專利名稱：一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白 酶的方法。
技術(shù)背景角蛋白酶能夠溫和高效地水解羽毛等角蛋白廢棄物，生產(chǎn)飼料、肥料。該 法生產(chǎn)的飼料節(jié)約能源、成本低、質(zhì)量好，能夠較好的被動物利用。在含角蛋 白的飼料中，添加角蛋白酶也可以提高動物對角蛋白的吸收利用，提高經(jīng)濟(jì)效 益。角蛋白能夠選擇性的水解羊毛、皮革表面的角蛋白，有望取代傳統(tǒng)的羊毛 剝鱗和鞣革工藝，實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的綠色環(huán)保改造。角蛋白酶能改善化妝品、外 用藥物在皮膚中的通透性，在醫(yī)藥、化妝品等工業(yè)也都有著廣泛的應(yīng)用前景。 開發(fā)廉價高效的角蛋白酶生產(chǎn)技術(shù)是保護(hù)環(huán)境和提高經(jīng)濟(jì)效益的必然要求。本次將粘金黃桿菌液體發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用到角蛋白酶的生產(chǎn)在國內(nèi)尚屬首例，研究結(jié)果表明該方案是可行的。粘金黃桿菌為C7"y化o^"en'"mL卯，保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.2295。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的s的是針對液體發(fā)酵過程中的營養(yǎng)需求與菌體生長的關(guān)系，提供 一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白酶的方法。液體深層發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白酶的方法包括如下步驟1) 采用涂布或劃線的方法將粘金黃桿菌接種到斜面培養(yǎng)基上，于18 37 C復(fù)壯培養(yǎng)18 36小時，得到復(fù)壯菌體；2) 將復(fù)壯菌體接種到液體種子培養(yǎng)基中，于18 37"C， 100 300rpm條件 下培養(yǎng)18 36小時，得到發(fā)酵種子；3) 將發(fā)酵種子按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5 15%接入發(fā)酵罐中，罐溫18 37°C、 罐壓0.2 0.8kg/cm2，攪拌速率100 300rpm，通氣量為h 0.3 2.0，發(fā)酵培養(yǎng) 時間18 60小時。所述的粘金黃桿菌為Ozo^o6a"m',丄卯，保藏于中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.2295。所述的斜面培養(yǎng)基的成份為每1000毫升中含NaC15 15克、酵母粉或酵 母膏5 10克、蛋白胨5 15克、瓊脂粉10 20克和水900 1000毫升。所述的種子培養(yǎng)基的成份為每1000毫升中含NaC15 15克、酵母粉或酵 母膏5 10克、蛋白胨5 15克和水900 1000毫升。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的成份為每1000毫升中含可溶性淀粉0.1 100克、蔗糖0.1 100克、葡萄糖0.1 100克、酪蛋白0.1 100克、酵母粉或酵母膏0.1 100克、蛋白胨0.1 100克、角蛋白0.1 200克、K2PO4 0.1 10克、NaH2P(V2H20 1 10克、MgCl2.6H2O0.1 5克和水900 1000毫升。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果1) 本發(fā)明中種子培養(yǎng)基提供了菌體短期內(nèi)快速生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng) 20小時左右即可進(jìn)行深層發(fā)酵。2) 本發(fā)明中液體深層通氣發(fā)酵培養(yǎng)基，營養(yǎng)成分配比合理，能夠保證粘金 黃桿菌L99的生長和產(chǎn)酶需要。培養(yǎng)基材料豐富，整個分批發(fā)酵過程中只需一 次配料、 一次滅菌即可，具有省時、省工，又減少了由于中途加料造成污染雜 菌的機(jī)會。3) 采用本發(fā)明中的液體深層通氣發(fā)酵工藝進(jìn)行分批發(fā)酵，最終酶活可達(dá) 100-400 U/ml。酶活力單位定義pH 8.0,50°C， 200rpm每小時水解藍(lán)色角蛋白 使595nm處吸光度增加0.001的酶量。4) 本發(fā)明是國內(nèi)首次對粘金黃桿菌產(chǎn)角蛋白酶發(fā)酵工藝進(jìn)行研究，對于該 菌以后的實(shí)驗(yàn)研究和工業(yè)化生產(chǎn)均有很大的指導(dǎo)意義。5) 本發(fā)明的發(fā)酵過程中利用了對環(huán)保不利的角蛋白為底物，成本低，在產(chǎn) 角蛋白酶的同時又能解決環(huán)境問題，降解后的角蛋白用于飼料等行業(yè)可產(chǎn)生較 高的經(jīng)濟(jì)價值。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。 實(shí)施例11) 采用涂布或劃線的方法將粘金黃桿菌接種到斜面培養(yǎng)基上，于18'C復(fù)壯 培養(yǎng)36小時，得到復(fù)壯菌體；斜面培養(yǎng)基的成份為每1000毫升中含NaC110 克、酵母粉5克、蛋白胨5克、瓊脂粉15克和水980毫升。2) 將復(fù)壯菌體接種到液體種子培養(yǎng)基中，于18t:， 200rpm條件下培養(yǎng)24 小時，得到發(fā)酵種子；種子培養(yǎng)基的成份為每1000毫升中的NaC110克、酵 母粉5克、蛋白胨5克和水980毫升。3) 將發(fā)酵種子按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5%接入發(fā)酵罐中，罐溫18°C、罐壓 0.2kg/cm2，攪拌速率100rpm，通氣量為1: 0.3，發(fā)酵培養(yǎng)時間60小時。發(fā)酵 培養(yǎng)基成份為每1000毫升中含可溶性淀粉0.1克、蔗糖O.l克、葡萄糖O.l克、 酪蛋白0.1克、酵母粉0.1克、蛋白胨0.1克、羽毛粉角蛋白20克、K2P042克、 NaH2P04.2H20 4克、MgCl2.6H20 0.1克和水980毫升。實(shí)施例21) 采用涂布或劃線的方法將粘金黃桿菌接種到斜面培養(yǎng)基上，于25'C復(fù)壯 培養(yǎng)24小時，得到復(fù)壯菌體；斜面培養(yǎng)基的成份為每1000毫升中含NaC110 克、酵母粉5克、蛋白胨10克、瓊脂粉20克和水980毫升。2) 將復(fù)壯菌體接種到液體種子培養(yǎng)基中，于25"C， 200rpm條件下培養(yǎng)18 小時，得到發(fā)酵種子；種子培養(yǎng)基的成份為每1000毫升中的NaC110克、酵 母粉5克、蛋白胨10克和水980毫升。3) 將發(fā)酵種子按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的6%接入發(fā)酵罐中，罐溫25°C、罐壓 0.3kg/cm2，攪拌速率200rpm，通氣量為1: 0.5，發(fā)酵培養(yǎng)時間36小時。發(fā)酵 培養(yǎng)基成份為每1000亳升中含可溶性淀粉0.1克、蔗糖60克、葡萄糖0.1克、 酪蛋白0.1克、酵母粉或酵母膏0.1克、蛋白胨0.1克、羽毛粉角蛋白40克、 K2P044i、 NaH2P04'2H20 2克、MgCl2'6H20 0.2克和水980毫升。實(shí)施例31) 采用涂布或劃線的方法將粘金黃桿菌接種到斜面培養(yǎng)基上，于3(TC復(fù)壯 培養(yǎng)24小時，得到復(fù)壯菌體；斜面培養(yǎng)基的成份為每1000毫升中含NaC112 克、酵母粉6克、蛋白胨12克、瓊脂粉15克和水980毫升。2) 將復(fù)壯菌體接種到液體種子培養(yǎng)基中，于3(TC， 200rpm條件下培養(yǎng)14 小時，得到發(fā)酵種子；種子培養(yǎng)基的成份為每1000毫升中的NaC112克、酵 母粉6克、蛋白胨12克和水980毫升。3) 將發(fā)酵種子按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的6%接入發(fā)酵罐中，罐溫30°C、罐壓 0.5kg/cm2，攪拌速率200rpm，通氣量為1: 0.8，發(fā)酵培養(yǎng)時間30小時。發(fā)酵 培養(yǎng)基成份為每1000毫升中含可溶性淀粉0.1克、蔗糖O.l克、葡萄糖40克、 酪蛋白0.1克、酵母粉或酵母膏0.1克、蛋白胨0.1克、頭發(fā)角蛋白40克、K2P04 0.8克、NaH2PCV2H20 6克、MgCl,6H20 2克和水980毫升。實(shí)施例41) 采用涂布或劃線的方法將粘金黃桿菌接種到斜面培養(yǎng)基上，于37t復(fù)壯 培養(yǎng)18小時，得到復(fù)壯菌體；斜面培養(yǎng)基的成份為每1000毫升中含NaC18 克、酵母粉5克、蛋白胨6克、瓊脂粉15克和水980毫升。2) 將復(fù)壯菌體接種到液體種子培養(yǎng)基中，于37'C， 200rpm條件下培養(yǎng)12 小時，得到發(fā)酵種子；種子培養(yǎng)基的成份為每1000毫升中的NaC18克、酵母 粉5克、蛋白胨8克和水980毫升。3) 將發(fā)酵種子按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的6%接入發(fā)酵罐中，罐溫37'C、罐壓 0.4kg/cm2，攪拌速率200rpm，通氣量為1: 1.5，發(fā)酵培養(yǎng)時間24小時。發(fā)酵 培養(yǎng)基成份為每1000毫升中含可溶性淀粉0.1克、蔗糖O.l克、葡萄糖40克、酪蛋白0.1克、酵母粉或酵母膏0.1克、蛋白胨0.1克、羊毛角蛋白40克、K2P04 0.8克、NaH2P042H26克、MgCl2'6H20 2克和水980毫升。實(shí)施例51) 采用涂布或劃線的方法將粘金黃桿菌接種到斜面培養(yǎng)基上，于3(TC復(fù)壯 培養(yǎng)24小時，得到復(fù)壯菌體；斜面培養(yǎng)基的成份為每1000毫升中含NaC110 克、酵母粉5克、蛋白胨10克、瓊脂粉15克和水980毫升。2) 將復(fù)壯菌體接種到液體種子培養(yǎng)基中，于3(TC， 200rpm條件下培養(yǎng)20 小時，得到發(fā)酵種子；種子培養(yǎng)基的成份為每1000毫升中的NaC110克、酵 母粉5克、蛋白胨10克和水980毫升。3) 將發(fā)酵種子按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的4%接入發(fā)酵罐中，罐溫3(TC、罐壓 0.5kg/cm2，攪拌速率300rpm，通氣量為1: 1.5，發(fā)酵培養(yǎng)時間30小時。發(fā)酵 培養(yǎng)基成份為每1000毫升中含可溶性淀粉0.1克、蔗糖O.l克、葡萄糖O.l克、 酪蛋白0.1克、酵母粉或酵母膏0.1克、蛋白胨20克、羽毛角蛋白40克、K2P04 0.8克、NaH2P(V2H20 6克、MgCl2'6H20 2克和水980毫升。實(shí)施例61) 采用涂布或劃線的方法將粘金黃桿菌接種到斜面培養(yǎng)基上，于3(TC復(fù)壯 培養(yǎng)24小時，得到復(fù)壯菌體；斜面培養(yǎng)基的成份為每1000毫升中含NaC110 克、酵母粉5克、蛋白胨10克、瓊脂粉20克和水980毫升。2) 將復(fù)壯菌體接種到液體種子培養(yǎng)基中，于3(TC， 200rpm條件下培養(yǎng)16 小時，得到發(fā)酵種子；種子培養(yǎng)基的成份為每1000毫升中的NaC110克、酵 母粉5克、蛋白胨10克和水980毫升。3) 將發(fā)酵種子按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的6%接入發(fā)酵罐中，罐溫30°C、罐壓 0.5kg/cm2，攪拌速率250rpm，通氣量為1: 1.0，發(fā)酵培養(yǎng)時間30小時。發(fā)酵 培養(yǎng)基成份為每1000毫升中含可溶性淀粉0.1克、蔗糖O.l克、葡萄糖20克、 酪蛋白0.1克、酵母粉或酵母膏0.1克、蛋白胨20克、角蛋白0.1克、K2P04 4 克、NaH2P(V2 H20 6克、MgCl2'6H20 2克和水980毫升。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的部分具體實(shí)施例。顯然， 本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本發(fā)明可用其他的不違背本發(fā)明的精神和主要特征的具體形式來概述。因 此，無論從哪一點(diǎn)來看，本發(fā)明的上述實(shí)施方案都只能認(rèn)為是對本發(fā)明的說明 而不能限制本發(fā)明，權(quán)利要求書指出了本發(fā)明的范圍，而上述的說明并未指出 木發(fā)明的范圍，因此，在與本發(fā)明的權(quán)利要求書相當(dāng)?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何改 變，都應(yīng)認(rèn)為是包括在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白酶的方法，其特征在于包括如下步驟1)采用涂布或劃線的方法將粘金黃桿菌接種到斜面培養(yǎng)基上，于18～37℃復(fù)壯培養(yǎng)18～36小時，得到復(fù)壯菌體；2)將復(fù)壯菌體接種到液體種子培養(yǎng)基中，于18～37℃，100～300rpm條件下培養(yǎng)18～36小時，得到發(fā)酵種子；3)將發(fā)酵種子按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5～15％接入發(fā)酵罐中，罐溫18～37℃、罐壓0.2～0.8kg/cm2，攪拌速率100～300rpm，通氣量為1∶0.3～2.0，發(fā)酵培養(yǎng)時間18～60小時。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白酶的方法，其特征 在丁所述的粘金黃桿菌為C7zo^eo6flcten、附Z卯，保藏于中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.2295。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白酶的方法，其特征 在于所述的斜面培養(yǎng)基的成份為每1000毫升中含NaC15 15克、酵母粉或酵 母膏5 10克、蛋白胨5 15克、瓊脂粉10 20克和水900 1000毫升。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白酶的方法，其特征 在于所述的種子培養(yǎng)基的成份為每1000毫升中含NaC15 15克、酵母粉或酵 母膏5 10克、蛋白胨5 15克和水900 1000毫升。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白酶的方法，其特征 在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的成份為每1000毫升中含可溶性淀粉0.1 100克、蔗 糖0.1 100克、葡萄糖0.1 100克、酪蛋白0.1 100克、酵母粉或酵母膏0.1 100克、蛋白胨0.1 100克、角蛋白0.1 200克、K2PO4 0.1 10克、NaH2P(V2H20 0.1 10克、MgCl2'6H20 0.1 5克和水900 1000毫升。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用粘金黃桿菌液體深層發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白酶的方法，目標(biāo)是大規(guī)模液體深層發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白酶。以本實(shí)驗(yàn)室分離到的粘金黃桿菌Chrvseobacterium L99，CGMCC No.2295純菌株為出發(fā)菌種，經(jīng)斜面培養(yǎng)、搖瓶種子培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)液體深層發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白酶。本發(fā)明中公開的液體發(fā)酵培養(yǎng)基分別由可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、酪蛋白、酵母粉、酵母膏、蛋白胨、角蛋白、鎂鹽、鉀鹽和鈉鹽組成。適合粘金黃桿菌液體深層通氣培養(yǎng)，合理滿足了其不同發(fā)酵時期所需的營養(yǎng)物質(zhì)，提高了發(fā)酵液中的角蛋白酶活力。本發(fā)明在生產(chǎn)角蛋白酶同時，可利用降解造成環(huán)境污染的角蛋白，所得的角蛋白降解物具有較高的經(jīng)濟(jì)價值。
文檔編號C12R1/01GK101260393SQ200810060639
公開日2008年9月10日 申請日期2008年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月15日
發(fā)明者呂龍賢, 李永泉, 沈鈱豪, 管文軍 申請人:浙江大學(xué)