專利名稱：一種酵母細(xì)胞破壁的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真菌細(xì)胞破壁的方法，具體是一種啤酒酵母或面包酵母細(xì)胞破壁的方法。
二背景技術(shù)：
酵母尤其是啤酒酵母和面包酵母是重要的食品工業(yè)微生物，其細(xì)胞壁從外向內(nèi)分三層， 外層為甘露聚糖，中間層含有豐富的蛋白質(zhì)，內(nèi)層為葡聚糖。酵母破壁的水解提取液可以加 工調(diào)味品、保健品原料、生物制品等多種深加工產(chǎn)品，還可以加工成多糖。目前常用的酵母 細(xì)胞破壁方法有機(jī)械法，酵母細(xì)胞自溶法，酶促水解法和凍融法。機(jī)械方法用高壓勻漿、 珠磨法等，設(shè)備條件要求高。常規(guī)的凍融法、自溶和酶解方法對(duì)酵母細(xì)胞的破壁率較低，使 用過程中都有一定的局限性。
三
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種酵母細(xì)胞破壁的方法，可用于啤酒酵母或面包酵母細(xì)胞的破 壁、溶解，以彌補(bǔ)現(xiàn)有酵母細(xì)胞破壁技術(shù)的不足，提高破壁效率。
本發(fā)明以半胱氨酸(或其鹽類)作為啤酒酵母或面包酵母細(xì)胞的促溶劑或破壁劑。其促
溶機(jī)理可能在于①半胱氨酸把形成酵母細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)鏈中的雙硫鍵-S-S還原成-SH，在 一定程度上松開其緊密結(jié)構(gòu),有利于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞。②加入半胱氨酸可以消除細(xì)胞外Cu2+、 Hg2+、 Al3+、 Pb2+等重金屬離子對(duì)酵母細(xì)胞胞內(nèi)酶和胞外酶的毒害作用，提高自溶或加酶水解破
壁的活力。③作為還原性物質(zhì)，半胱氨酸可以減少酵母細(xì)胞內(nèi)外蛋白酶的氧化變性。
本發(fā)明提供的一種酵母細(xì)胞破壁的方法，包括如下步驟
1) 、將廢酵母泥用水稀釋，過篩除雜，在3000rpm下離心10-20min，得到的酵母泥加水 配成活菌懸液，水的加入量為酵母泥質(zhì)量的2-3倍；
2) 、在活菌懸液中加入半胱氨酸或半胱氨酸鹽酸鹽，加入量為酵母泥質(zhì)量的0.1-1.0%， 再按每克酵母泥IOO-IOOOU加入中性蛋白酶，控制PH6-8，在4(TC-60。C下保溫水解6-48小 時(shí)，得到酵母水解液；
3)、酵母水解液經(jīng)離心得到酵母沉淀，再加入3-20質(zhì)量倍的水配制成酵母細(xì)胞懸浮液， 在-25'C -4(TC凍結(jié)，微波爐中解凍，在恒溫水浴中加熱到35°C-45°C，保溫0. 5-1. 5h;然 后按每100mL酵母細(xì)胞懸浮液加入2.6-3.5g的食鹽，進(jìn)行第二次凍結(jié)，凍結(jié)溫度-25'C -40 'C，凍結(jié)的酵母液再次用微波解凍；如此加鹽、凍結(jié)、解凍重復(fù)2-5次。然后用顯微鏡觀察 細(xì)胞破壁情況，破壁率達(dá)到95%以上。
上述步驟中所述的酵母是啤酒酵母或面包酵母。所述的中性蛋白酶是細(xì)菌中性蛋白酶 或霉菌中性蛋白酶。所述的在酵母細(xì)胞懸浮液加入食鹽的步驟可以用50'C-70。C下真空濃縮酵 母細(xì)胞懸浮液代替。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果
一是，在酵母液中加入中性蛋白酶和半胱氨酸(或其鹽酸鹽)，進(jìn)行酶促自溶水解，可以 提高酵母細(xì)胞溶解和破裂程度。從已有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，半胱氨酸是用于食品、藥品及生物制品的 常見添加劑。此外，半胱氨酸還用作木瓜蛋白酶的激活劑和肉的品質(zhì)改良劑，但是尚未見到 在酵母細(xì)胞破壁中的應(yīng)用。本發(fā)明用半胱氨酸(或其鹽酸鹽)作為細(xì)菌中性蛋白酶或霉菌中 性蛋白酶水解酵母細(xì)胞的促溶劑，與其它酵母促溶劑相比，優(yōu)點(diǎn)在于①添加量少，生產(chǎn)成 本低，操作簡便；②提高了中性蛋白酶水解酵母的活性和穩(wěn)定性；③水解液中的氨基氮含量 明顯提高，測其含量(扣除加入的半胱氨酸)比不加半胱氨酸促溶劑提高了 10-50%。
二是，將蛋白酶促溶水解后的酵母液進(jìn)行凍結(jié)-微波解凍融化，第一次解凍液加熱到35-45 'C保溫0.5-1.5h，然后再加入氯化鈉或真空濃縮，提高氯化鈉的濃度后，進(jìn)行凍結(jié)-微波解 凍融化。通過提高氯化鈉濃度或不斷濃縮，降低酵母液冰點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)在不同溫度段進(jìn)行酵母的 凍融；通過微波快速解凍，提高凍結(jié)酵母的融化速度。凍融法己廣泛應(yīng)用于植物(如葛仙米)、 動(dòng)物(如豬血細(xì)胞)、藻類(如鈍頂螺旋藻)、微生物(如蜜環(huán)菌)的細(xì)胞破壁。但是常規(guī)的 凍融方法是將凍結(jié)細(xì)胞于室溫下融化，然后再凍結(jié)，從而破壞細(xì)胞壁。多次凍融可增加細(xì)胞 溶脹破碎的比率。試驗(yàn)表明，常規(guī)法凍融酵母3次，只有約40-50%的酵母細(xì)胞破碎，而用本 發(fā)明的方法可以使酵母細(xì)胞破碎率達(dá)到95%以上。
總之，本發(fā)明是將半胱氨酸(或其鹽酸鹽)促進(jìn)中性蛋白酶水解與梯度降溫凍結(jié)、微波 快速解凍技術(shù)相結(jié)合，可使酵母細(xì)胞破壁率達(dá)到95%以上。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
將啤酒廢酵母泥(啤酒廠副產(chǎn)物)用水稀釋后，用80目的篩子過篩除雜，在3000rpm下 離心15min，傾出上清液，將干凈的酵母泥沉淀取出，放入4'C的冰箱中保存、待用；稱取酵 母泥20g，加40ml水制成懸浮液，加入半胱氨酸鹽酸鹽0.06g，再加入AS1.398中性蛋白酶 O.lg，然后在PH7，溫度為45'C保溫水解24小時(shí)；水解后高溫滅酶、冷卻，離心去清液，得 到沉淀16.5g;加330ml水配制成酵母細(xì)胞懸浮液，在-25。C凍結(jié)，微波爐中解凍，在恒溫水 浴中加熱到4(TC，保溫lh，加入11.4g食鹽，在-25'C進(jìn)行第二次凍結(jié)，凍結(jié)的酵母液再次用 微波解凍；如此加鹽、凍結(jié)、解凍重復(fù)2次；顯微鏡觀察，破壁率為96%。
實(shí)施例2
將啤酒廢酵母泥稀釋、過篩除雜，在3000rpm下離心，棄上清液；稱取酵母泥20g，加 40ml的水制成懸浮液，加入O. lg半胱氨酸，再加入米曲霉中性蛋白酶0.4g，用磷酸鹽調(diào)懸 浮液PH到6. 5，于5(TC恒溫水浴鍋中水解10h;高溫滅酶、離心后得到沉淀17. 2g，加175ml 水配制成酵母細(xì)胞懸浮液，在-4CTC凍結(jié)，微波爐中解凍，解凍液在45'C保溫0.5小時(shí)，加 入4.5g的食鹽，進(jìn)行下一次凍結(jié)，凍結(jié)溫度仍在-40'C，凍結(jié)的酵母液再次用微波解凍；如 此加鹽、凍結(jié)、解凍重復(fù)4次；計(jì)算酵母破壁率可以達(dá)到97%。
實(shí)施例3
取20g面包干酵母，放入40ml2。/。的蔗糖溶液，在40'C下活化10min，然后于3(TC培養(yǎng)2 小時(shí)，將養(yǎng)分消耗干凈；再加入半胱氨酸鹽酸鹽0.2§和高溫中性蛋白酶0.28，調(diào)PH為7.5, 于55。C恒溫水解40h;滅酶后離心，得到沉淀16.8g，加250ml水配制成酵母細(xì)胞懸浮液， 在-35。C凍結(jié)，微波爐中解凍，在恒溫水浴中加熱到35。C，保溫1.5h，然后在55。C進(jìn)行真空 濃縮，減少水分50%，在-35'C下進(jìn)行第二次冷凍，微波解凍，計(jì)算酵母破壁率可以達(dá)到95%。
權(quán)利要求
1、一種酵母細(xì)胞破壁的方法，其特征在于包括如下步驟1)、將廢酵母泥用水稀釋，過篩除雜，在3000rpm下離心10-20min，得到的酵母泥加水配成活菌懸液，水的加入量為酵母泥質(zhì)量的2-3倍；2)、在活菌懸液中加入半胱氨酸或半胱氨酸鹽酸鹽，加入量為酵母泥質(zhì)量的0.1-1.0％，再按每克酵母泥100-1000U加入中性蛋白酶，控制PH6-8，在40℃-60℃下保溫水解6-48小時(shí)，得到酵母水解液；3)、酵母水解液經(jīng)離心得到酵母沉淀，再加入3-20質(zhì)量倍的水配制成酵母細(xì)胞懸浮液，在-25℃～-40℃凍結(jié)，微波爐中解凍，在恒溫水浴中加熱到35℃-45℃，保溫0.5-1.5h；然后按每100mL酵母細(xì)胞懸浮液加入2.6-3.5g的食鹽，進(jìn)行第二次凍結(jié)，凍結(jié)溫度-25℃～-40℃，凍結(jié)的酵母液再次用微波解凍；如此加鹽、凍結(jié)、解凍重復(fù)2-5次。
2、 如權(quán)利要求1所述的酵母細(xì)胞破壁的方法，其特征在于，所述的酵母是啤酒酵母。
3、 如權(quán)利要求1所述的酵母細(xì)胞破壁的方法，其特征在于，所述的酵母是面包酵母。
4、 如權(quán)利要求l、 2或3所述的酵母細(xì)胞破壁的方法，其特征在于，所述的中性蛋白 酶是細(xì)菌中性蛋白酶或霉菌中性蛋白酶。
5、 如權(quán)利要求l、 2或3所述的酵母細(xì)胞破壁的方法，其特征在于，所述的在酵母細(xì) 胞懸浮液加入食鹽的步驟可以用50'C-7(TC下真空濃縮酵母細(xì)胞懸浮液代替。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種酵母細(xì)胞破壁的方法，步驟包括酵母泥加水配成活菌懸液；加入半胱氨酸或半胱氨酸鹽酸鹽和中性蛋白酶，控制pH6-8，在40℃-60℃下保溫水解6-48小時(shí)，得到酵母水解液；酵母水解液經(jīng)離心得到酵母沉淀，再加水配制成酵母細(xì)胞懸浮液，再經(jīng)數(shù)次凍結(jié)和微波解凍，破壁率達(dá)到95％以上。本發(fā)明將半胱氨酸促溶、梯度降低冰點(diǎn)凍結(jié)和微波快速解凍相結(jié)合，大大提高了酵母細(xì)胞破壁率。本發(fā)明細(xì)胞破壁工藝操作簡便，對(duì)設(shè)備要求低，很適合于啤酒酵母或面包酵母細(xì)胞的破壁。
文檔編號(hào)C12N1/18GK101195808SQ20081005442
公開日2008年6月11日 申請(qǐng)日期2008年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月8日
發(fā)明者莉 伊, 王常青 申請(qǐng)人:山西大學(xué) 被以下專利引用 (1),