專利名稱：一種甘蔗健康種苗高效繁育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作物種子工程領(lǐng)域，尤其是一種甘蔗健康種苗高效繁育方法。
背景技術(shù)：
甘蔗是我國重要的糖料作物，甘蔗良種對蔗糖產(chǎn)業(yè)的貢獻(xiàn)率在60%以上， 甘蔗良種的迅速推廣應(yīng)用成為推動蔗糖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的直接動力，甘蔗為無性繁育 作物，繁殖速率慢，而生產(chǎn)上常規(guī)栽培用種量大，畝用種量高達(dá)8000 — 10000芽， 而且甘蔗經(jīng)數(shù)年種植后，易感花葉病、宿根矮化病等，造成甘蔗優(yōu)良品種的種 性退化，導(dǎo)致甘蔗減產(chǎn)、品質(zhì)下降等不良影響。因此，研究利用甘蔗健康種苗 作種，成為蔗糖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的可行途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種甘蔗健康種苗高效繁育方法，它能有效解決目前 甘蔗良種推廣應(yīng)用過程中，繁殖系數(shù)低，推廣慢及甘蔗良種種性易退化的問題。 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)
本發(fā)明根據(jù)甘蔗種苗特性，將溫水脫毒技術(shù)和組培莖尖脫毒技術(shù)有機結(jié)合， 通過種苗溫水脫毒處理、種苗催芽、外植體剝離接種、誘導(dǎo)培養(yǎng)、病毒檢測、 增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、馴化練苗和室外假植九個步驟培育出甘蔗良種健康種苗， 主要技術(shù)如下
① 種苗溫水脫毒處理將甘蔗的中部芽砍為10 12cm的單芽，置于水溫 52i:的恒溫水浴鍋中，進(jìn)行30min的溫水脫毒處理；
② 種苗催芽:將溫水脫毒處理過的甘蔗芽，先用0.5%多菌靈浸泡5min，按 5cm的間隔距離，依次擺放于底部有2 3cm厚粗沙的不銹鋼托盤中，蓋上2cm 厚的粗沙，用MS培養(yǎng)基的無機成分溶液澆透，覆蓋薄膜保水，然后置于溫度35 °C、光強為2000Lx的培養(yǎng)箱里，每天光照培養(yǎng)14h，進(jìn)行催芽處理，處理過程 中，間隔3天噴一次0.5%多菌靈殺菌，待蔗芽生長至15 18cm時，即可沿基 部將芽取下備用；
③ 外植體剝離接種:將步驟②中培養(yǎng)獲得的蔗芽，剝?nèi)ネ鈱永先~，用75%的 酒精棉球進(jìn)行表面消毒，放入超菌工作臺上，直接剝離蔗芽莖尖生長點1 2mm 接種；
④ 誘導(dǎo)培養(yǎng)把步驟③中剝離獲得的莖尖，接種培養(yǎng)于培養(yǎng)基成分為 MS+0. 5mg/L6-BA+3%Sugar+0. 7%Agar+0. 05%AC的培養(yǎng)瓶中，每一瓶接種一個莖 尖。接種完成后，將接有外植體的培養(yǎng)瓶置于溫度為28 32'C、光強為2000 2500Lx的培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；
⑤ 病毒檢測誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得叢芽后，目測棄出變異苗，再以每瓶中的一個 芽叢為單位，每叢取0. 5g葉片，提取蔗葉汁，應(yīng)用電鏡、ELISA檢測甘蔗花葉??； 應(yīng)用PCR技術(shù)檢測宿根矮化病，PCR檢測引物為單引物組合，Lxxl: ACCCTGTGTTGTTTTCAACG/Lxx2 : CCGAAGTGAGCAGATTGACC或RSD33 : CTGGCACCCTGTGTTGTTTTC/RSD297: TTCGGTTCTCATCTCAGCGTC，檢測棄出病毒苗， 獲得健康植株，方可進(jìn)行工廠化的增殖擴繁；
⑥ 增殖擴繁在無菌條件下，將經(jīng)過檢測獲得的健康植株，先轉(zhuǎn)接于培養(yǎng) 基HS+lmg/L6-BA+3%Sugar+0.02%AC中，進(jìn)行適應(yīng)培養(yǎng)一代后，再轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基 HS+2mg/L6-BA+3%Sugar+0. 02%AC中培養(yǎng)，隨后的增殖繼代交替使用這兩個培養(yǎng) 基配方，培養(yǎng)條件與誘導(dǎo)培養(yǎng)條件相同，即培養(yǎng)溫度為28 32°C、光強為2000 2500Lx， 15 20天繼代一次，每代增殖達(dá)3 5倍；
⑦ 生根培養(yǎng)將增殖培養(yǎng)到第7代的甘蔗叢芽，轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基 1/2MS+4. Omg/LNM+2. 5mg/LMET+2%Sugar+0. 05%AC上，進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)條 件與誘導(dǎo)培養(yǎng)條件相同，即培養(yǎng)溫度為28 32'C、光強為2000 2500Lx，培養(yǎng) 20 25天，即可生根長成完整植株，生根率達(dá)98%;
⑧ 馴化練苗假植移栽前，將長成完整植株的瓶蓋和培養(yǎng)室的窗戶一起打
開，進(jìn)行馴化練苗2 3天，開瓶練苗時間在早晨或傍晚進(jìn)行；
⑨ 室外假植甘蔗健康種苗的假植在防蟲網(wǎng)室內(nèi)進(jìn)行，將馴化好的甘蔗瓶 苗，剪去枯黃葉和葉尖，自來水漂洗干凈，浸泡于O. 1%的高錳酸鉀溶液405， 按照6cmX8cm的株行距種植于沙床上，澆透水，搭建拱棚，蓋膜并加蓋遮蔭網(wǎng) 保持溫度在26 38。C、保持濕度在60 80%，假植期間每隔2天噴淋一次0. 5
%多菌靈，連續(xù)噴淋3次，防治霉菌，假植8 10天，健康植株成活轉(zhuǎn)綠，噴 施0.1%的尿素，補充養(yǎng)分，并隨著幼苗生長，將噴施濃度提高到0.2%;假植 18 22天后，甘蔗健康植株抽出大量新葉，剪葉促壯；假植25天后，植株迅速 生長，叢苗單株間相互競爭吸收營養(yǎng)，為使幼苗更充分的生長，將叢芽苗分為 單株進(jìn)行二期假植。按照此假植管理要求操作，甘蔗健康種苗的成活率高，達(dá) 90%以上，且培育植株健壯。
本發(fā)明具有的有益效果如下
本發(fā)明采用溫水脫毒和莖尖脫毒相結(jié)合，脫毒徹底、效果好；外植體無需 進(jìn)行消毒，直接剝離接種，污染率低、褐化輕，容易誘導(dǎo)產(chǎn)生叢芽；繁殖系數(shù) 高、速度快、周期短；種性穩(wěn)定，苗健壯；病毒檢測精密準(zhǔn)確；室外假植成活 率高，達(dá)90%以上；生產(chǎn)成本低、效率高、適合工廠化生產(chǎn)。該技術(shù)較適合甘 蔗科研單位、蔗糖行政主管部門和生產(chǎn)企業(yè)推廣使用。
具體實施例方式
本發(fā)明提供的甘蔗健康種苗高效繁育方法，需要具備一條組培生產(chǎn)線和與 之相配套的育苗溫室及恒溫水浴鍋、培養(yǎng)箱等簡易設(shè)施，并嚴(yán)格按照上述發(fā)明 內(nèi)容部分提供的九項技術(shù)措施操作，即可培育出甘蔗良種的健康種苗，用于甘 蔗優(yōu)良品種推廣。
權(quán)利要求
1.一種甘蔗健康種苗高效繁育方法，其特征在于通過種苗溫水脫毒處理、種苗催芽、外植體剝離接種、誘導(dǎo)培養(yǎng)、病毒檢測、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、馴化練苗和室外假植九個步驟培育出甘蔗良種健康種苗。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的種苗溫水脫毒處理步驟是將甘蔗的中部芽砍為10 12cm的單芽，置于水溫52"C的恒溫水浴鍋中，進(jìn) 行30min的溫水脫毒處理。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的種苗催芽步驟是將溫 水脫毒處理過的甘蔗芽，先用0.5X多菌靈浸泡5min，按5cm的間隔距離，依次 擺放于底部有2 3cm厚粗沙的不銹鋼托盤中，蓋上2cm厚的粗沙，用MS培養(yǎng) 基的無機成分溶液澆透，覆蓋薄膜保水，然后置于溫度35'C、光強為2000Lx的 培養(yǎng)箱里，每天光照培養(yǎng)14h，進(jìn)行催芽處理，處理過程中，間隔3天噴一次 0.5%多菌靈殺菌，待蔗芽生長至15 18cm時，即可沿基部將芽取下備用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的外植體剝離接種步驟 是將蔗芽剝?nèi)ネ鈱永先~，用濃度75%的酒精棉球消毒后，直接剝離蔗芽莖尖生 長點1 2mm接種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)是將莖尖接 種培養(yǎng)于培養(yǎng)基成分為MS+O. 5mg/L6-BA+3%Sugar+0. 7%Agar+0. 05%AC的培養(yǎng)瓶 中，每一瓶接種一個莖尖，接種完成后，將接有外植體的培養(yǎng)瓶置于溫度為28 32°C、光強為2000 2500Lx的培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的病毒檢測是將誘導(dǎo)培 養(yǎng)獲得的叢芽目測棄出變異苗，再以每瓶中的一個芽叢為單位，每叢取0.5g葉 片，提取蔗葉汁，應(yīng)用電鏡或ELISA檢測甘蔗花葉??；應(yīng)用PCR技術(shù)檢測宿根矮 化病，PCR檢測引物為單引物組合，Lxxl: ACCCTGTGTTGTTTTCAACG/Lxx2: CCGAAGTGAGCAGATTGACC 或 RSD33 : CTGGCACCCTGTGTTGTTTTC/RSD297 : TTCGGTTCTCATCTCAGCGTC,檢測棄出病毒苗，獲得可進(jìn)行工廠化增殖擴繁的健康 植株。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的增殖培養(yǎng)是將經(jīng)過檢 測的健康植株，先轉(zhuǎn)接于培養(yǎng)基為HS+lmg/L6-BA+3%Sugar+0.02%AC中，進(jìn)行適 應(yīng)培養(yǎng)一代后，再轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基HS+2mg/L6-BA+3%Sugar+0.02%AC中培養(yǎng)，隨后 的增殖繼代交替使用這兩個培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)溫度為28 32T:、光強為2000 2500Lx; 15 20天繼代一次，每代增殖達(dá)3 5倍。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的生根培養(yǎng)是將增殖培 養(yǎng)到第 7代的甘蔗叢芽，轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基 1/2MS+4. Omg/LNAA+2. 5mg/LMET+2%Sugar+0. 05%AC上，在培養(yǎng)溫度為28 32°C、 光強為2000 2500Lx條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)20 25天，即可生根長成完 整植株。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的馴化練苗是將長成完 整的植株的瓶蓋和培養(yǎng)室的窗戶一起打開，馴化練苗2 3天，開瓶練苗時間在 早晨或傍晚進(jìn)行。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的室外假植是將馴化練 苗后的甘蔗瓶苗，漂洗干凈，浸泡于O. lX的高錳酸鉀溶液40s，按照6cmX8cm 的株行距種植于沙床上，澆透水，搭建拱棚，蓋膜并加蓋遮蔭網(wǎng)保持溫度在26 38"、保持濕度在60 80%，假植期間每隔2天噴淋一次0. 5%多菌靈，假植8 IO天后，噴施O. 1 0.2%的尿素；假植18 22天后，剪葉促壯；假植25天后， 將叢芽苗分為單株進(jìn)行二期假植。
全文摘要
一種甘蔗健康種苗高效繁育方法，該方法針對甘蔗為無性繁殖作物，繁殖系數(shù)低，甘蔗種植用種量大，且經(jīng)數(shù)年種植后，甘蔗易感病，導(dǎo)致種性退化、大量減產(chǎn)和品質(zhì)下降等問題而提出，通過種苗溫水脫毒處理、種苗催芽、外植體剝離接種、誘導(dǎo)培養(yǎng)、病毒檢測、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、馴化練苗和室外假植九項步驟培育出甘蔗良種健康種苗；本發(fā)明采用溫水脫毒和莖尖脫毒相結(jié)合，脫毒徹底、效果好；外植體直接剝離接種，無需進(jìn)行消毒處理，污染率低、褐化輕，容易誘導(dǎo)產(chǎn)生叢芽；繁殖系數(shù)高、速度快、周期短；種性穩(wěn)定，苗壯；病毒檢測精密準(zhǔn)確；室外假植成活率高，達(dá)90％以上；生產(chǎn)成本低、效率高，適合工廠化生產(chǎn)。
文檔編號C12Q1/70GK101361458SQ20081005899
公開日2009年2月11日 申請日期2008年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月27日
發(fā)明者侯朝祥, 吳才文, 尹興祥, 杰 崔, 艷 畢, 王炎炎, 俊 趙, 趙培方, 陳學(xué)寬 申請人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所