專利名稱：：小紅參組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于通過組織培養(yǎng)技術(shù)的植物再生
技術(shù)領(lǐng)域：
，主要是產(chǎn)自云南楚雄地區(qū)的小紅參的組織培養(yǎng)和幼苗分化
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：小紅參(；血.<3/〃//s/7e/757.5"廣/^朋c力.」"iehj為茜草禾斗6血'sceseJ植物云南茜草的全草，其性味甘、苦，微溫，主要以根入藥，是云南省彝族、白族、普米族、傈傈族等民族共同使用的野生中藥材，為臨床上常用的典型民族藥。彝藥名稱為乃佐色。具有補(bǔ)血活血，祛風(fēng)除濕，軟堅(jiān)破積，鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛的功能，主要用于治療月經(jīng)不調(diào)、貧血、失眠、跌打損傷、風(fēng)寒濕痹、筋骨疼痛、半身不遂、角膜云翳、瘡癤腫痛、銀屑病、肺結(jié)核、慢性胃炎、腎炎、尿道炎、膀胱炎、脈管炎(虛寒型)、冠心病、心膠痛、過敏性紫癜、頑固性鼻衄及癌癥腫瘤等。小紅參目前尚未形成規(guī)模種植，主要依靠野生資源，因無序采挖，大量資源瀕臨枯竭，藥材供不應(yīng)求，價(jià)格高，市場(chǎng)需求量大。野生的小紅參存在生長(zhǎng)年限不一，有效成分含量不穩(wěn)定、質(zhì)量不均一、產(chǎn)量不穩(wěn)定等問題。且種子難萌發(fā)(50-60天才出苗)，生育期過長(zhǎng)，隔年種子發(fā)芽率較低的問題。而人工種植主要采用種子繁殖、枝條扦插、分株繁殖的方法，存在繁殖系數(shù)低，耗種量大，成活率低的問題。為此，開展小紅參組織培養(yǎng)研究，既可以保護(hù)小紅參的野生資源量，又可為小紅參的大規(guī)模種植提供大量?jī)?yōu)質(zhì)種苗，實(shí)現(xiàn)小紅參資源的合理開發(fā)利用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的正是為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足而提供一種能大幅度提高小紅參愈傷組織的誘導(dǎo)率，提高小紅參幼苗的分化率，從而實(shí)現(xiàn)小紅參種苗工廠化快速繁殖的小紅參組織培養(yǎng)方法。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方^實(shí)現(xiàn)的'。小紅參組織培養(yǎng)方法，方法步驟如下①取小紅參植株的頂芽或側(cè)芽為外植體，進(jìn)行清洗消毒，即用洗滌劑溶液浸5分鐘，自來水沖5分鐘后，用70%酒清浸泡10秒，再用0.2%升汞浸泡8分鐘，用無菌水沖洗812次；②將清洗消毒過的小紅參的頂芽或側(cè)芽接種到MS或1/2MS的培養(yǎng)基，使用BA0.050.5mg/L或KT0.050.5mg/L+NAA0.53.0mg/L或2，4-D0.53.0mg/L，暗培養(yǎng)1030天，形成愈傷組織；③將頂芽或側(cè)芽形成的愈傷組織接種于MS+BA3.05.0mg/L+NAA1.52.0mg/L或KT1.03.0mg/L+IAA0.11.0mg/L培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)一周后，給予2000LX的光照，光照時(shí)間1214小時(shí)/天，培養(yǎng)溫度25±2°C，愈傷組織分化形成不定芽；使用1/2MS培養(yǎng)基，使用NAA0.5-2.0mg/L激素，添加1g/L的活性碳，光照培養(yǎng)1030天，形成不定根；以上各步驟，均在培養(yǎng)基中添加瓊脂6.812g/L，蔗糖濃度為25%，經(jīng)121°C滅菌1520分鐘，pH5.65.8,光照強(qiáng)度2000LX，光照時(shí)間1216小時(shí)/天，培養(yǎng)溫度25土2'C。在組織培養(yǎng)過程中，在所有的培養(yǎng)基中添加15g/L的活性碳，20mg/L的維生素C，轉(zhuǎn)接種第一周暗處理，1020天轉(zhuǎn)種一次，使用810g/L的瓊脂增加培養(yǎng)基硬度，降低培養(yǎng)溫度至23'C。本發(fā)明研究過程中，采用了小紅參植株的不同部位植入不同激素組合的培養(yǎng)基進(jìn)行離體培養(yǎng)并進(jìn)行對(duì)照，用種子、根、根莖、真葉、花、果實(shí)、頂芽或側(cè)芽等不同外植體對(duì)誘導(dǎo)小紅參產(chǎn)生愈傷組織和不定芽，對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1(接種30天后觀察統(tǒng)計(jì))。表l.不同激素組合對(duì)不同植株部位產(chǎn)生愈傷組織的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由表2可知，在BAO.2mg/L+NAA2.0mg/L相同激素水平下，MS基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)小紅參真葉形成愈傷組織的效果要明顯優(yōu)于1/2MS和N6兩種培養(yǎng)基，愈傷誘導(dǎo)率可達(dá)95%，出現(xiàn)愈傷時(shí)間提前23天，生長(zhǎng)量最大。對(duì)三種基本培養(yǎng)基的愈傷誘導(dǎo)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果為對(duì)小紅參離體培養(yǎng)采用MS基本培養(yǎng)基最好。本發(fā)明還研究對(duì)照了不同激素濃度組合對(duì)頂芽或側(cè)芽形成愈傷組織的澎響。將外植體接種30天后觀察并統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表3所示。表3.不同激素濃度組合對(duì)愈傷組織形成的影響激素組合/mg.L—1出現(xiàn)時(shí)間/天誘導(dǎo)率/%顏色出愈量由表3可知，以MS為基本培養(yǎng)基，通過BA/NAA、BA/2,4_D、KT/2,4-D三組不同激素配比的比較，發(fā)現(xiàn)在BA/NAA組合中，BAO.2+NM1.03.Omg/L范圍內(nèi)均能產(chǎn)生愈傷組織，而當(dāng)BA濃度提高到0.5mg/L時(shí)，外植體只能芽萌發(fā)，而不形成愈傷組織。在BAO.2mg/L+2，4-D1.03.0mg/L和KTO.2mg/L+2，4-D1.03.0mg/L激素組合中，也均能產(chǎn)生愈傷組織。對(duì)表3中誘導(dǎo)率高于80%的②、③、⑧、⑨四種培養(yǎng)基進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果為四種培養(yǎng)基的愈傷誘導(dǎo)率差異并不顯著。但以出愈量和出愈時(shí)間看，MS+BA0.2mg/L+NAA3.0mg/L培養(yǎng)基出愈時(shí)間最早，1周左右在外植體生長(zhǎng)點(diǎn)上可見橙紅色愈傷組織形成，出愈量最大，愈傷誘導(dǎo)率可高達(dá)95%。本發(fā)明還研究了不同暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)離體培養(yǎng)的影響。以真葉為外植體接種30天后觀察并統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表4所示。真葉接種于MS+BA0.2mg/L+NAA2.0mg/L培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)不同暗培養(yǎng)時(shí)間的誘導(dǎo)率差異極顯著，即隨著暗培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，外植體形成愈傷組織的誘導(dǎo)率呈上升趨勢(shì)，愈傷組織的生長(zhǎng)量也隨之增加，出現(xiàn)愈傷組織的時(shí)間明顯提前。①BA0.2+NAA1.0②BA0.2+NAA2.0逢BAO.2+NAA3.0面BAO.5+NAA1.0福AO.5+NAA2.0⑥BA0.5+NAA3.0⑦BA0.2+2，4-D1.0i)BAO.2+2'4-D2.0⑨BA0.2+2,4-D3.0⑩KT0.2+2，4-D1.0(ll)KTO.2+2,4-D2.0咖TO.2+2'4-D3.0，中大小中中小中中色紅紅色紅紅色紅紅橙橙橙橙橙暗橙橙橙289000257058388377o1111-198Ha:T.HT1o11o))^.Intntn^loQ))111-9711-19表4.暗培養(yǎng)對(duì)愈傷組織形成的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本發(fā)明進(jìn)一步研究了不同激素濃度組合對(duì)愈傷組織分化成芽的影響。將真葉、頂芽或側(cè)芽形成的愈傷組織分別接種于不同激素配比的培養(yǎng)基上，30天后觀察并統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表5所示。表5.不同激素組合對(duì)愈傷組織幼苗分化的影響激素組合/mg.L—1分化率/%芽途①M(fèi)S+BA3.O十NAAO.546②MS+BA5.0+NAA0.590③MS+BA5.0+NAA1.095面MS+BA5.0+NAA1.5100MS+BA5.0十NAA2.0100⑥MS+BA3.0+KT2.0+NMO.593!^MS+BA3.0+KT3.0+NAAO.586翁MS+BA4.0+KT2.0+NAAO.568◎MS+BA4.0+KT3.0+NAAO.556在所有BA、KT與NAA的激素組合中，真葉的愈傷組織均未能分化出不定芽，而芽的愈傷組織均能分化形成不定芽。對(duì)表中分化率高于90%的、③、④、⑤、⑥五種培養(yǎng)基進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果為五種培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率差異極顯著。通過比較，芽的愈傷組織在BA5.0+NAA1.52.0的組合中，分化率達(dá)100%,長(zhǎng)勢(shì)最快，葉色濃綠。綜上所述，誘導(dǎo)小紅參組織產(chǎn)生的最佳條件為以真葉和頂芽或側(cè)芽為外植體，在MS+BA0.2mg/L+NAA3.0mg/L培養(yǎng)基上，進(jìn)行暗培養(yǎng)，愈傷誘導(dǎo)率高達(dá)95%。芽形成的愈傷組織在MS+BA5.0+NAA1.52.0的組合中均能分化出幼苗，分化率達(dá)100%，長(zhǎng)勢(shì)最快，葉色濃綠，而真葉形成的愈傷組織未能分化出苗。本發(fā)明首次通過人工培植的方法獲得了小紅參愈傷組織'，并通過所獲得的小紅參愈傷組織分化出幼苗。采用本發(fā)明方法，小紅參愈組織的誘導(dǎo)率高達(dá)95%以上，用頂芽或側(cè)芽培養(yǎng)的愈傷組織分化出的幼苗分化率達(dá)100%。極高的組織誘導(dǎo)率和幼苗分化率使得小紅參種苗工廠化快速繁殖成為可能，可有效解決目前野生資源不足，人工種植成活率低、藥材供不應(yīng)求的問題，為傳統(tǒng)彝藥的有效利用提供可靠的藥材資源保障。針對(duì)小紅參富含蒽醌等天然色素物質(zhì)的特性，本發(fā)明方法在組織培養(yǎng)過程中，通過添加活性碳、維生素C，轉(zhuǎn)接增加培養(yǎng)基硬度、降低培養(yǎng)溫度等方法，可有效減輕小紅參的褐化死亡。具體實(shí)施例方式實(shí)施例一小紅參種子采自楚雄星升藥業(yè)公司，連根挖起帶土移栽至實(shí)驗(yàn)室內(nèi)預(yù)培養(yǎng)，每23天用多菌靈溶液噴布，半個(gè)月后取材進(jìn)行小紅參組織的培養(yǎng)，方法步驟如下①取小紅參植株的頂芽或側(cè)芽為外植體，進(jìn)行清洗消毒，即用洗滌劑溶液浸5分鐘，自來水沖5分鐘后，用70%酒清浸泡10秒，再用0.2%升汞浸泡8分鐘，用無菌水沖洗8次；②將清洗消毒過的小紅參的頂芽或側(cè)芽接種到MS或1/2MS的培養(yǎng)基，使用BA0.05mg/L+NAA0.5mg/L，暗培養(yǎng)30天，形成愈傷組織；③將頂芽或側(cè)芽形成的愈傷組織接種于MS+BA3.0mg/L+NM1.5mg/L+IAA0.1mg/L培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)一周后，給予20001x的光照，光照時(shí)間14小時(shí)/天，培養(yǎng)溫度25士2。C，愈傷組織分化形成不定芽；使用1/2MS培養(yǎng)基，使用NAA0.5mg/L激素，添加lg/L的活性碳，光照培養(yǎng)30天，形成不定根；以上各步驟，均在培養(yǎng)基中添加瓊脂6.8g/L，蔗糖濃度為2%，經(jīng)121。C滅菌20分鐘，pH5.6，光照強(qiáng)度2000''LX，光照時(shí)間16'小時(shí)/天，培養(yǎng)溫度25±2°C。小紅參是富含蒽醌等天然色素物質(zhì)的植物，在組織培養(yǎng)過程中，容易褐化死亡。在上述組織培養(yǎng)過程中，在所有的培養(yǎng)基中添加1g/L的活性碳，20mg/L的維生素C，轉(zhuǎn)接種第一周暗處理，20天轉(zhuǎn)種一次，使用8g/L的瓊脂增加培養(yǎng)基硬度，降低培養(yǎng)溫度至23'C，能有效減輕小紅參的褐化死亡。實(shí)施例二、取材按如下方法步驟進(jìn)行小紅參組織的培養(yǎng)①取小紅參植株的頂芽或側(cè)芽為外植體，進(jìn)行清洗消毒，即用洗滌劑溶液浸5分鐘，自來水沖5分鐘后，用70%酒清浸泡10秒，再用0.2%升汞浸泡8分鐘，用無菌水沖洗12次；②將清洗消毒過的小紅參的頂芽或側(cè)芽接種到MS或1/2MS的培養(yǎng)基，使用BAO.5mg/L+NAA3.0mg/L，暗培養(yǎng)10天，形成愈傷組織；③將頂芽或側(cè)芽形成的愈傷組織接種于MS+BA5.0mg/L+NAA2.0mg/L+IAA1.0mg/L培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)一周后，給予2000LX的光照，光照時(shí)間12小時(shí)/天，培養(yǎng)溫度25土2'C，愈傷組織分化形成不定芽；④使用1/2MS培養(yǎng)基，使用NAA2.0mg/L激素，添加lg/L的活性碳，光照培養(yǎng)10天，形成不定根；以上各步驟，均在培養(yǎng)基中添加瓊脂12g/L,蔗糖濃度為5%，經(jīng)121°C滅菌15分鐘，pH5.8,光照強(qiáng)度2000LX，光照時(shí)間12小時(shí)/天，培養(yǎng)溫度25土2。C。在上述組織培養(yǎng)過程中，在所有的培養(yǎng)基中添加5g/L的活性碳，20mg/L的維生素C，轉(zhuǎn)接種第一周暗處理，IO天轉(zhuǎn)種一次，使用IOg/L的瓊脂增加培養(yǎng)基硬度，降低培養(yǎng)溫度至23'C，以減輕小紅參的褐化死亡。實(shí)施例三取材按如下方法步驟進(jìn)行小紅參纟且織的培養(yǎng)①取小紅參植株的頂芽或側(cè)芽為外植體，進(jìn)行清洗消毒，即用洗滌劑溶液浸5分鐘，自來水沖5分鐘后，用70%酒清浸泡10秒，再用0.2%升汞浸泡8分鐘，用無菌水沖洗10次；②將清洗消毒過的小紅參的頂芽或側(cè)芽接種到MS或1/2MS的培養(yǎng)基使用BA0.25mg/L+NAA1.5mg/L，暗培養(yǎng)20天，形成愈傷組織；③將頂芽或側(cè)芽形成的愈傷組織接種于MS+BA4.0mg/L+NAA1.8mg/L+IAA0.5mg/L培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)一周后，給予2000LX的光照，光照時(shí)間13小時(shí)/天，培養(yǎng)溫度25士2。C，愈傷組織分化形成不定芽；④使用1/2MS培養(yǎng)基，使用NAA1.0mg/L激素，添加lg/L的活性碳，光照培養(yǎng)20天，形成不定根；以上各步驟，均在培養(yǎng)基中添加瓊脂10g/L，蔗糖濃度為4%，經(jīng)-121。C滅菌18分鐘，pH5.7，光照強(qiáng)度2000LX，光照時(shí)間14小時(shí)/天，培養(yǎng)溫度25土2。C。在上述組織培養(yǎng)過程中，在所有的培養(yǎng)基中添加3g/L的活性碳，20mg/L的維生素C，轉(zhuǎn)接種第一周暗處理，15天轉(zhuǎn)種一次，使用9g/L的瓊脂增加培養(yǎng)基硬度，降低培養(yǎng)溫度至23'C，以減輕小紅參的褐化死亡。實(shí)施例四取材按如下方法步驟進(jìn)行小紅參組織的培養(yǎng)①取小紅參植株的頂芽或側(cè)芽為外植體，進(jìn)行清洗消毒，即用洗滌劑溶液浸5分鐘，自來水沖5分鐘后，用70%酒清浸泡10秒，再用0.2%升汞浸泡8分鐘，用無菌水沖洗8次；②將清洗消毒過的小紅參的頂芽或側(cè)芽接種到MS或1/2MS的培養(yǎng)基，使用KT0.05mg/L+2，4-D0.5mg/L，暗培養(yǎng)30天，形成愈傷組織；③將頂芽或側(cè)芽形成的愈傷組織接種于MS+BA3.0mg/L+KT1.0mg/L+IAA0.lmg/L培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)一爲(wèi)后，給予2000LX的光照，光照時(shí)間14小時(shí)/天，培養(yǎng)溫度25士2'C，愈傷組織分化形成不定芽；使用1/2MS培養(yǎng)基，使用NAA2.0mg/L激素，添加1g/L的活性碳，光照培養(yǎng)10天，形成不定根；以上各步驟，均在培養(yǎng)基中添加瓊脂12g/L，蔗糖濃度為5%，經(jīng)121°C滅菌15分鐘，pH5.6，光照強(qiáng)度2000LX，光照時(shí)間16小時(shí)/天，培養(yǎng)溫度25±2°C。在上述組織培養(yǎng)過程中，在所有的培養(yǎng)基中添加3g/L的活性碳，20mg/L的維生素C，轉(zhuǎn)接種第一周暗處理，15天轉(zhuǎn)種一次，使用8g/L的瓊脂增加培養(yǎng)基硬度，降低培養(yǎng)溫度至23"C，以減輕小紅參的褐化死亡。實(shí)施例五-.取材按如下方法步驟進(jìn)行小紅參組織的培養(yǎng)-①取小紅參植株的頂芽或側(cè)芽為外植體，進(jìn)行清洗消毒，即用洗滌劑溶液浸5分鐘，自來水沖5分鐘后，用70%酒清浸泡10秒，再用0.2%升汞浸泡8分鐘，用無菌水沖洗12次；②將清洗消毒過的小紅參的頂芽或側(cè)芽接種到MS或1/2MS的培養(yǎng)基，使用KT0.5mg/L+2，4-D3.0mg/L，暗培養(yǎng)10天，形成愈傷組織；③將頂芽或側(cè)芽形成的愈傷組織接種于MS+BA5.0mg/L+KT3.0mg/L+IAA1.0mg/L培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)一周后，給予2000LX的光照，光照時(shí)間12小時(shí)/天，培養(yǎng)溫度25士2t:，愈傷組織分化形成不定芽；使用1/2MS培養(yǎng)基，使用NAA0.5mg/L激素，添加1g/L的活性碳，光照培養(yǎng)30天，形成不定根；以上各步驟，均在培養(yǎng)基中添加瓊脂6.8g/L，蔗糖濃度為2%,經(jīng)121。C滅菌20分鐘，pH5.8，光照強(qiáng)度2000LX，光照時(shí)間12小時(shí)/天，培養(yǎng)溫度25±2°C。以上各步驟，在組織培養(yǎng)過程屮，在所有的培養(yǎng)基中添加5g/L的活性碳，20mg/L的維生素C，.轉(zhuǎn)接種第一周暗處理，IO天轉(zhuǎn)種一次，使用10g/L的瓊脂增加培養(yǎng)基硬度，降低培養(yǎng)溫度至23'C，以減輕小紅參的褐化死亡。實(shí)施例六取材按如下方法步驟進(jìn)行小紅參組織的培養(yǎng)①取小紅參植株的頂芽或側(cè)芽為外植體，進(jìn)行清洗消毒，即用洗滌劑溶液浸5分鐘，自來水沖5分鐘后，用70%酒清浸泡IO秒，再用0.2%升汞浸泡8分鐘，用無菌水沖洗9次；②將清洗消毒過的小紅參的頂芽或側(cè)芽接種到MS或1/2MS的培養(yǎng)基，使用KT0.3mg/L+2,4-D2.0mg/L,暗培養(yǎng)20天，形成愈傷組織；③將頂芽或側(cè)芽形成的愈傷組織接種于MS+BA4.0mg/L+KT2.5mg/L+IAA0.6mg/L培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)一周后，給予2000LX的光照，光照時(shí)間13小時(shí)/天，培養(yǎng)溫度25土2'C，愈傷組織分化形成不定芽；④使用1/2MS培養(yǎng)基，使用NAA1.5mg/L激素，添加1g/L的活性碳，光照培養(yǎng)25天，形成不定根；以上各步驟，均在培養(yǎng)基中添加瓊脂9g/L，蔗糖濃度為4%，經(jīng)12lt滅菌17分鐘，pH5.7,光照強(qiáng)度2000LX，光照時(shí)間15小時(shí)/天，培養(yǎng)溫度25士2。C。在上述組織培養(yǎng)過程中，在所有的培養(yǎng)基中添加4g/L的活性碳，20mg/L的維生素C,轉(zhuǎn)接種第一周暗處理，16天轉(zhuǎn)種一次，使用9g/L的瓊脂增加培養(yǎng)基硬度，降低培養(yǎng)溫度至23t:，以減輕小紅參的褐化死亡。實(shí)施例七取材按如下方法步驟進(jìn)行小紅參組織的培養(yǎng)-①取小紅參植株的頂芽或側(cè)芽為外植體，進(jìn)行清洗消毒，即用洗滌劑溶液浸5分鐘，自來水沖5分鐘后，用70%酒清浸泡10秒，再用0.2%升汞浸泡8分鐘，用無菌水沖洗ll次；'②將清洗消毒過的小紅參的頂芽或側(cè)芽接種到MS或1/2MS的培養(yǎng)基，使用BA0.3mg/L+2，4-D2.0mg/L，暗培養(yǎng)25天，形成愈傷組織；③將頂芽或側(cè)芽形成的愈傷組織接種于MS+BA4.0mg/L+KT2.0mg/L+IAA0.8mg/L培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)一周后，給予2000LX的光照，光照時(shí)間12小時(shí)/天，培養(yǎng)溫度25士2。C，愈傷組織分化形成不定芽；使用1/2MS培養(yǎng)基，使用NAA1.0mg/L激素，添加1g/L的活性碳，光照培養(yǎng)25天，形成不定根；以上各步驟，均在培養(yǎng)基中添加瓊脂10g/L，蔗糖濃度為3%，經(jīng)121°C滅菌15分鐘，pH5.65.8，光照強(qiáng)度2000LX，光照時(shí)間15小時(shí)/天，培養(yǎng)溫度25±2°C。在上述組織培養(yǎng)過程中，在所有的培養(yǎng)基中添加2g/L的活性碳，20mg/L的維生素C，轉(zhuǎn)接種第一周暗處理，15天轉(zhuǎn)種一次，使用IOg/L的瓊脂增加培養(yǎng)基硬度，降低培養(yǎng)溫度至23i:，以減輕小紅參的褐化死亡。權(quán)利要求1、小紅參組織培養(yǎng)方法，其特征在于，方法步驟如下①取小紅參植株的頂芽或側(cè)芽為外植體，進(jìn)行清洗消毒，即用洗滌劑溶液浸5分鐘，自來水沖5分鐘后，用70％酒清浸泡10秒，再用0.2％升汞浸泡8分鐘，用無菌水沖洗8～12次；②將清洗消毒過的小紅參的頂芽或側(cè)芽接種到MS或1/2MS的培養(yǎng)基，使用BA0.05～0.5mg/L或KT0.05～0.5mg/L+NAA0.5～3.0mg/L或2，4-D0.5～3.0mg/L，暗培養(yǎng)10～30天，形成愈傷組織；③將頂芽或側(cè)芽形成的愈傷組織接種于MS+BA3.0～5.0mg/L+NAA1.5～2.0mg/L或KT1.0～3.0mg/L+IAA0.1～1.0mg/L培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)一周后，給予2000LX的光照，光照時(shí)間12～14小時(shí)/天，培養(yǎng)溫度25±2℃，愈傷組織分化形成不定芽；④使用1/2MS培養(yǎng)基，使用NAA0.5～2.0mg/L激素，添加1g/L的活性碳，光照培養(yǎng)10～30天，形成不定根；以上各步驟，均在培養(yǎng)基中添加瓊脂6.8～12g/L，蔗糖濃度為2～5％，經(jīng)121℃滅菌15～20分鐘，pH5.6～5.8，光照強(qiáng)度2000LX，光照時(shí)間12～16小時(shí)/天，培養(yǎng)溫度25±2℃。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的小紅參組織培養(yǎng)方法，其特征在于，在組織培養(yǎng)過程中，在所有的培養(yǎng)基中添加15g/L的活性碳，20mg/L的維生素C，轉(zhuǎn)接種第一周暗處理，1020天轉(zhuǎn)種一次，使用810g/L的瓊脂增加培養(yǎng)S5更度，降低培蕭顯度至23-C。全文摘要小紅參組織培養(yǎng)方法。取小紅參植株的頂芽或側(cè)芽為外植體，清洗消毒后接種到MS或1/2MS的培養(yǎng)基，使用BA0.05～0.5mg/L或KT0.05～0.5mg/L+NAA0.5～3.0mg/L或2，4-D0.5～3.0mg/L，暗培養(yǎng)形成愈傷組織；將愈傷組織接種于MS+BA3.0～5.0mg/L+NAA1.5～2.0mg/L或KT1.0～3.0mg/L+IAA0.1～1.0mg/L培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)一周后給予光照，使愈傷組織分化形成不定芽；再用1/2MS培養(yǎng)基，使用NAA0.5～2.0mg/L激素，添加1g/L的活性炭，光照培養(yǎng)形成不定根。本發(fā)明能提高小紅參愈傷組織的誘導(dǎo)率，提高幼苗分化率，從而實(shí)現(xiàn)小紅參種苗工廠化快速繁殖。文檔編號(hào)C12N5/04GK101353637SQ20081005887公開日2009年1月28日申請(qǐng)日期2008年9月2日優(yōu)先權(quán)日2008年9月2日發(fā)明者羅春梅,璐邱申請(qǐng)人:楚雄師范學(xué)院