3'端，用于與目標(biāo)DNA特異性結(jié)合；所述通用分子信標(biāo)核酸探針與通用序列引物結(jié)合的Tm值高于通用序列引物與目標(biāo)DNA結(jié)合的Tm值。6.如權(quán)利要求5所述的檢測(cè)DNA的方法，其特征在于所述通用分子信標(biāo)核酸探針的環(huán)部為十個(gè)AG的重復(fù)序列。7.如權(quán)利要求5所述的檢測(cè)DNA的方法，其特征在于所述通用分子信標(biāo)核酸探針的5'端莖部序列為5'-CCGGG-3'。8.如權(quán)利要求5所述的檢測(cè)DNA的方法，其特征在于所述通用分子信標(biāo)核酸探針與通用序列引物結(jié)合的Tm值比通用序列引物與目標(biāo)DNA結(jié)合的L值高2-20。C。9.如權(quán)利要求5所述的檢測(cè)DNA的方法，其特征在于在實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系中所加的通用分子信標(biāo)核酸探針和通用序列引物數(shù)量相等。10.如權(quán)利要求5所述的檢測(cè)DNA的方法，其特征在于在實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系中所加的通用分子信標(biāo)核酸探針、通用序列引物和反向引物的數(shù)量比例為1:1:1.6。全文摘要本發(fā)明提供了一種通用分子信標(biāo)核酸探針及其檢測(cè)DNA的方法。該分子信標(biāo)的環(huán)部或環(huán)部與5’端莖部或環(huán)部與兩端莖部的序列為一通用序列，與一通用序列引物的5，端互補(bǔ)，而該引物的3’端含有與目標(biāo)DNA特異結(jié)合的序列。在實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系中加入通用分子信標(biāo)核酸探針，用通用序列引物和反向引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)，并在PCR擴(kuò)增熱循環(huán)中，每次延伸之后降溫至25℃檢測(cè)熒光信號(hào)，可根據(jù)熒光信號(hào)的變化對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行DNA定性和/或定量分析。該方法可通用、低廉、靈敏、準(zhǔn)確地應(yīng)用于各種基因檢測(cè)體系，不僅操作方便，而且費(fèi)用大大降低，對(duì)于各種疾病早期檢測(cè)、療效評(píng)價(jià)、人群普查及遺傳分析等均有很高的實(shí)用價(jià)值。文檔編號(hào)C12N15/11GK101603077SQ200810114619公開(kāi)日2009年12月16日申請(qǐng)日期2008年6月11日優(yōu)先權(quán)日2008年6月11日發(fā)明者晨宋,李元宗,李曉敏,趙美萍申請(qǐng)人:北京大學(xué)