專利名稱：：檢測馬感染病毒的基因芯片、制備及檢測方法、試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及檢測馬感染病毒病原體的基因芯片、芯片的制備方法、檢測方法和檢測用試劑盒。
背景技術(shù)：
：馬傳染性鼻肺炎、馬傳染性動脈炎、馬傳染性貧血被我國農(nóng)業(yè)部列為二類動物傳染病，狂犬病是重要的人畜共患病，也是世界各國動物檢疫部門重點防范的動物傳染病，我國質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫局將其列為馬屬動物出入境檢驗檢疫的必檢疫病。常規(guī)的馬傳染性病毒檢測技術(shù)包括微生物培養(yǎng)技術(shù)、免疫技術(shù)、PCR技術(shù)等，這些技術(shù)存在如下缺陷微生物培養(yǎng)技術(shù)繁瑣而費時；免疫技術(shù)要有特異性強的抗血清；PCR技術(shù)本身的優(yōu)越性無可厚非，但反應(yīng)條件控制不當很容易引起交叉污染，出現(xiàn)假陽性。隨著動物的國際貿(mào)易和賽馬的國際交流日益頻繁，常規(guī)的檢測方法越來越不適應(yīng)大規(guī)模出入境動物檢疫的的要求，迫切需要可靠、快速、高通量的新技術(shù)?；蛐酒址QDNA芯片或基因微矩陣，是20世紀90年代發(fā)展起來的前沿生物技術(shù)。其基本原理是將大量的靶基因片段有序地、髙密度地排列在玻片、硅等載體上，應(yīng)用已知核酸序列作為探針與互補的靶核苷酸序列雜交，用芯片掃描儀檢測熒光等信號后，通過計算機軟件進行數(shù)據(jù)比較和分析。一次試驗就可檢測多種基因，具有高速度、高通量、微型化、并行處理易于自動化等優(yōu)越性，是動物傳染病檢疫技術(shù)的一個巨大的飛躍。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測馬感染病毒病原體的基因芯片，以彌補傳統(tǒng)的檢測方法技術(shù)存在的不足。本發(fā)明的另一個目的是提供檢測馬感染病毒病原體的基因芯片的制備方法。本發(fā)明的更進一步的目的是提供一種利用上述基因芯片來快速、準確、靈敏地檢測馬感染病毒病原體的方法。本發(fā)明還有一個目的是提供用于檢測馬感染病毒病原體的試劑盒。為達到上述的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明的檢測馬感染病毒病原體的基因芯片包括固相載體硝酸纖維素膜和固定在該載體上的寡聚核苷酸探針，其中寡聚核苷酸探針包括檢測探針和質(zhì)量控制探針，芯片樣品點的布局為低密度布局，樣品點少于200個;所述的寡聚核苷酸檢測探針是從狂犬病病毒、馬傳染性動脈炎病毒、馬傳染性彝肺炎病毒和馬傳染性貧血病病毒中的至少一種病毒基因組對應(yīng)的核苷酸序列中選取的核酸片段。其中一個優(yōu)選的技術(shù)方案是所述的寡聚核苷酸檢測探針包括從狂犬病病毒、馬傳染性動脈炎病毒、馬傳染性鼻肺炎病毒和馬傳染性貧血病病毒基因組的對應(yīng)核苷酸序列中選取的核酸片段。本發(fā)明的技術(shù)方案中所述的檢測探針分別具有以下序列從狂犬病病毒基因組核苷酸序列中選取的核酸片段具有如序列表中SEQIDN0:5所示的堿基序列；從馬傳染性動脈炎病毒基因組核苷酸序列中選取的核酸片段具有如序列表中SEQIDNO:6所示的堿基序列；從馬傳染性鼻肺炎病毒基因組核苷酸序列中選取的核酸片段具有如序列表中SEQIDNO:7所示的堿基序列;從馬傳染性貧血病病毒基因組核苷酸序列中選取的核酸片段具有如序列表中SEQIDN0:8所示的堿基序列。本發(fā)明的制備檢測馬傳染病病毒病原體的基因芯片的方法，包括以下步驟(1)檢測探針的設(shè)計經(jīng)Genbank檢索，BLAST序列比對分別得到狂犬病病毒、馬傳染性動脈炎病毒、馬傳染性鼻肺炎病毒和馬傳染性貧血病病毒基因組對應(yīng)的核苷酸序列中的相對保守區(qū)，作為靶序列，依據(jù)探針設(shè)計原則，采用PriraerPremier5.0和01igo6.0軟件，分別在此保守區(qū)內(nèi)設(shè)計針對病原體的特異性檢測探針；(2)檢測探針的合成由專門的生物公司合成上述設(shè)計好的探針片段序列；(3)芯片的制備包括切膜、貼膜，然后將上述得到的檢測探針點膜，紫外交聯(lián)10分鐘，再經(jīng)存膜即得芯片，其中點膜后得樣品點直徑在200um—1000um。上述基因芯片的制備方法中，所述的相對保守區(qū)的序列如下狂犬病病毒基因組核苷酸序列中的相對保守區(qū)具有如序列表中SEQIDNO:1所示的堿基序列；馬傳染性動脈炎病毒基因組核苷酸序列中的相對保守區(qū)具有如序列表中SEQIDN0:2所示的堿基序列；馬傳染性鼻肺炎病毒基因組核苷酸序列中的相對保守區(qū)具有如序列表中SEQIDN0:3所示的堿基序列；馬傳染性貧血病病毒基因組核苷酸序列中的相對保守區(qū)具有如序列表中SEQIDN0:4所示的堿基序列。所述的檢測探針即為上述從狂犬病病毒、馬傳染性動脈炎病毒、馬傳染性鼻肺炎病毒和馬傳染性貧血病病毒的基因組對應(yīng)的核苷酸序列中選取的核酸片段，其序列分別如下狂犬病病毒的檢測探針具有序列表中SEQIDN0:5所示的堿基序列，馬傳染性動脈炎病毒的檢測探針具有序列表中SEQIDN0:6所示的堿基序列，馬傳染性鼻肺炎病毒的檢測探針具有序列表中SEQIDN0:7所示的堿基序列，馬傳染性貧血病病毒的檢測探針具有序列表中SEQIDN0:8所示的堿基序列；本發(fā)明馬感染病毒病原體的檢測方法包括以下的歩驟(1)待測樣*^:翻常;t:!Jil^^^取待測脾品的RNA，進fi^^P標記PCR擴增；(2)雜交顯色；將歩驟(1)得到的標記后的PCR產(chǎn)物和權(quán)利要求1、2或3所述的基因芯片進行雜交，然后顯色；(3)結(jié)果閱讀與分析利用生物芯片閱讀儀獲取雜交信號并分析鑒定雜交結(jié)果。由于歩驟(1)中提取的待測樣品的RNA^^"蔬附尋的cDNA^M樹氐，必領(lǐng)針對^IE序列進衍示記PCR擴增，然后進行雜交。根據(jù)J^&相對保守區(qū)的序列，即耙序列，設(shè)計以下引物用于標記PCR擴增擴增SEQIDN0:1所用的一對引物的序列如序列表中的SEQIDN0:9和NO:IO所示；擴增SEQIDN0:2所用的一對引物的序列如序列表中的SEQIDNO:ll和NO:12所示;擴增SEQIDN0:3所用的一對引物的序列如序列表中的SEQIDNO:13和NO:14所示；擴增SEQIDN0:4所用的一對引物的序列如序列表中的SEQIDN0:15和N0:16所本發(fā)明的用于檢測馬感染病毒病原體的試劑盒包括上述基因芯片、待測樣品處理試劑、雜交和顯色試劑，以及說明書。本發(fā)明具體的實施方案如下一、基因芯片的制備1.檢測探針的設(shè)計和合成(l)檢測探針的設(shè)計經(jīng)Genbank檢索，BLAST序列比對分別得到狂犬病病毒、馬傳染性動脈炎病毒、馬傳染性鼻肺炎病毒和馬傳染性貧血病病毒基因組對應(yīng)的核苷酸序列中的相對保守區(qū)，作為靶序列，依據(jù)探針設(shè)計原則，采用PrimerPremier5.0和01igo6.0軟件，分別在此保守區(qū)內(nèi)設(shè)計針對病原體的特異性的檢測探針；所述的檢測探針分別具有如下所述的序列狂犬病病毒的檢測探針為序列表中SEQIDN0:5所示的堿基序列，馬傳染性動脈炎病毒的檢測探針為序列表中SEQIDN0:6所示的堿基序列，馬傳染性典肺炎病毒的檢測探針為序列表中SEQIDNO:7所示的堿基序列，馬傳染性貧血病病毒的檢測探針為序列表中SEQIDN0:8所示的堿基序列。(2)檢測探針的合成由專門的生物公司合成上述設(shè)計好的探針片段序列。得到探針片段后，配置探針溶液，準備芯片點樣。2、芯片的制備(1)切膜選用合適的硝酸纖維素膜，于切膜機中準確裁剪成方形芯片。規(guī)格1.5cmX1,5cnu(2)貼膜將芯片用膠固定于1.5cmX1.5cm芯片方皿中，使之緊貼芯片方皿底部，放置2分鐘，膠凝固后，芯片平整地貼于芯片方皿底部，在芯片方皿的邊框上作一定向標志或編號。(3)點膜對探針分布進行合理布局，設(shè)質(zhì)控點。再將已配制好的探針溶液逐個加入與已布局好的點樣針相應(yīng)位置的探針盤孔中。每種探針點兩針，點樣時將點樣儀推拉桿推到吸樣位置，點樣針與探針盤孔對準，按下頂部按鈕，吸取探針(樣品)液，停留3-5秒，吸樣完畢，放松按鈕，點樣針架自動彈起。然后將點樣儀推拉桿推到點樣位置，此時已吸液的點樣針對準芯片方皿中的膜片，按下按鈕，停留3-5秒，放松按鈕，點樣針架自動彈起。重復(fù)此操作1-3次，點樣完畢。(4)存膜點樣完畢，待芯片自然干燥，將芯片方皿放置紫外燈下照射10分鐘，封裝4"C保存。(5)芯片布局如圖1質(zhì)控主要指從芯片制備到樣本處理,到雜交掃描各環(huán)節(jié)的監(jiān)控，目前主要的控制包括1)點樣過程質(zhì)控用于監(jiān)控點樣過程，采用有色染料，該染料在芯片雜交過程中將被洗掉，因而不會對芯片檢測結(jié)果造成影響；2)雜交質(zhì)控用生物素點于芯片上，監(jiān)控顯色過程；3)空白對照是不含任何基因片段的空白點樣液，作為芯片制備過程中的污染監(jiān)控指標。本實驗中采用1倍的點樣緩沖液；4)陰性內(nèi)參(質(zhì)控探針)是一段與檢測基因沒有同源性的其他基因片段，作為雜交過程中非特異性雜交的監(jiān)控指標；本發(fā)明的基因芯片所需的陰性內(nèi)參探針序列為5'-CTGGCGMTCTGAATGCAGTTTMCGGCTCAACCAAGTTGAACTCAGACGC-3'(序列表中的SEQIDNO:18)，由專門的生物公司合成上述探針片段序列。5)陽性內(nèi)參(質(zhì)控探針)是一段與檢測基因沒有同源性的其他基因片段，在4種常見病毒病原體擴增的同時可以擴增該序列片段，作為PCR擴增過程中的對照，主要用于PCR擴增標記過程的監(jiān)控。4^fit^a:片0iTOffi14rtl^W^:5'-TTTGGGGTGCTTGATGAACAATTACATCGTAATAGGGGCTACAGAGATAGA-3'(序列表中的SEQIDNO:17)，由專門的生物公司合成上述探針片段序列。二、芯片的使用以下，通過基因芯片在檢測馬感染病毒病原體的試劑盒中的使用，進一步詳細說明馬感染病毒病原體的檢測方法。1、試劑盒組成(1〉樣本處理試劑病毒處理液l:TRIzol(市售產(chǎn)品，酚與異硫氣酸胍組成的均相溶液)，35ml:病毒處理液2:氣仿，10ml:病毒處理液3:異丙醉，30ml;病毒處理液4:75%乙醇，50ml。(2)樣本的反轉(zhuǎn)錄試劑dNTPs(脫氧核苷三磷酸)50jxl:隨機引物(Randomprimer):25)il:DEPC(diethypyrocarbonate,焦碳酸二乙酯)處理水(DEPC處理過并經(jīng)高溫髙壓消毒的超純水)227^1;Rnasin(核糖核酸酶抑制劑)25^1;M-MLV(—種來自鼠白血病病毒的逆轉(zhuǎn)錄瞎)25jil;5xM-MLV緩沖液lOOjxl。(3)PCR體系組分PCR反應(yīng)液1:PCRMIXIIOOjiL，包括引物、生物素、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP、10XPCRbuffer、無菌鄉(xiāng)；酶l:Taq酶4fiL+UNG酶(尿嘧啶DNA糖基化酶，1U1)24fiL;PCR陰性對照(超純水，用MilliQ純水儀制備)lmlX3管；PCR陽性對照(狂犬病病毒、馬傳染性動脈炎病毒、馬傳染性鼻肺炎病毒、馬傳染性貧血病病毒四種病毒的質(zhì)粒的混合物)lmlX3管，陽性對照制備的方法如下牛肉湯培養(yǎng)基的準備將10g蛋白胨、5g氯化鈉、3g牛肉裔溶解在1升水中，用10%氫氧化鈉將其pH調(diào)至7.0，分裝，121X:滅菌20分鐘，備用。下面以狂犬病病毒為例說明陽性對照制備的過程:狂犬病病毒樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR擴增，所得的PCRJ^(IG^iJ)細市售的多功能脆純化tftW^^6化，純tt^糊^HH^傖^ttia^f-菌內(nèi)，其彌毒&mtig^mfca^ifif內(nèi)，娜!I了醣含^m^0M^爐T菌。在預(yù)先用紫外燈照射30分鐘的生物安全柜中，用接種環(huán)將大腸桿菌接種在無菌的牛肉湯培養(yǎng)基中，220轉(zhuǎn)/分鐘，371C,培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)過夜的菌液收集后，采用質(zhì)粒提取試劑盒進行質(zhì)粒提取。將所得各質(zhì)粒分別用紫外分光光度計定量，計算拷貝數(shù)，稀釋成表1中記錄的濃度后，分裝，備用。將四種質(zhì)粒等體積混合，即得陽性對照。表l四種質(zhì)粒各自稀釋后的濃度病毒名稱質(zhì)粒濃度(copies/u1)狂犬病病毒5X106馬傳染性動脈炎病毒5X108馬傳染性鼻肺炎病毒5X10e馬傳染性貧血病病毒5X106(4)雜交試劑預(yù)雜交液12ml，含有甲酰胺(DMF)50%(體積比)，20XSSC25%(體積比)，50XDenhartds10%(糊比)，魚精DNA(10mg/ml)5%(條比)，1MPBS(pH6.4)5%(柳比)，0.1MEDTA5%(糊比)；雜交液12ml,含有甲酰胺(DMF)45%(條比)，20XSSC25%(鄉(xiāng)比)，50XDenhartds2%(條比)，魚精DNA(10mg/ml)2%(條比)，1MPBS(pH6.4)2%(體積比)，20%硫酸葡聚糖鈉24%(體積比)；洗液l:2XSSC20ml,含有20XSSC10%(體積比)，10%SDS1%(休積比)，蒸餾水89%(體積比)；洗液2:0.1XSSC20ml，含有20XSSC0.5%(體積比)，10%SDS1%(體積比),蒸餾水98.5%(體積比)封閉液20ml:0.75gBSA溶于17.5ml蒸餾水中，加入2.5mllMTris-HClpH7.5:酶聯(lián)緩沖液40ml:Tris-HCl0.1MpH7.5，MgCl22nM，TritonX-100O.娜(柳比〉，NaCl1.0M;酵2:親和素-堿性磷酸酶(SAv-AP)0.01ml;終止液12ml0.1MEDTA;底物緩沖液10ml,含Tris-HC10.1MpH9.5,MgCl25mM，NaCl0.1M;底物l:5-溴-4-氮-3-吲哚磷酸(BCIP)0.05ml,2.5mgBCIP溶于0.05mlDMF中；底物2:氣藍四唑(NBT)0.05ml，3.75mgNBT溶于0.05ml70%DMF中。注20XSSC:NaCl17.55%，二水合擰據(jù)酸三鈉8.8296，pH7.0;1MPBS:NaC10.挑，KC]0.02%,Na2HPO<'12H200.144%，KH2P0412H200.024%,pH6.4;0.1MEDTA:EDTA3.72%，pH8.0;1MTris-HClpH7.5:Tris12.Mb,MgCl20.19%,TritonX-100O.O戰(zhàn)(糊比)，NaCl5.8%;EDTA:乙二胺四乙酸SDS:十二烷基磺酸鈉(Sodi咖dodecylsulfate,SDS)PBS:—種磷酸鹽緩沖液。BSA:牛血清白蛋白TritonX-100:聚乙二醇辛基苯基醚。(5)采樣工具真空采血管。(6)點好探針的芯片18張。2、樣本處理(1)樣本的收集及處理1)樣本使用類型血液；2)樣本的釆集采用帶有抗凝劑的真空釆血管收集馬血l-3ml,密閉送檢；3)樣本的保存和運送樣本可立即用于測試，也可保存于-80TC待測。(2)樣本RNA的提取1)在1.5ml用DEPC水處理過的EP管中加入馬血300mL，再加入Trizol700PL,充分混勻，室溫放置10分鐘；2)加入200W的氣仿，蓋緊離心管蓋，用力髏蕩離心管，室溫放置3-5分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，4C離心15分鐘，取上層液相移入另一管；3)加入等體積異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，室溫放置10分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，4X:離心15分鐘，小心吸去所有上淸4)以lml75%乙醇洗一遍，7500轉(zhuǎn)/分鐘，4匸離心5分鐘，棄上清，在超凈臺中干燥5分鐘，加入10WDEPC處理水溶解。(3)樣本RNA的逆轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄體系及程序如下總RNA1dNTP(2.5mM)2ul隨機引物1p1DEPC水9u1651C變性5分鐘，立即置冰上冷卻1分鐘，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，再加入以下試劑混勻5XM-MLV緩沖液4ii1RNasin1p1M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶lnl共20ul然后在42"C反轉(zhuǎn)錄1小時，701C15分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶。(4)樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的feiaPCR擴增依據(jù)下表所示的PCR體系,加入各種組分,同時配制陰、陽性對照質(zhì)控體系，然后在漩渦振蕩器上振蕩混勻，接著在離心機上快速離心10秒，最后放入PCR儀中按表3所述的反應(yīng)程序進行擴增。注陽性對照反應(yīng)體系中的模板為2W陽性對照品，其他組分不變；檢測反應(yīng)體系中的模板為2rt待檢樣品DNA，其他組分不變；陰性對照反應(yīng)體系中的模板為2(4陰性對照,其他組分不變。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表中陽性內(nèi)參引物的序列上游引物5'-GGCATACAGTCCTCATCCAG-3'(序列表中的SEQIDNO:19)，下游引物5'-ACGGCTCTTCCCTCCAAG-3'(序列表中的SEQIDNO:20)，表3PCR反應(yīng)程序<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>3、雜交、顯色(1)預(yù)雜交在裝有基因芯片的方形小皿上寫上樣品編號(包括待測樣品和陰、陽性對照樣品)，向小皿中加入450J4預(yù)雜交液，置雜交儀上40r預(yù)雜交30分鐘(2)雜交在預(yù)雜交過程中，將PCR產(chǎn)物置于PCR儀中變性10分鐘，然后立刻置于冰水浴10分鐘，在雜交小皿中加450J4雜交液，將PCR產(chǎn)物加入雜交小皿中于461C雜交90分鐘(3)洗滌分別用2XSSC洗滌液450jil將雜交芯片洗滌兩次，再用O.IXSSC洗煤液450W將雜交芯片洗滌兩次，每次各3分鐘；(4)封閉向雜交芯片中加入400Hl封閉液，置雜交儀上于40"C封閉20分鐘(5)酶聯(lián)取適量的酶聯(lián)緩沖液，按SAv-AP:嗨聯(lián)緩沖液-l:1200比例加入SAvAP，振蕩混勻，取混和液400J4加入雜交芯片中，置雜交儀上于401C酶聯(lián)反應(yīng)20分鐘:(6)洗錄取400W的酵聯(lián)緩沖液將雜交芯片洗滌3次，每次3分鐘；(7)顯色配制顯色液(400W底物緩沖液+2WBCIP+2WNBT)，在小皿中加入400^1顯色液，40"顯色3分鐘，隨時觀察雜交芯片上的顯色情況及本底深淺；(8)終止顯色用終止液終止顯色，然后用蒸館水反復(fù)沖洗數(shù)次；(9)放于芯片閱讀儀上閱讀結(jié)果。4、結(jié)果閱讀(1)適用于和利時全自動芯片成像分析儀。(2)雜交完畢后，將需要閱讀的芯片連同芯片載盤一起取出，放入芯片分析儀中，并固定載盤。(3)打開分析儀開關(guān)，登錄實驗員帳號進入主界面，選擇"芯片分析"，進入芯片選擇界面，選取待分析芯片所對應(yīng)的載盤位號。(4)點擊"下一步"進入芯片預(yù)處理和條形碼讀取界面，若有儀器無法識別的條形碼需在條形碼輸入界面中手動輸入條形碼編號(輸入條形碼號時注意芯片類型是否正確)。(5)輸入完成后點擊"保存"，然后"開始分析"，分析所得結(jié)果可于"結(jié)果處理"選項中査詢，也可直接生成報告單打印或傳輸?shù)脚c此成像分析儀相連的PC機上的配套管理軟件中。(6)分析儀會經(jīng)過閱讀和計算得出各點檢測值，并與參考值(Cutoff值)進行比較得檢測結(jié)果。結(jié)果類型如下+:陽性一陰性芯片污染空白對照點檢測值髙于參考值，該樣本需重新檢測。非特異陰性內(nèi)參點的檢測值高于參考值，該樣本需重新檢測。實驗失敗陽性內(nèi)參點的檢測值低于參考值，該樣本需重新檢測。注推薦使用軟件進行結(jié)果分析，可減少人為誤差影響。本發(fā)明方法能在短時間內(nèi)檢測4種馬感染病毒病原體基因,快速準確地獲取樣品中的信息，檢測效率是傳統(tǒng)檢測手段的數(shù)十倍。本發(fā)明提供了一整套芯片的制備雜交顯色過程。本發(fā)明提供了完整的探針排布，優(yōu)化方案。此方案依據(jù)實例調(diào)整，具有合理性。芯片可大規(guī)模生產(chǎn)，無污染。此發(fā)明質(zhì)量、精度、效率比傳統(tǒng)病毒檢測方法均有提髙,易于加工操作，使用簡便。圖1馬病毒檢測芯片設(shè)計模式圖質(zhì)控點女點樣過程質(zhì)控；令雜交質(zhì)控園陽性內(nèi)參；口陰性內(nèi)參；☆空白對照檢測探針①狂犬?、隈R傳染性動脈炎③馬傳染性貧血④馬傳染性異肺炎。圖2為馬病毒檢測陽性結(jié)果。為進一歩說明本發(fā)明用于檢測馬病毒的基因芯片及其檢測方法，特舉以下的實施例進行說明，該實施例是為了解釋而不是以任何方式限制本發(fā)明。具體實施例方式實施例1狂犬病毒(faA/asw'/us>)DEFINITIONRabiesvirusisolateJiangsu_WxO(H)nucleoprotein(N)gene,completecds.檢測探針的設(shè)計與合成一、設(shè)計通過文獻檢索及美國國家生物信息中心(NCBI)的比對獲得該病毒病原體的檢測探針。第一步，根據(jù)大量的前期文獻調(diào)研，確定了該病原體的目標基因。經(jīng)Genbank檢索，BLAST序列比對得到相對保守區(qū)(靶序列)；第二步，依據(jù)探針設(shè)計原則，采用Pri鵬rPremier5.0和01igo6.0軟件，在此保守區(qū)內(nèi)設(shè)計針對病原體的檢測探針得到檢測探針的序列后，由專門的生物公司去合成相應(yīng)的探針片段。相應(yīng)的核酸序列如下以下是從狂犬病毒基因組核酸序列中選取的的相對保守區(qū)(靶序列)片段l(SEQIDNO:l)CATGTTTTTCTCCCGGATTGAGCATCTATATTCAGCAATCAGAGTGGGCACAGTTGTCACTGCTTATGAAGACTGTTCAGGACTGGTATCATTCACTGGGTTCATAAAACAAATCAATCTCACCGCTAGAGAGGCAATACTATATTTCTTCCACAAGAACTTTGAGGAAGAGATAAGAAGAATGTTTGAGCCAGGGCAGGAGACAGCTGTTCCTCACTCTTATTTCATCCACTTCCGTTCACTAGG將上述病毒片段1輸入軟件PrimoMultiplex3.4MultiplexPCRPri鵬rDesign,設(shè)定好參數(shù)，運行程序，(5'PRIMER0-2003'PRIMER-200-0TM:57XITMFormulaNearestN%GC50ANYCheckpri鵬r-primerdimmerAvoidbackgroungprimingMultiplexPCR5SpecificityMedium其余參數(shù)為默認值。)選取長度合適的計算結(jié)果，最終作為病毒的檢測探針片段。該檢測探針為TCCACAAGAACTTTGAGGAAGAGATAAGMGAATGTTTGAGCCAGGGCAGGAGA(SEQIDN0:5)二、合成由專門生物公司人工合成上述探針。實施例2馬傳染性動脈炎病毒(Equinearteritisvirus)DEFINITIONEquinearteritisvirusisolateDK-labproteinmRNA,completecds.探針的設(shè)計與合成方法同實施例l,選取的馬傳染性動脈炎病毒基因組核酸序列的相對保守區(qū)(靶序列)為片段2(SEQIDN0:2)TTCACAGACTTCACCTTGTGTATGCTGACGGATCGCGGCGTTATTGCCAATTTGCTGCGATATGATGAGCACACTGCTTTGTACAATTGTTCCGCCAGTAAAACCTGTTGGTATTGCACATTCCTGGACGAACAGATTATCACGTTTGGAACCGATTGTGATGACACCTACGCGGTCCCAGTTGCTGAGGTCCTGGAACAGGCGCATGGACCGTACAGTGCGCTGTTTGATGACATGCCCCCTTTTATTTACTATGGCCGTGAATTCGGCATAGTTGTGTTGGATGTGTTTATGTTCTATCCCG選取的檢測探針為TGCACATTCCTGGACGAACAGATTATCACGTTTGGAACCGATTGTGATGACACC(SEQIDN0:6)實施例3馬傳染性鼻肺炎病毒(Equineherpesvirus1)DEFINITIONEquineherpesvirus1strainV592,completegenome.探針的設(shè)計與合成方法同實施例l，選取的馬傳染性鼻肺炎病毒基因組核酸序列的相對保守區(qū)(靶序列)為片段3(SEQIDNO:3)GCCGCCTTTGAGATTGACATCCTACTGCCCAGTGACCTATCTCCCGCTGACCTGTCAGCTCTTCAAAAATGCGAGGGTAAGCTTGTGTTTTTGACCGCTCTGCGTCGTCGCGTGATGCTCTCCAGCGTCACCCTCTCGTCATACTATGTCAACGGCGCACCCCCGGACACGCTATCCCTGATGGCGGCGTTTCGTAGGCGTTTTCCCGCTATAATACAGCGCGTGCTGCCCAACAAAATGATAGCCGCCGCCCTGGGAGTCGCACCGCTTCCTCCCGGGGCGTTCATACAGAACACAGGCCCGTTTGACCTGTGCAACGGGGACTCTGTGTGCGCGCTGCCTCCCATTTTGGACGTGGAGGACAAGCTGCGCCTAGGATCTGTGGGCGAGGM根據(jù)片段3設(shè)計的檢測探針為GCTCTGCGTCGTCGCGTGATGCTCTCCAGCGTCACCCTCTCGTCATACTATGTC(SEQIDNO:7)實施例4馬傳染性貧血病病毒(Equineinfectiousanemiavirus)DEFINITIONEquineinfectiousanemiavirusisolatewrev6revprotein(rev)mRNA,partialcds。探針的設(shè)計與合成方法同實施例l,選取的馬傳染性貧血病病毒基因組核酸序列的相對保守區(qū)(靶序列)為片段4:(SEQIDN0:4)CCCAACACAACATACACCTAGCAGGCGTGACCGGTGGATCAGGGGACAAATACTACMGCAGAAGTACTCCAGGAACGACTGGAATGGAGAATCAGAGGAGTACAACAGGCGGCCAAAGAGCTGGGTGAAGTCAATCGAGGCATTTGGAGAGAGCTATATTTCCGAGAAGA檢測探針為AACGACTGGAATGGAGAATCAGAGGAGTACAACAGGCGGCCAAAGAGCTGGGT(SEQIDNO:8)。實施例5檢測馬感染病毒病原體的基因芯片的制備1、探針定量用紫外分光光度計定量實施例1-4合成的檢測探針以及合成的陰、陽性內(nèi)參質(zhì)控探針，然后將探針稀釋成50ng/ul,準備芯片點樣，探針的點樣量為50nl。2、切膜選用合適的硝酸纖維素膜，于切膜機中準確裁剪成方形芯片。規(guī)格1.5cmX1.5cnic3、貼膜將芯片用膠固定于1.5cmX1.5cm芯片方皿中，使之緊貼芯片方皿底部，放置2分鐘，膠凝固后，芯片平整地貼于芯片方皿底部，在芯片方皿的邊框上作一定向標志或編號。4、點膜按下列芯片布局對探針進行點樣。點樣時將已配制好的探針溶液逐個加入與已布局好的點樣針相應(yīng)位置的探針盤孔中。每種探針點兩針，點樣時將點樣儀推拉桿推到吸樣位置，點樣針與探針盤孔對準，按下頂部按鈕，吸取探針(樣品)液，停留3-5秒，吸樣完畢，放松按鈕，點樣針架自動彈起。然后將點樣儀推拉桿推到點樣位置，此時巳吸液的點樣針對準芯片方皿中的膜片，按下按鈕，停留3-5秒，放松按鈕，點樣針架自動彈起。重復(fù)此操作1-3次，點樣完畢。芯片布局如圖l所示注點樣過程質(zhì)控所用試劑為有色染料；雜交質(zhì)控所用試劑為生物素；空白對照所用試劑為1倍的點樣緩沖液(10%海藻糖溶液)；陰、陽性內(nèi)參質(zhì)控探針的序列及合成如以上本發(fā)明具體的實施方案fiT基因芯片制備"一節(jié)中所述。5、交聯(lián)把點好樣的芯片放入在紫外燈下照射10分鐘，封裝后4TC保存。實施例6試劑盒在四種病毒檢測中的應(yīng)用1、樣本的處理過程-(1)用帶有抗凝劑的真空釆血管收集病馬馬血13ml。(2)取DEPC處理的1.5mlEP管，為被檢樣品處理管，在被檢樣品處理管中加入馬血300ML,再加入Trizol700HL，充分混勻，室溫放置10分鐘。(3)加入200til的氯仿，蓋緊離心管蓋，用力簾蕩離心管，室溫放置3-5分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，4X:離心15分鐘，取上層液相移入另一管。(4)加入等體積異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，室溫放置10分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，41C離心15分鐘，小心吸去所有上清。(5)以lml759i乙酵洗一遍，7500轉(zhuǎn)/分鐘，4"離心5分鐘，棄上清，在超凈臺中干燥5分鐘，加入1(WLDEPC處理水溶解。(6)所得產(chǎn)物即為RNA，產(chǎn)物RNA要進行逆轉(zhuǎn)錄。(7)樣本RNA的逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄體系及程序如下反應(yīng)體系總RNA2uldNTP(2.5mM)2nl隨機引物lwlDEPC處理水9ul將上述反應(yīng)體系在65"變性5分鐘，立即置冰上冷卻l分鐘，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，再加入以下試劑混勻5XM-MLV緩沖液4ulRNasin1li1M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1ii1共20u1混勻后在42^C反轉(zhuǎn)錄lhour，7(TC15分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶。所得產(chǎn)物為cDNA，之后進行cDNA的標記PCR擴增。(8)4種病毒病原體反轉(zhuǎn)錄后的cDNA進行標記PCR擴增標記PCR擴增的反應(yīng)體系和程序按本說明書的具體實施方案中所述進行，循環(huán)條件和次數(shù)如下10min94t:3min9化35s'56°C35s卜40次循環(huán)72t:45s-10min(9)PCR標記產(chǎn)物變性PCR循環(huán)后的產(chǎn)物置PCR儀中99"加熱變性10分鐘，然后迅速放入冰上驟冷10分鐘。2、雜交、顯色(1)預(yù)雜交在裝有基因芯片的方形小皿上寫上樣品編號(包括待測樣品和陰、陽性對照樣品)，向小皿中加入450H1預(yù)雜交液，置雜交儀上40C預(yù)雜交30分鐘。(2)雜交在預(yù)雜交過程中，將PCR產(chǎn)物置于PCR儀中變性10分鐘，然后立刻置于冰水浴10分鐘，在雜交小皿中加450H1雜交液，將PCR產(chǎn)物加入雜交小皿中于46"C雜交90分鐘。(3)洗滌分別用2XSSC洗滌液450W將雜交芯片洗滌兩次，再用O.IXSSC洗滌液450H1將雜交芯片洗滌兩次，每次各3分鐘。(4)封閉向雜交芯片中加入40(M封閉液，置雜交儀上于401C封閉20分鐘。(5)酶聯(lián)取適量的酶聯(lián)緩沖液，按SAv-AP:酶聯(lián)緩沖液-l:1200比例加入SAv-AP,振蕩混勻，取混和液400W加入雜交芯片中，置雜交儀上于40r酶聯(lián)反應(yīng)20分鐘。(6)洗滌取400W的酶聯(lián)緩沖液將雜交芯片洗滌3次，每次3分鐘。(7)顯色配制顯色液(400W底物緩沖液+2WBCIP+2WNBT),在小皿中加入400W顯色液，40X:顯色3分鐘，隨時觀察雜交芯片上的顯色情況及本底深淺。(8)終止顯色用終止液終止顯色，然后用蒸餾水反復(fù)沖洗數(shù)次。(9)放于芯片閱讀儀上閱讀結(jié)果。3、結(jié)果觀察結(jié)果見圖2，按照本試劑盒的檢測方法操作，芯片雜交后各點的顯色情況較好。芯片閱讀結(jié)果馬病毒病原體基因芯片檢測結(jié)果戶主姓名李陽送檢單位北京檢疫局采樣時間20071204病畜ID:07120401牲畜類別馬送檢醫(yī)生王奇檢測時間2007-12-19樣本編號07120401畜齡3年臨床診斷:馬傳貧樣本類型馬血芯片ID:040000000023中文名稱結(jié)果參考值馬傳染性鼻肺炎病毒陽性陰性馬傳染性動脈炎病毒陽性陰性馬傳染性貧血病毐陽性陰性狂犬病病毒陽性陰性錄入時間加07-12-19報告時間2007-12-19檢驗者左靜審核者梁濤注此報告只對本樣本負責！SEQUENCELISTING<110〉北京愛普益生物科技有限公司<120〉檢測馬感染病毒病原體的基因芯片、試劑盒及其制備方法、檢測方法<130〉SGF<歸20<170〉PatentInversion3.2<210〉1<211〉246<212>■<213〉狂犬病毒<400>1catgtttttctcccggattgagcatctatatgcttatgaagactgttcaggactggtatccaccgctagagaggcaatactatatttcttaatgtttgagccagggcaggagacagctgtsct鄉(xiāng)<210>2<211>304<212〉DNA〈213〉馬傳染性動脈炎病毒<.2ttcacagacttcaccttgtgtatgctgacgtatgatgagcacactgctttgtacaattgtttcctggacgaacagattatcacgtttggagttgctg鄉(xiāng)tcctgg肪ceiggcgcatggaccttttatttactatggccgtgaattcggccccg<210>3<211>393<212>DNA<213>馬傳染性鼻肺炎病毒ttcagcaatcagagtgggcacagttgtcac60attcactggg11cataaaac120ccacaagaactttgaggaagagataagaag180"tcctcactcttatttcatccacttccgttc240246gatcgcggcgttattgccaatttgctgcga60tccgccagtaaaacctgttggtattgcaca120accgattgtgatgacacctacgcggtccca180ccgtapagtgcgctgtttgatgacatgccc240atagttgtgttggatgtgtttatgttcta/t300304<400〉3gccgcctttgagattgacatcctactgcccagtgacctatctcccgctgacctgtcagct60cttcaaaaatgcgagggtaagcttgtgtttttgaccgctctgcgtcgtcgcgtgatgctc120tccagcgtcaccctctcgtcatactatgtcaacggcgcacccccggacacgctatccctg180atggcggcgtttcgtaggcgttttxccgctataatacagcgcgtgctgcccaacaaaatg240ateigccgccgccctgggagtcgcaccgcttcctcccggggcgttcatacagaacacaggc300ccgtttgacctgtgcaacggggactctgtgtgcgcgctgcctcccattttggacgtggag360gacaagctgcgcctaggatctgtgggcgaggaa393<210〉4<211〉171<212〉DNA<213>馬傳染性貧血病病毒〈400〉4cccaacaca3C3tacacctagcaggcgtg3ccggtggatcaggggacaaatactacaagc603g肪gt3CtC.caggaacgsctggaatggag33tC3g3ggagtacaacaggcggccaaaga120gctgggtgaagtcaatcgaggcatttggagagagctatatttccgagaaga171<210〉5<211>54<212〉腿<213〉狂犬病毒<■.5tccEicgiagaaLcUtgaggaagagat站g幼gaatgtttgagccagggcaggags54<210〉6<211>54<212〉DNA<213〉馬傳染性動脈炎病毒<6tgcacattcctggacgaacagattatcacgtttggaaccgattgtgatgaceicc54<210>7<211>54<212〉腿<213>馬傳染性鼻肺炎病毒gctctgcgtcgtcgcgtgatgctctccagcgtcaccctctcgtcatactatgtc54<210>8<211〉53<212>■<213〉馬傳染性貧血病病毒<400〉8aacgactggaatggagaatcagaggagtacaacaggcggccaaagagctgggt53<210>9<211〉18<212>■<213>artificialsequence<220〉<223〉primer<400〉9catgtttttctcccggat18〈210〉10<211〉19〈212〉■<213〉artificialsequence<220>〈223>primer<400〉.10cctagtgaacgg站gtgga19<210〉11<211>22<212〉DM<213>artificialsequence<220><223>primer<11ttcacagacttcaccttgtgta22<210>12<211>21<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula><223〉primer<400>16tcttctcggsaatatagc<210〉17<2U〉51<212〉DNA〈213〉陽性內(nèi)參"00>175,-tttggggtgcttgalg幼caeittacatcgtaat3ggggctacagagataga-3'<400>18ctggcgaatctg肪tgceigttteiacggctcaaccaagttg幼ctcagacgc<210>19<211>20<212〉腿<213〉primer<400〉19ggpatacagtcctcatccag<210>20<211>18〈212〉DM<213〉primer<婦20acggctcttccctccaag〈210〉<211><212〉<213>內(nèi)A性001-N月15D段權(quán)利要求1、一種檢測馬感染病毒病原體的基因芯片，包括固相載體硝酸纖維素膜和固定在該載體上的寡聚核苷酸探針，其中寡聚核苷酸探針包括檢測探針和質(zhì)量控制探針，其特征在于芯片樣品點的布局為低密度布局，樣品點少于200個；所述的寡聚核苷酸檢測探針是從狂犬病病毒、馬傳染性動脈炎病毒、馬傳染性鼻肺炎病毒和馬傳染性貧血病病毒中的至少一種病毒基因組對應(yīng)的核苷酸序列中選取的核酸片段。2、如權(quán)利要求1所述的檢測馬感染病毒病原體的的基因芯片，其特征在于所述的寡聚核苷酸檢測探針包括從狂犬病病毒、馬傳染性動脈炎病毒、馬傳染性鼻肺炎病毒和馬傳染性貧血病病毒基因組對應(yīng)的核苷酸序列中選取的核酸片段。3、如權(quán)利要求1或2所述的檢測馬感染病毒病原體的的基因芯片，其特征在于所述的從狂犬病病毒基因組的核苷酸序列中選取的核酸片段具有如序列表中SEQIDN0:5所示的堿基序列;從馬傳染性動脈炎病毒基因組的核苷酸序列中選取的核酸片段具有如序列表中SEQIDN0:6所示的堿基序列；從馬傳染性鼻肺炎病毒基因組的核苷酸序列中選取的核酸片段具有如序列表中SEQIDN0:7所示的堿基序列；從馬傳染性貧血病病毒基因組的核苷酸序列中選取的核酸片段具有如序列表中SEQIDN0:8所示的堿基序列。4、制備權(quán)利要求1所述的檢測馬感染病毒病原體的基因芯片的方法,其特征是包括以下的步驟(1)檢測探針的設(shè)計經(jīng)Genbank檢索，BLAST序列比對得到狂犬病病毒、馬傳染性動脈炎病毒、馬傳染性鼻肺炎病毒和馬傳染性貧血病病毒基因組對應(yīng)的核苷酸序列中的相對保守區(qū)，作為靶序列，依據(jù)探針設(shè)計原則，釆用PrimerPremier5.0和01igo6.0軟件，分別在此保守區(qū)內(nèi)設(shè)計針對病原體的特異性檢測探針；(2)檢測探針的合成由專門的生物公司合成上述設(shè)計好的探針片段序列；(3)芯片的制備包括切膜、貼膜，然后將上述得到的檢測探針點膜，紫外交聯(lián)10分鐘，再經(jīng)存膜即得芯片，其中點膜后所得樣品點的直徑在200um—1000um。5、如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的相對保守區(qū)的序列如下狂犬病病毒基因組核苷酸序列中的相對保守區(qū)具有如序列表中SEQIDN0:1所示的堿基序列；馬傳染性動脈炎病毒基因組核苷酸序列中的相對保守區(qū)具有如序列表中SEQIDN0:2所示的堿基序列；馬傳染性鼻肺炎病毒基因組苷酸序列中的相對保守區(qū)具有如序列表中SEQIDN0:3所示的堿基序列；馬傳染性貧血病病毒基因組核苷酸序列中的相對保守區(qū)具有如序列表中SEQIDN0:4所示的堿基序列。6、一種利用權(quán)利要求l、2或3所述的基因芯片檢測馬感染病毒病原體的方法，其特征是包括以下的步驟(1)待測樣^a細常規(guī)^4ii取待測樣品的RNA，進fi^轉(zhuǎn)顛卩標記PCRrJt;(2)雜交顯色將步驟(1)得到的標記后的PCR產(chǎn)物和權(quán)利要求1、2或3所述的基因芯片進行雜交，然后顯色；(3)結(jié)果閱讀與分析利用生物芯片閱讀儀獲取雜交信號并分析鑒定雜交結(jié)果。7、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于歩驟(1)所述的+示記PCR擴增使用以下引物擴增SEQIDN0:1所用的一對引物的序列如序列表中的SEQIDN0:9和NO:10所示；擴增SEQIDN0:2所用的一對引物的序列如序列表中的SEQIDN0:11和N0:12所示；擴增SEQIDN0:3所用的一對引物的序列如序列表中的SEQIDNO:13和NO:14所示；擴增SEQIDN0:4的序列所用的一對引物的序列如序列表中的SEQIDNO:15和NO:16所示。8、用于檢測馬感染病毒病原體的試劑盒，其特征是包括權(quán)利要求l、2或3所述的基因芯片、待測樣品處理試劑、雜交和顯色試劑，以及說明書。全文摘要本發(fā)明涉及一種檢測馬感染病毒病原體的基因芯片，該基因芯片包括固相載體和固定在該載體上的寡聚核苷酸探針，其中寡聚核苷酸探針包括檢測探針和質(zhì)量控制探針，檢測探針是從狂犬病病毒、馬傳染性動脈炎病毒、馬傳染性鼻肺炎病毒和馬傳染性貧血病病毒的核苷酸序列中選取的核酸片段。本發(fā)明還涉及上述芯片的制備方法、利用該芯片檢測四種馬傳染病病毒的檢測方法，包括合成探針，制備芯片，與處理標記好的待測樣品進行雜交的過程。本發(fā)明還進一步涉及由上述芯片和樣品處理試劑、雜交和顯色試劑、以及說明書組成的檢測馬傳染病病毒病原體的試劑盒。利用本發(fā)明的基因芯片可達到同時檢測四種病毒的目的，其操作簡便、準確性高、重復(fù)性強，對于實驗室研究和生產(chǎn)實踐都具有重要的意義。文檔編號C12Q1/70GK101348838SQ200810114429公開日2009年1月21日申請日期2008年6月5日優(yōu)先權(quán)日2008年6月5日發(fā)明者騁周,姚志建,存姜,逄建濤申請人:北京愛普益生物科技有限公司