專利名稱：一種雙色熒光報告載體的構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學和抗病毒研究領域，可以高通量地篩選出抗病毒的 siRNA藥物。更具體地講，本發(fā)明涉及一種雙色熒光報告載體，同時涉及到雙色熒 光報告載體的構建方法，以及該發(fā)明在高通量且精確評估siRNA效率中的應用。
背景技術：
RNA干擾(RNAi)是一種從酵母到人都保守的分子機制雙鏈的小干擾RNA(siRNA) 中的一條鏈被整合到RISC (RNA—Induced Silencing Complex)中去> 當此條鏈找 到與之配對的耙標mRNA時，革E標mRNA隨之將被RISC序列特異性的切割然后降解掉 (Fire A, Xu SQ, Montgomery MK， Kostas SA, Driver SE， Mello CC 1998 Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. jVo/we 391: 806-811.)?，F(xiàn)在RNAi被越來越多的應用到在單個基因或者是基因組水平來研究 基因的功能(Hannon GJ, Rossi JJ 2004 Unlocking the potential of the human genome wkh RNA interference. Atowe 431: 371-378.; Dorsett Y, Tuschl T 2004 siRNAs: applications in functional genomics and potential therapeutics. Atowre Wev. Z)/ w, 3: 318-329.)，同時對于那些基于基因沉默的治療方法而言RNAi更代表著一種有應用 價值的新手段(Dorsett Y, Tuschl T 2004 siRNAs: applications in functional genomics and potential therapeutics. iVa/匿Drag Zfccov. 3: 318-329.; Shuey DJ, McCallus DE, Giordano T 2002 RNAi: gene-silencing in therapeutic intervention. Z)rag ￡fccov. 7b— 7: 1040-1046.; Sioud M 2004 Therapeutic siRNAs. 7>e *尸/ 簡腳/.5W. 25: 22-8.)。 siRNA的應用所面臨的一個最主要的挑戰(zhàn)就是設計出有效的siRNA來沉默基 因的表達。平均而言，被挑選出來的siRNA中，僅有五分之一能夠引起有效的基因沉默(Kumar R, Conklin DS, Mittal V 2003 High-Throughput Selection of Effective RNAi Probes for Gene Silencing. G細附e紐13: 2333-2340.; McManus MT, Shaqp PA 2002 Gene silencing in mammals by siRNAs. iVaf. i ev. 3: 737-747,; Kapadia SB,Brideau-Andersen A, Chisari FV 2003 Interference of hepatitis C virus RNA replication by short interfering RNAs. Prac. A^/. Jew/. 5W. 100: 2014—2018.)。 siRNA不能引起有 效的基因沉默的可能原因可以歸結為siRNA在體內(nèi)的不穩(wěn)定性；siRNA同RISC的組 分不可相互作用性；或者由于靶標mRNA的本地二級結構的束縛所導致的靶標的不可 進入性等等。最近由于深刻理解了RNAi介導的基因沉默的生化機制和大規(guī)模地分析 耙向同一個基因的各不相同的siRNA，很多關鍵地影響siRNA效果的規(guī)則都被揭示出 來。這些規(guī)則明顯優(yōu)化了設計出合理s i RNA的方案(Mittal V 2004 Improving the efficiency of RNA interference in mammals. iVa/. i ev. Ge贈.5: 355-365.; Reynolds A, Leake D， Boese Q, Scaringe S， Marshall WS, Khvorova, A 2004 Rational siRNA design for RNA interference.淑5/她c力wo/. 22: 326-330.; Ui-Tei K, Naito Y, Takahashi F, Haraguchi T, Ohki-Hamazaki H, Juni A, Ueda R, Saigo K 2004 Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference. M/c/e/c J"V/y 32: 936-948.; Khvorova A, Reynolds A， Jayasena SD 2003 Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias, Ce〃 115: 209-216.; Schwarz DS, Hutvagner G" Du T, Xu Z， Aronin N, Zamore PD 2003 Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Ce// 115: 199-208.; Holen T, Amarzguioui M, Wiiger MT, Babaie E, Prydz H 2002 Positional effects of short interfering RNAs targeting the human coagulation trigger Tissue Factor. iVwc/e/c爿c油及e兄30: 1757-1766.; Ameres SL, Martinez J, Schroeder R 2007 Molecular basis for target RNA recognition and cleavage by human RISC. Ce〃 130: 101-112.)。即使這種經(jīng)過改進之后的方案增加了設計出有 效的siRNA的機率，但是它既不能確保單個預測的siRNA的有效性更不能確保所預測 出的就是現(xiàn)實中最有效的siRNA。因此，現(xiàn)在人們花費大量的人力物力投入到從一大 群siRNA中篩選出有效siRNA序列這一工作中去。(Vickers TA, Koo S， Bennett C F， Crooke ST, Dean NM, Baker BF 2003 Efficient reduction of target RNAs by small interfering RNA and RNase H-dependent antisense agents. 乂 278: 7108-7118.; Kumar R, Conklin DS, Mittal V 2003 High-Throughput Selection of Effective RNAi Probes for Gene Silencing. Gewowe 13: 2333-2340,; Kasim V, TairaK, Miyagishi M 2006 Screening of siRNA target sequences by using fragmentized DNA.Med 8: 782-791.; Hung CF, Lu KC, Cheng TL, Wu RH， Huang LY, Teng CF, Chang WT 2006 A novel siRNA validation system for functional screening and identification of effective RNAi probes in mammalian cells. 5io/7/7少s. Cowhw". 346: 707-720.; Echeverril CJ, Perrimon N 2006 High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. jV抓Gewe/. 7: 373-384.)。如果是出于治療的目的，那么對一個siRNA探針的效率進行定量變得特別重要。 對一大群si題A進行精確的定量可以篩選出最有效的siRNA探針以進行動物實驗和 臨床實驗。許多定量分析的方法己經(jīng)被發(fā)展出來以報告siRNA的效率，這些方法大 體可以歸結為兩類第一類是利用細胞群體破碎后不同熒光素酶表達水平來量化 siRNA的沉默效果(Vickers TA, Koo S, Bennett C F, Crooke ST, Dean NM, Baker BF 2003 Efficient reduction of target RNAs by small interfering RNA and RNase H-dependent antisense agents. 細/. C7 綴278: 7108-7118.; Smart N， Scambler PJ, Riley PR 2005 A rapid and sensitive assay for quantification of siRNA efficiency and specificity. Pracet/. 7: 1-7.)。
例如Du等人設計了一種名為siQuant的質粒，此種質粒將作為siRNA靶標的寡核苷酸序列通過Bgl II和Apa I雙酶切克隆到 螢火蟲熒光素酶之后，使得被克隆的序列緊隨螢火蟲熒光素酶的起始密碼子，這樣 有活性的siRNA就會下調(diào)螢火蟲熒光素酶的表達。為了評估siRNA的抑制效率， Du等人借助Promega公司的雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)進行分析。在實驗時，將 siRNA同siQuant質粒和另外一個能表達海腎熒光素酶的質粒這三者一起共轉染入 細胞中。此系統(tǒng)中， 一個報告基因(螢火蟲熒光素酶)活力的改變，直接相關于siRNA 的抑制活性，而第二個報告基因(海腎熒光素酶)的組成性活力則提供了內(nèi)參，使 實驗值可以規(guī)一化，這樣也就達到了定量的目的。在結果檢測時，此方法需要破解 細胞并在細胞裂解液中加入螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶各自對應的熒光素底 物，Du等人隨后使用熒光素酶檢測儀進行檢測得到了較好的實驗結果(Du Q, Thonberg H, Zhang HY, Wahlestedt C, Liang ZC 2004 Validating siRNA using a reporter made from synthetic DNA oligonucleotides, 5/ochem. 5z'op/ ys. Commtm. 325:243-249.)。第二類定量分析si脂A效率的方法就是用不同的質粒表達兩個熒光蛋白， 一個熒光蛋白基因作為內(nèi)參放在一個載體上，另一熒光蛋白基因放在另一個載體被靶標 所融合，它們同siRNA/shRNA(小發(fā)夾RNA)共轉染之后，利用儀器在不破碎細胞的 前提下測出兩種熒光的強度以其比值來表征siRNA的活性(Hirano T, Yamauchi N, Sato F, Soh T, Hattori MA 2004 Evaluation of RNA interference in developing porcine granulosa cells using fluorescence reporter genes. J", i eprat/ Z)ev. 50: 599-603.; Sipa K， Sochacka E， Kazmierczak陽Baranska J, Maszewska M, Janicka M， Nowak G, Nawrot B 2007 Effect of base modifications on structure, thermodynamic stability, and gene silencing activity of short interfering. T^A^. 13:30卜16.)。例如Kumar等人設計出了一 種RNAi微陣列(microarray)的方法以達到高通量地篩選出有效的siRNA/shRNA。 為了能夠達到在基因芯片上進行高通量篩選的目的，作者們構建了一個能表達綠色 熒光蛋白的質粒，在此質粒中EGFP和靶標基因前后融合在一起，與此同時還利用 了一個能表達紅色熒光蛋白的質粒pDsRed2—Nl作為內(nèi)參以規(guī)一化試驗結果達到 定量RNAi效率的目的。在實驗中，此兩種質粒與各自不同的siRNA/shRNA以液體 的形式混勻在一起，隨后將得到的各自不同的混和液分裝于384孔板中。利用陣列 儀(armyer)將此液體印刻到一種特殊的載玻片表面。為了達到轉染的目的，轉染 溶液被吸入到一個特殊的孔槽中，隨后將上面載玻片被印刻的那一面向下蓋在這個 孔槽上。45分鐘后，移去裝有轉染溶液的孔槽，將處理過的載玻片面朝上放入一個 特殊的培養(yǎng)瓶中與一定數(shù)目的細胞進行共轉染。24小時后，將生長在載玻片上的細 胞固定包裝好，用激光掃描儀掃描載玻片，隨后用相應的軟件分析獲得綠色熒光蛋 白和紅色熒光蛋白各自的熒光強度。這樣得到載玻片上每個點的綠/紅熒光強度之 后，利用綠色熒光強度除以紅色熒光強度的數(shù)值進行規(guī)一化之后，就能定量地計算 出各個樣品中RNAi的效率(Kumar R， Conklin DS, Mittal V 2003 High-Throughput Selection of Effective RNAi Probes for Gene Silencing. Ge"cw/e 13: 2333-2340.)。上面的兩類定量分析RNAi效率的方法各有優(yōu)缺點。第一類方法優(yōu)點是比較簡 便，容易實施，第二類方法優(yōu)點是能進行高通量篩選。但是這兩大方法都存在一個 主要的缺點就是在進行定量的時候，不能夠精確地放映出siRNA的抑制效率。例 如這兩大方法需要將三種物質(兩個熒光載體和siRNA)共轉染進細胞，所以它們 都避免不了進行共轉染所導致的兩個熒光報告基因間轉染效率的差異這一共同挑戰(zhàn)(Echeverril CJ， Perrimon N 2006 High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. Ato. Gen" 7: 373-384.)。當這些熒光物質的基因被轉染進細胞后 會出現(xiàn)如下情況有的細胞無熒光信號；有的細胞只能檢測到其中一種熒光信號； 有的則兩種熒光信號兼而有之。因此上述兩類方法中用整個細胞群而不是挑選出符 合要求的細胞進行定量分析的方法顯然是不精確的。而且在第一類方法中細胞不是 在生理條件下實施檢測的，所以檢測細胞必須被裂解掉，這無疑也影響到定量的精 確性。在藥物治療和功能基因組學方面，我們尤其需要建立一個精確的定量系統(tǒng)以 在單體活細胞水平高通量地評估出siRNA/shRNA的效率。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供了一種雙色熒光報告載體，該載體pEGFP/DsRed及其 衍牛載體pEGFP/DsRed-HBx是在同一個載體上利用兩套不同的順式作用元件同時獨 立地能在真核細胞中表達出綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白的載體。該載體明顯克服 了先前將兩個熒光報告基因分別放在兩個不同的載體中進行共轉染所導致的兩個 熒光報告基因間轉染效率的差異這一共同難題，此發(fā)明為在單體活細胞水平精確定 量siRNA的效率奠定了堅實的物質基礎。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種雙色熒光報告載體pEGFP/DsRed及其衍 生質粒pEGFP/DsRed-HBx的構建方法，方法簡便易行，試驗操作方便。本發(fā)明的再一個目的是在于提供了雙色熒光報告載體pEGFP/DsRed-HBx在高通 量篩選且精確定量siRNA效率中的應用?；诒景l(fā)明中的雙色熒光報告載體 pEGFP/DsRed-HBx而提出的定量熒光流式細胞術的方法大大提升了評估siRNA效率 的精確性。定量熒光流式細胞術是一種靈敏高效且簡單易行的方法，數(shù)據(jù)可以被連 續(xù)的收集并且細胞能夠根據(jù)需要馬上被分成多個亞區(qū)(subp叩ulation)以進行分 析；同時其每次可以測量大量的細胞以提供進行統(tǒng)計學分析的需要。更為重要的是， 此種方法可以在單體活細胞水平進行檢測，而且計算出的結果具有高度的可信性和 可重復性。為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術措施本發(fā)明所述的雙色熒光報告載體pEGFP/DsRed及其衍生載體pEGFP/DsRed-HBx是可在同一個載體上分別表達出綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白的真核表達載體。其 首次由發(fā)明人提出并構建成功。本發(fā)明中的雙色熒光報告載體pEGFP/DsRed和 pEGFP/DsRed-HBx中的紅色熒光蛋白基因(DsRed-Monomer)克隆自BD Biosciences Clontech公司生產(chǎn)的pDsRed-Monomer-Nl質粒，其由CMV立即早期啟動子(PcMvn3) 來表達，綠色熒光蛋白基因(EGFP)克隆自BD Biosciences Clontech公司生產(chǎn)的 pEGFP-Nl質粒，其由SV40早期啟動子(PSV4()e)來表達。乙肝病毒(HBV)的X蛋 白(HBx)基因作為靶標經(jīng)過Not 1和Xba I酶切被融合到雙色熒光報告載體 pEGFP/DsRed中的紅色熒光蛋白基因DsRed-Monomer的終止密碼子之后，因此HBx 就成為了 DsRed-Monomer的3' UTR而不被翻譯出來。此衍生質粒在本發(fā)明中被命 名為pEGFP/DsRed-冊x。這樣此衍生質粒pEGFP/DsRed-HBx就可以僅僅表達出完整 的紅色熒光蛋白而避免了紅色熒光蛋白遭融合后的影響。在本發(fā)明的這個雙色熒光 報告系統(tǒng)pEGFP/DsRed-HBx中，EGFP發(fā)出的綠色熒光被用來篩選出那些被轉染進了 雙色熒光報告載體的細胞，同時其發(fā)出的綠色熒光強度也能反映出被轉染的雙色熒 光報告載體上類似基因的表達水平；另一方面由于靶定冊x的siRNA的干擾作用導 致了 DsRed-Monomer紅色熒光蛋白表達水平發(fā)生了改變，也就是導致了紅色熒光強 度發(fā)生了變化。紅色熒光強度的這種變化就關聯(lián)于siRNA的抑制效果。將紅/綠熒 光蛋白基因設計在同一個載體中且用不同的順式作用元件進行表達有著明顯的好 處。這種方法明顯克服了先前將兩個熒光報告基因分別放在兩個不同的載體中進行 共轉染所導致的兩個熒光報告基因間轉染效率的差異這一共同難題(Echeverril CJ， Perrimon N 2006 High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. AW.7: 373-384.)。本發(fā)明中的pEGFP/DsRed-HBx雙色熒光報告系統(tǒng)確保了同 樣拷貝的EGFP和DsRed-Monomer基因被轉染進同一個單體活細胞中。因此EGFP的 表達應當與DsRed-Monomer的表達成線形關系，并且此相關性在細胞狀態(tài)一致的前 提下不會受轉染效率變化之影響。本發(fā)明中的pEGFP/DsRed-HBx雙色熒光報告載體上紅/綠熒光蛋白間的相關性， 依據(jù)流式細胞術通過測量單個細胞內(nèi)發(fā)射的紅/綠熒光強度最后計算出目的細胞群 的平均紅/綠熒光強度來進行確定?；诟髯詫钠骄鶡晒鈴姸?MFI)，在多次 驗中申請人都模擬出了平均紅/綠熒光強度間關聯(lián)度很好的直線。此結果證明了在同一批次的實驗中，雙色熒光報告系統(tǒng)pEGFP/DsRed-HBx中的紅綠熒光蛋白間確實 存在著不受轉染效率變化影響的直線關系，具體直線關系請見圖11 (C)，圖13(A)、 (B)、 (C)。這條直線申請人稱之為校準曲線。當能引起干擾作用的siRNA與本發(fā) 明中的pEGFP/DsRed-HBx —起被共轉染進細胞時，目的細胞群的平均紅色熒光強度 將會發(fā)生明顯的改變；與此同時其對應的平均綠色熒光強度(MFI of EGFP)的整 體水平在干擾發(fā)生前后不會改變(見圖12)。因此目的細胞群的平均綠色熒光強度 可以作為內(nèi)參以衡量siRNA起作用之后平均紅色熒光強度的變化?；谏厦娴男?曲線，通過平均綠色熒光強度這一內(nèi)參，可以計算出siRNA在還沒有起作用時的理 論平均紅色熒光強度(tMFI of DsRed-Monomer)。當siRNA發(fā)揮生物學功能之后， 利用流式細胞儀測出目的細胞群此時的平均紅色熒光強度(MFI of DsRed-Monomer)。那么siRNA的抑制效率就可以用公式表示為siRNA抑制效率=(藩I 一 MFI)DsRed—Monomer / tMF工DsRed X 100%?；诖?，申請人將本發(fā)明中的pEGFP/DsRed-HBx同si脂A共轉染進Linx細胞系(其來源見Tong WP, Zhou Y， Wang X， Yang F， Wu KL， Wu J， Zhang Y 2008 An accurate quantitative method for screening effective siRNA probes targeting a Hepatitis B virus transcript in single living cells. Biochem Biophys Res Com腿n. 367:866-73。)中去，利 用定量流式細胞術快速高效的篩選并計算出了有效的siRNA的抑制效率(見圖13)。 此種方法計算出的結果同在熒光顯微鏡下檢測的實驗結果非常一致(見圖12)。本 發(fā)明提供了一種在單體活細胞水平精確快速定量siRNA效率的方法。構建一種雙色熒光報告載體pEGFP/DsRed及其衍生質粒pEGFP/DsRed-HBx的具 體試驗技術可以參考Joe Sambrook, David Russell等編寫的Molecular Cloning: A Laboratry Manual, Cold Spring Harbor Lab(CSHL) Press, 2001。本發(fā)明中 轉化大腸桿菌DH5 a (Gibco BRL公司產(chǎn)品)和ER2925 (New England Biolabs公司產(chǎn) 品)采取的都是氯化鈣轉化法，所用限制性內(nèi)切核酸酶購買自New England Biolabs 公司、Fermentas或者是Takara公司，并且對所有以PCR擴增方式做出的克隆都進 行了測序。本發(fā)明通過以質粒pEGFP-Nl和pDsRed-Monomer-Nl (均購買自BD Biosciences Clontech公司)為基本平臺，構建雙色熒光報告載體所采取的設計10思路和技術措施如下1、 衍生質粒pEGFP-N卜Ampicillin的構建。將帶有啟動子和轉錄終止信號的氨 芐基因插入到pEGFP-Nl載體中，由此衍生出的質粒被命名為pEGFP-Nl-Ampicillin(見圖1)。帶有啟動子和轉錄終止信號的氨芐抗性基因序列是以pUC18 (Takara公 司產(chǎn)品)為模板利用KOD DNA聚合酶(TOYOBO公司產(chǎn)品)擴增出pUC18中從1566 到 2617 的 一 段 DNA 序歹U 。 所用 5'引物 Pl 為 CCTAGATCTTAAGAAATTAAAAATGAAGTTT (下劃線為引入的Bgl II酶切位 點)；3'弓I物P2為TAATAATGGTTTCACGTAGTGCAGGTGGC (下劃線為引 入的DraIII酶切位點)。質粒pEGFP-Nl被Afl II單酶切后通過KOD DNA聚合酶 補成平末端。隨后用Cycle-Pure Kit (E.Z.N.A公司產(chǎn)品)純化被補成平末端的 pEGFP-Nl質粒。為了提高克隆成功的概率，減少載體自連，接著對被補成平末端的 pEGFP-Nl質粒進行了去磷酸化操作，同時對上述擴增出帶有啟動子和轉錄終止信號 的氨芐抗性基因序列進行磷酸化操作。然后用Cycle-Pure Kit (E.Z.N.A公司產(chǎn)品)分 別純化已經(jīng)去磷酸化的和磷酸化的上述體系。將純化后得到的被磷酸化的1086bp 長度的帶有啟動子和轉錄終止信號的氨芐抗性基因序列(KOD DNA聚合酶的產(chǎn)物本 身就是平末端)與被純化后的平滑化的被去磷酸化的pEGFP-Nl進行連接反應。連接 后的產(chǎn)物轉化完大腸桿菌E.coli DH5a感受態(tài)細胞之后，直接將被轉化的細菌放入 含60 |xg/ml氨芐青霉素和50 (xg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中于37 °C搖床中過 夜培養(yǎng)。24小時后收集生長起來的細菌，用堿法抽提出質粒，將所得質粒再次轉化 DH5a感受態(tài)細胞，將被轉化細胞鋪板于含60 (ag/ml氨芐青霉素和50 pg/ml卡那霉 素的雙抗平板上，于37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。挑選單克隆，酶切證明有插入；測 序結果表明了帶有啟動子和轉錄終止信號的氨芐抗性基因序列的插入方向。故得到 了具有氨芐抗性的質粒。此衍生質粒被命名為pEGFP-Nl-Ampicillin，并轉化大腸 桿菌E.coli DH5 a感受態(tài)細胞，用于基因的增殖和保藏。2、 衍生質粒pMD18-EGFP的構建。首先，利用PCR擴增出在EGFP基因5'端含 有 Stu I-Sal I 酶切位點的中間產(chǎn)物。5'弓|物 P3 為 AGGCCTGTCGACCGCCACCATG(下劃標記為引入的Stu I禾Q S al I酶切位點)； 3'引物P4為TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC。然后此中間產(chǎn)物被連接到pMD18-T vector(Takara公司產(chǎn)品)。此克隆命名為pMD18-EGFP,克隆示意過程見 圖2。3、 衍生質粒pMD18-EGFP-polyA的構建。利用PCR擴增出pEGFP-Nl (BD Biosciences Clontech公司產(chǎn)品)中從3424到3860間的一段序列(此序列為單純 皰疹病毒胸苷激酶的轉錄終止信號——HSV TK poly A)，使得該序列的兩邊分別含 有 Pst I 和 Hind III 酶切位點。所用 5' 引物 P5 : TTGCTGCAGGCGGGACTCTGGGGT(下劃標記為引入的Pst I酶切位點)；3，引 物P6: GCCAAGCTTAGGGCCTGCCGC (下劃線為引入的Hind III酶切位點； 虛線為模板序列中本身含有的Dra II酶切位點)。此PCR產(chǎn)物經(jīng)PstI和Hind III雙酶切后連接到上述衍生質粒pMD18-EGFP相應位點。由此生成的質粒命名為 pMD18-EGFP-polyA，克隆示意過程見圖3。4、 衍生質粒pEGFP/EGFP的構建。用Dra II (Eco0109 I)和Stu I雙酶切上 述衍生質粒pMD18-EGFP-polyA，回收其中被切出的大小為1， 188bp的片斷(此片斷 包含EGFP和HSV TK poly A的DNA序列)。將此片段亞克隆進上述已經(jīng)制備好的衍 生質粒pEGFP-Nl-Ampici 11 in相應位置處。由此衍生出的質粒被命名為pEGFP/EGFP， 克隆示意過程見圖4。5、 目的質粒pEGFP/DsRed的最終構建。用Nhe I和Not I切下質粒 pDsRed—Monomer—Nl上從多克隆位點至廿DsRed—Monomer基因(BD Biosciences Clontech公司產(chǎn)品)末尾處的一段775bp的片斷。將此片段亞克隆進上述已經(jīng)構建 好的衍生質粒pEGFP/EGFP的相應位點。由此得到所述的雙色熒光報告載體 pEGFP/DsRed，克隆示意過程見圖5。用此載體轉化大腸桿菌E. coli DH5 a感受態(tài) 細胞，用于其增殖和保藏。6、 基于目的質粒pEGFP/DsRed， 一種衍生質粒pEGFP/DsRed-HBx的克隆示意過 程見圖6。衍生質粒pEGFP/DsRed-HBx的制備方法如下a、 HBx基因片斷的PCR擴增制備含有HBx基因的質粒(來源見Wu KL, Zhang X, Zhang J, Yang Y, Mu YX, Liu M， U L， Li Y, Zhu Y， Wu 了 2005 Inhibition of Hepatitis B virus geneexpressionbysingleanddualsmallinterfering RNAtreatment. /Pes. 112:100-7.)為模板，利用PCR擴增出在HBx基因兩邊分別含有Not I禾B Xba I酶切位點的片斷，所用5'引物P7: ATAGCGGCCGCATGGCTGCTGCTAGGCTGTGCT (下劃線為引入的Not I酶切 位點)；3'引物P8: ATATCTAGAGGCAGAGGTGAAAAAG (下劃線為引入的 Xba I酶切位點)。b、 可被Xba I酶切的雙色熒光報告載體pEGFP/DsRed的獲得 因為本發(fā)明中的載體pEGFP/DsRed在大腸桿菌E.coli DH5 a內(nèi)增殖時所抽提出的pEGFP/DsRed質粒上的Xba I酶切位點被甲基化了 ，這樣使得pEGFP/DsRed不 可被Xba I消化。為了獲得可被Xba I消化的pEGFP/DsRed, pEGFP/DsRed質粒被 轉化到了 ER2925菌株中，然后從ER2925菌株中抽提出pEGFP/DsRed質粒，這樣 就避免了甲基化對Xba I酶切活性的影響。c、 pEGFP/DsRed-HBx克隆的獲得用Not I和Xba I分別雙酶切HBx基因的PCR產(chǎn)物和從ER2925菌株中抽提出 來的pEGFP/DsRed質粒，將HBx基因產(chǎn)物連接到pEGFP/DsRed的相應位置，轉化 ER2925菌株。測序結果證實了克隆的準確性。所得克隆就是pEGFP/DsRed-HBx。本發(fā)明提供了雙色熒光報告載體pEGFP/DsRed的全部DNA序列為SEQ ID NO: 1 所不的核苷酸序列。這些序列是基于亞克隆操作過程中和克隆載體的母本 pEGFP-Nl上的核苷酸序列沒有突變這一假設而提出的。本發(fā)明中的pEGFP/DsRed 只被我們部分測序，其中多克隆位點和DsRed-Monomer基因是亞克隆自 pDsRed-Monomer-Nl; P-內(nèi)酰胺酶(氨芐抗性基因)部分測序；綠色熒光蛋白基因 EGFP和單純皰疹病毒胸苷激酶的轉錄終止信號(HSVTKpolyA)完全測序。本發(fā)明提供了雙色熒光報告載體pEGFP/DsRed和pEGFP/DsRed-HBx的圖 譜，分別見圖5和圖6。 pEGFP/DsRed全長5686bp，具體位置信息描述如下 CMV立即早期啟動子(P v,e): 1—589 多克隆位點(MCS): 591-671 紅色熒光蛋白基因DsRed-MonomerKozak保守的翻譯起始位點672-682起始密碼子(ATG): 679-681;終止密碼子1354-1356 SV40早期mRNA聚腺苷酸化信號聚腺苷酸化信號1510-1515 & 1539-1544; niRNA3'末端1548 & 1560 0-內(nèi)酰胺酶基因(氨芐抗性基因)e-內(nèi)酰胺酶起始密碼子(ATG): 1755-1757;終止密碼子2615-2617e-內(nèi)酰胺酶啟動子1624-1754; -35區(qū):1685-1690; -10區(qū):1708-1713e-內(nèi)酰胺酶轉錄終止信號2618-2675e-內(nèi)酰胺酶轉錄本核糖體結合位點1743-1747 ，fl單鏈DNA origin: 2699-3154 .SV40早期啟動子(Psv他)3328-3596 SV40 Origin: 3495-3630 ，綠色熒光蛋白基因EGFPKozak保守的翻譯起始位點3638-3648 起始密碼子(ATG): 3645-3647;終止密碼子4362-4364 PCR擴增時發(fā)生了突變使得酪氨酸-183突變?yōu)樘於０?^+ A): 4191 單純皰疹病毒胸苷激酶的轉錄終止信號(HSV TK poly A) 聚腺苷酸化信號4612-4617 & 4625-4630 pUC質粒復制的origin: 4961-5604一種雙色熒光報告載體pEGFP/DsRed-HBx在高通量篩選且精確定量siRNA效率 中的應用。為了驗證pEGFP/DsRed-HBx表達的紅/綠熒光蛋白間的相關性，12個不 同濃度的pEGFP/DsRed-HBx分別同一個無關的siRNA (siNC，具體信息參見表1) 進行共轉染Linx細胞。轉染后48小時，用倒置熒光顯微鏡觀察(見圖10)。結果 表明在相同質量濃度下，本發(fā)明中的pEGFP/DsRed-HBx所表達出的紅色熒光信號和 綠色熒光信號，其強度大致相等(見圖10)。從圖10的試驗結果中我們可以觀察到， 在不同的pEGFP/DsRed-HBx的質量下，當綠色熒光增強時，此時對應質量下樣品的 紅色熒光也必定同時增強。例如當樣品的質量從100 ng上升到160 ng的時候，160ng 時的綠色熒光信號明顯強于100ng時的綠色熒光信號；于此同時160ng時的紅色熒 光信號也明顯強于100ng時的紅色熒光信號。而當所用pEGFP/DsRed-HBx的質量增 加而綠色熒光減弱時，對應樣品的紅色熒光也必定同時減弱。例如當樣品的質量從400 ng上升到500 ng的時候，500 ng時的綠色熒光信號明顯弱于400ng時的綠色 熒光信號；于此同時500 ng時的紅色熒光信號也明顯弱于400 ng時的紅色熒光信 號。在同一個樣品中，當綠光減弱時，紅光必定也減弱；反之依然。圖10結果可 以定性說明本發(fā)明中的pEGFP/DsRed-朋x載體所表達的紅/綠熒光蛋白間存在著一 種直線關系，這就為后面的用綠色信號作為內(nèi)參來精確定量紅色熒光信號的變化打 下了堅實的基礎。紅/綠熒光信號間的相關性用激發(fā)波長為488 nm的流式細胞術進行分析，分析 結果見圖11。從圖11 (A)上，可以看到?jīng)]有經(jīng)過轉染操作的細胞絕大部分都分布 在B3區(qū)，從圖11 (B)中，可以看出那些轉染了雙色熒光報告載體和4nM的siNC 的細胞有相當一部份分布在Bl， B3和B4區(qū)。我們知道，流式細胞儀給出的結果 中，分布在B1區(qū)的是那些只發(fā)紅光的細胞；分布在B2區(qū)的是那些既發(fā)紅光又發(fā)綠 光的細胞；分布在B4區(qū)的是那些只發(fā)綠光的細胞。同時每個區(qū)的細胞數(shù)目以及各 自區(qū)域內(nèi)細胞的平均綠色熒光強度數(shù)值(X-mean)和平均紅色熒光強度數(shù)值 (Y-mean )流式細胞儀都能測出，具體參數(shù)見圖11 (A)禾U (B)。因為流式細胞 儀的488 nm的激發(fā)波長更適用于EGFP被激發(fā)而不利于DsRed-Monomer的被激發(fā)， 所以在圖11 (B)的B4區(qū)中，被轉染的細胞僅僅檢測到中等表達水平的EGFP而檢 測不到紅色信號是可以理解的；但是，在Bl區(qū)中存在著表達相當水平的紅色信號 而沒有檢測到綠色信號則令人吃驚。此結果表明，位于圖11 (B)的B4區(qū)中的這 些細胞EGFP的表達被部分抑制了。因為沒有熒光信號的細胞以及那些僅僅只有紅 色熒光而沒有綠色熒光的細胞都被篩選出局，而那些能夠發(fā)出作為內(nèi)參的綠色熒光 的單體活細胞才被確定下來作為分析的對象以提高分析的精確性；所以Bl和B2區(qū)的細胞在隨后的定量分析中不予考慮。紅/綠熒光信號的相關性是基于各自對應的平均熒光強度(MFI)來計算的，其 數(shù)值分別對應于Y-mean和X-mean。而綠/紅熒光信號的MFI又經(jīng)由下面的兩個公式計 算得來MF1 (EGFP) = [X-mean(B2) X N(B2) + X-mean(B4) X N(B4)/ [N(B2) + N(B4)—方程(1)MF1 (DsRed-Monomer) = lY-mean(B2) X N(B2) + Y-mean(B4) X N(B4)/ [N(B2) + N(B4)I-—方程(2)基于上面的公式我們可以計算出不同質粒濃度的pEGFP/DsRed-HBx同4 nM的 siNC共轉染后各自對應的紅/綠平均熒光強度(MFI)，這樣依據(jù)不同濃度下的MFI， 我們可以用DsRed-Monomer的MFI對相應的EGFP的MFI來做圖。由此我們擬合出了 一條相關性非常好的直線。Y (平均紅色熒光強度)-0.519WX (平均綠色熒光強度) -19.31 ，請見圖11 (C)。此結果證明了雙色熒光報告載體中紅/綠熒光蛋白間的表 達確實存在著一種內(nèi)源性的直線關系。為了抑制乙肝病毒的表達，申請人向廣州市銳博生物科技有限公司訂購了10個 靶定HBx mRNA的siRNA和一個作為參照的無關siRNA (siNC)，并挑選出了其中5 個有效siRNA在單體活細胞水平來進行高通量和精確定量分析。具體信息如表l所示表l.本研究中耙定HBx的siRNA序列信息siRNA編號siRNA有義鏈序列5'—3'_si9 CCCGUCUGUGCCUUCUCAUdTdTsil2 GACCGUGUGCACUUCGCUUdTdTsil9-l GUGAACGCCCACCGAAUGUdTdTsi22 CGACCGACCUUGAGGCAUAdTdTsi2 5 GGGAGGAGAUUAGAUUAAAdTdTsiNC UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT為了方便高效地評估出這些siRNA的效率，基于流式細胞術我們提出了一種新 的評估方法。申請人選取5個siRNA (si9, sil2， sil9-l， si22,禾tlsi25)做濃度梯度實驗。 250 ng的pEGFP/DsRed-HBx分別同濃度遞減的siRNA禾口siNC (25 nM, 50 nM and 100 nM) —起共轉染Linx細胞(來源見Tong WP, Zhou Y, Wang X， Yang F, Wu KL, Wu J, Zhang Y 2008 An accurate quantitative method for screening effective siRNA probes targeting a Hepatitis B virus transcript in single living cells. Biochem Biophys Res Commim.367:866-73.)。細胞被吹撒上樣到流式細胞儀器中進行測量。這種基于單體 活細胞的siRNA的抑制作用通過如下的方程(3)來計算抑制百分率-(tMFI-MFI)DsRed/tMFIDsRed X 100%。 tMFI表示的是理論MFI?！匠?3)為了計算出DsRed-Monomer的理論MFI (tMFI )， 一條對應的校準曲線根據(jù) pEGFP/DsRed-HBx和不同濃度的siNC共轉染時的結果通過方程(l)和方程(2)依據(jù) 上面所述的方法被擬合出來(見圖13)。在共轉染了報告質粒和有活性作用的siRNA 的細胞中，基于方程1我們可以計算出細胞中表達的EGFP的MFI，另一方面在此校 準曲線上與EGFP的MFI相對應處就有一個紅色熒光蛋白的MFI，我們把此從校準曲 線上推導出來的理論上的紅色熒光蛋白的MFI定義為tMFI。 tMFI表示的是當RNAi 沒有發(fā)生時細胞中紅色熒光蛋白的MFI。當RNAi發(fā)生后，利用方程(2)可以計算 出此時觀測到的紅色熒光蛋白的MFI 。那么siRNA的抑制效率就可以用 DsRed-Monomer的tMFI和MFI間的差值推導出來，也就是方程(3)所表示的意義。 基于此種定量方法，我們一次性地計算出了此5種siRNA分別在25 nM、 50 nM 和100 nM這三個不同的濃度下的抑制效率，快速高效地得到了15個樣品的抑制結 果，見表2。表2.不同濃度下siRNA抑制效果表\ siRNA濃度 \(nM) siRNA名稱 \1005025si983%83%84%sil286%88%88%sil9-l80%82%82%si2281%81%81%si2581%82%從表2中，可以看Hti所有挑選出來的siRNA在三種不同濃度下都取得了80X以上的抑制效率，而且每個siRNA的抑制效率在三種不同濃度時都幾乎相同。這表明5 個siRNA在25nM的時候全都達到了飽和抑制。在25 nM、 50 nM和lOO nM這三個不 同的濃度下，很有意思的是，每個siRNA都產(chǎn)生出了高度一致的抑制效率sil2的抑 制效率在86-88%之間；si9在83-84。/。之間；si22都是81^; sil9-l和si25都在80-82。/。之間。具體siRNA的抑制效率請見圖13。抑制效率高度一致性表明本發(fā)明的方法是 極其可靠的。綜上所述本發(fā)明中的雙色熒光報告載體pEGFP/DsRed和pEGFP/DsRed-HBx的主要優(yōu)點特征總結如下1、 具有pUC質粒的復制子，是松弛型質粒。依據(jù)常規(guī)培養(yǎng)大腸桿菌和抽提質 粒的方法，4 ml大腸桿菌DH5a可以抽提出4. 4到8. 6微克的質粒量(見圖7)， 因此本發(fā)明中的pEGFP/DsRed和pEGFP/DsRed-HBx兩種質粒經(jīng)過常規(guī)的抽提方法可 以很方便地得到微克級的量以滿足常規(guī)生物試驗的需要。2、 pEGFP/DsRed轉染24小時后在熒光顯微鏡下可同時觀察到兩種熒光蛋白各a清晰明亮的熒光信號，表明載體上的紅/綠熒光蛋白基因可同時被正常有效地表達(見圖8)。3、 分別在轉染pEGFP/DsRed-朋x后24小時、48小時、72小時用熒光顯微鏡 觀察，可同時觀察到兩種熒光蛋白各自清晰明亮的熒光信號，并且對應熒光信號隨 著時間的推移有越來越強的趨勢，表明載體在一定時間范圍內(nèi)能穩(wěn)定地表達出紅/ 綠熒光蛋白(見圖9)。4、 熒光蛋白EGFP和DsRed-Monomer適合在流式細胞細胞儀平臺上進行雙標檢 測(0rengo JP， Bund腿n D， Cooper TA. 2006 A bichromatic fluorescent reporter for cell-based screens of alternative splicing. 7Vuc_/eic /Jcicfe /tes. 34:el48. )。 EGFP和DsRed-Monomer在被488nm的激光激發(fā)時，會產(chǎn)生各自的 發(fā)射波譜。檢測時我們選擇了 PMT2 (FL1)通道和PMT4 (FL3)通道分別來收集波 長范圍為[515nm， 535nm]的綠色熒光信號和波長范圍為[610, 630]的紅色熒光信號。 因此將熒光間的干擾降低到了最低限度，這為精確定量提供了物質基礎。5、 在EGFP基因的兩端分別存在一個Sal I位點(見圖譜5和6),用Sal I單 酶切就可以將EGFP基因切下來，這為以后載體的升級改進提供了很好的條件。6、 耙標基因可以融合在DsRed-Monomer的終止密碼子之后，因此耙標基因就 成為了 DsRed-Monomer的3' UTR而不被翻譯出來(見圖譜6)。這樣就可以僅僅表 達出完整的紅色熒光蛋白而避免了紅色熒光蛋白遭融合后的影響。這為精確定量系 統(tǒng)的穩(wěn)定性提供了保證。7、載體表達出的紅/綠熒光蛋白各自所發(fā)出的熒光強度間存在著相關性，利用 定量熒光流式細胞術，可以繪制出相關性很好的校準曲線(見圖11和13)。這為精 確定量提供了方法上的支持。綜上所述，本發(fā)明中所述的定量分析siRNA效率的方法與現(xiàn)有技術相比具有以 下優(yōu)點-1、 僅只需要對雙色熒光報告質粒和siRNA進行共轉染即可；2、 整個操作過程中，細胞在活體的狀態(tài)下被分析，不需要打破細胞更不需要 從細胞中抽提出蛋白和RNA;3、 沒有熒光信號的細胞以及那些僅僅只有紅色熒光而沒有綠色熒光的細胞都 被篩選出局，而那些能夠發(fā)出作為內(nèi)參的綠色熒光的單體活細胞才被確定下來作為 分析的對象以提高分析的精確性；4、 在不同批次的實驗甚至在同一批次所用不同濃度的siRNA實驗中，我們都 用無關的負對照siRNA作為參照計算出了雙色熒光報告載體中紅綠熒光蛋白之間的 校準曲線以此來提高我們定量的精確性；5、 目的細胞群中的每一個細胞的紅/綠熒光強度都被利用來計算各個siRNA抑 制耙標的效率，因此基于校準曲線的定量結果具有高度的可信性和可重復性(見圖 13)。


本發(fā)明的上述和其他目的，特點和優(yōu)勢可顯而易見地從下面對本發(fā)明優(yōu) 選實施例的詳細描述和附圖示出的內(nèi)容得到，不同視圖中相同的參考符號代 表相同的部分。附圖并不一定是按比例示出，其重點在于說明本發(fā)明的實施 和效果。圖1為衍生質粒pEGFP-N卜Ampicillin的構建示意圖；圖2為衍生質粒pMD18-EGFP的構建示意圖；圖3為衍生質粒pMD18-EGFP-polyA的構建示意圖；圖4為衍生質粒pEGFP/EGFP的構建示意圖；圖5為雙色熒光報告載體pEGFP/DsRed的構建及其圖譜示意圖；圖6為雙色熒光報告載體pEGFP/DsRed-HBx的構建及其圖譜示意圖；圖7為依據(jù)常規(guī)的抽提超純質粒的方法，所得的超純雙色熒光報告載體 pEGFP/DsRed和pEGFP/DsRed-HBx對其定量的電泳圖片。最左邊的條帶為 maker: lkb plus;泳道1為本發(fā)明中的超純質粒pEGFP/DsRed.;泳道2為 本發(fā)明中的超純質粒pEGFP/DsRed-HB;依據(jù)常規(guī)的定量算法對其進行定量， 定量結果證明用4ml DH5a可以抽提出8. 6微克本發(fā)明中的雙色熒光報告載 體pEGFP/DsRed和4. 4微克本發(fā)明中的雙色熒光報告載體pEGFP/DsRed-HBx;圖8為Hela細胞被轉染了 250ng本發(fā)明中的pEGFP/DsRed, 24小時之后在 熒光顯微鏡下觀察到的結果示意圖。EGFP表示用藍光激發(fā)在熒光顯微鏡下觀察到 的綠色熒光信號，DsRed-Monomer表示在EGFP信號觀察完之后在同一個視野下用 綠光激發(fā)后所觀察到的紅色熒光信號。結果顯示本發(fā)明中的pEGFP/DsRed能夠同時 檢測到綠色熒光信號和紅色熒光信號，表明本發(fā)明中的pEGFP/DsRed載體能夠在 真核細胞中同時順利表達出綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白；圖9為Linx細胞被轉染了 250 ng本發(fā)明中的雙色熒光報告載體 pEGFP/DsRed-HBx之后，在轉染24小時，48小時，72小時在熒光顯微鏡下觀察到 的結果示意圖。EGFP和DsRed-Monomer表示在24小時、48小時、72小時等時間 段時分別檢測到的綠色熒光和紅色熒光信號。從圖上我們可以觀察到，本發(fā)明中的 雙色熒光報告載體pEGFP/DsRed-HBx能在真核細胞中順利表達出綠色熒光蛋白和 紅色熒光蛋白。而且隨著時間的推移，熒光信號有增強的趨勢，此結果表明本發(fā)明 中的pEGFP/DsRed-HBx載體有很好的穩(wěn)定性，適合于長時間的熒光信號檢測；圖10為用不同質量本發(fā)明中的pEGFP/DsRed-HBx載體和4 nM siNC (無 關siRNA)共轉染Linx細胞，48小時之后在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光信號和 紅色熒光信號的結果。具體轉染所用質粒的質量如圖所示為100 ng、 120 ng、 140 ng、 160 ng、 180 ng、 200 ng、 220 ng、 250 ng、 300 ng、 350 ng、 400 ng、 500 ng。在同一個樣品中，當綠光減弱時，紅光必定也減弱；反之依然。圖10結果可以定性說明本發(fā)明中的pEGFP/DsRed-HBx載體所表達的紅/綠熒光蛋白間存在著一種直線關 系，這就為后面的用綠色信號作為內(nèi)參來精確定量紅色熒光信號的變化打下了堅實 的基礎。圖11為圖IO中用不同質量(分別為100 ng、 120 ng、 140 ng、 160 ng、 180 ng、 200 ng、 220 ng、 250 ng、 300 ng、 350 ng、 400 ng、 500 ng )的pEGFP/DsRed-HBx 和4 nM siNC (無關siRNA)共轉染Linx細胞在熒光顯微鏡下觀察之后，全部 樣品都用流式細胞儀檢測完畢后所給出的部分流式分析結果。流式結果中的Y軸(PMT4 Log)表征的是DsRed-Monomer的紅色熒光強度；X軸(PMT2 Log)表征的 是EGFP的綠色熒光強度。圖11 (A)為未進行轉染操作的細胞作為流式分析的空白 對照所顯示的結果?？瞻讟悠返牧魇浇Y果表明在未轉染本發(fā)明的細胞中既沒有紅色 信號也沒有綠色信號。圖11 (B)為用100 ng pEGFP/DsRed-HBx同4 nM siNC 共轉染后用流式細胞儀檢測到的結果。圖ll (B)的上部分顯示的是流式細胞儀基 于所分析細胞的熒光信號特征，將細胞分成了 4個區(qū)域，分別為Bl、 B2、 B3、 B4 區(qū)。當轉染了本發(fā)明中的pEGFP/DsRed-HBx之后，那些檢測到熒光信號的細胞大 部分位于B2區(qū)，另有一小部分位于Bl和B4區(qū)。流式細胞儀同時將不同區(qū)域內(nèi)的 細胞參數(shù)都在圖B的下部分分別顯示出來。例如位于該區(qū)中細胞的數(shù)目(N咖ber)、 區(qū)內(nèi)每個細胞的平均綠色熒光強度(Xie肌)、區(qū)內(nèi)每個細胞的平均紅色熒光強度(Yiean)等等。圖11 (C)為基于流式細胞儀分析的數(shù)據(jù)，依據(jù)方程(1)(2)計算 出每個質量下樣品各自的平均紅/綠熒光強度，由此決定橙色點的坐標，橙色點的 坐標表示細胞在轉染siNC后細胞表達熒光的情況。每個橙色點所用的載體質量都 在對應點下進行了標明。然后用平均紅色熒光強度對平均綠色熒光強度進行作圖， 用軟件R package (http:〃www. r-project, org)于是模擬出了一條如圖11 (C)所 /下的直線。直線的方程及其相關特性在圖C的左上角標出。圖12為熒光顯微鏡下觀察到的在100 nM， 50 nM和25 nM不同濃度的siRNA 的抑制效果圖。將250 ng本發(fā)明中的pEGFP/DsRed-HBx同挑選出的有效的5個 siRNA (si9, sil2, sil9-l， si22，和si25)分別在不同的濃度下(100 nM， 50 nM 和25 nM)共轉染Linx細胞系。同時將siNC也在逐漸降低濃度(100 nM， 50 nM 和25 nM)下與250 ng本發(fā)明中的pEGFP/DsRed-HBx共轉染Linx細胞系并在每 個濃度下都做了 IO個樣品以繪制出校準曲線。EGFP表示熒光顯微鏡下所檢測到的 綠色熒光蛋白所發(fā)出的信號，DsRed-Monomer表示熒光顯微鏡下檢測到的紅色熒光 蛋白所發(fā)出的信號。從轉染SiNC的試驗結果可以發(fā)現(xiàn)，在100nM， 50nM和25nM濃度下，同一個siNC自身所發(fā)出的紅/綠熒光信號強度都彼此相當；但是當轉染進 了 5個有效的siRNA (si9， sil2, sil9-1， si22，和si25)之后，與同濃度下的 siNC的轉染結果對比我們可以發(fā)現(xiàn)，綠色熒光信號沒有什么變化，但是紅色熒光信 號卻大大地降低了。表明挑選出的有功能的siRNA很有效地抑制了 DsRed-Monomer 的表達。圖13為基于不同濃度下的校準曲線所計算出的不同濃度下siRNA的抑制效果 圖。當用實驗證實了本發(fā)明所表達的紅(綠)熒光蛋白的平均熒光強度間的確存在 著直線關系之后，我們就開始運用本發(fā)明進行高通量篩選有效siRNA。將圖12中的 試驗樣品在熒光顯微鏡下觀察之后，隨即將其上樣到流式細胞儀中進行定量分析。 所用本發(fā)明中的pEGFP/DsRed-HBx載體都為250ng， siNC的濃度和有效siRNA 的濃度都分別為100 nM， 50 nM， 25 nM。不同濃度下的效果圖分別對應于 圖13 (A)， (B)， (C)。橙色點的坐標表示細胞在轉染siNC后細胞表達熒光的情 況，不同siNC濃度下，橙色點的坐標數(shù)值計算以及校準曲線的確立都同圖11， 校準曲線的特征都在其左上角標出。綠色點的坐標表示細胞在轉染有效siRNA后細 胞表達熒光的情況，綠色點的坐標數(shù)值的確定也是依據(jù)方程(l) (2)計算出每個有效 siRNA樣品各自的平均紅/綠熒光強度來決定的。siRNA抑制效率依據(jù)方程(3)計 算得出。si9的抑制效率計算如下例如在圖13 (A)中，當轉染了 100 nM的si9 之后，利用方程(1)(2)可以確定其綠色點的坐標，因為與此同時轉染了 100 riM的 siNC的樣品可以確定橙色點的坐標及在此濃度下的校準曲線，那么當si9的平均綠 色熒光被測出來之后，就可以在校準曲線上找到對應此點時的理論平均紅色熒光強 度(tMFI)，水平直線指向的就是tMFI。最后依據(jù)方程(3)方便地算出si9在100 nM下可以達到83%的抑制效果，基于此可以輕易算出其他濃度下si9的抑制效果。 100 nM, 50 nM， 25 nM下對應的具體抑制結果分別在圖13 (A)， (B)， (C)的 右邊被標記出來。對圖13 (A)， (B)， (C)結果分析對比，我們發(fā)現(xiàn)在不同 濃度下，每個siRNA自身的抑制效率都極其一致，表明本發(fā)明在25 nM的時候這5 個siRNA都達到了飽和抑制。此結果也證明了基于本發(fā)明的定量流式細胞術具有高 度的可重復性和可信賴性。
具體實施方式
實施例1 PCR擴增帶有啟動子和轉錄終止信號的氨芐抗性基因序列 擴增引物合成引物根據(jù)氨芐抗性基因的ORF及載體設計，用primer premier 5. O軟件(加拿大的Premi er公司產(chǎn)品)檢測。所用5'引物P1為 CCTAGATCTTAAGAAATTAAAAATGAAGTTT (下劃線為引入的Bgl II酶切 位點)；3'引物P2為TAATAATGGTTTCACGTAGTGCAGGTGGC (下劃線 為引入的DraIII酶切位點)。本發(fā)明中所用引物均由武漢賽百盛公司合成。 以pUC18 (Takara公司產(chǎn)品)為模板，用上游引物和下游引物，利用PCR儀 擴增出pUC18中從1566至U 2617的一段DNA序列。 PCR體系組分:5 (il 10xl#buffer, 5 pl dNTP (2 mM)， 1 pl引物Pl (10 pM), 1… 引物P2(10(iM)， 0.1 pl模板pUC18， 2plMgcl2 (25mM)， 0.3 (xl TOYOBO KOD 酶(2.5U/pl)，補無菌ddH20至50n 1。用移液槍抽吸混勻，向無菌PCR管中加 上述組分的操作在冰上進行。1000rpra離心10sec后，將PCR管置于PCR儀 上。PCR反應條件94°C， 3min; 94°C ， 30 s; 40°C， 30 s; 74°C， 30s， 5 次；94°C， 30 s ; 55°C， 30 s ; 74°C， 30s ， 25次；74°C， 5min。 取5uL PCR產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色后紫外燈下觀察 擴增結果。PCR擴增帶有啟動子和轉錄終止信號的氨芐抗性基因，PCR產(chǎn)物在1.0% 的瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色后紫外燈下觀察，有與目的基因大小相符的 目的條帶，大小為1086bp左右。此步得到了帶有啟動子和轉錄終止信號的氨芐 抗性基因序列。實施例2帶有啟動子和轉錄終止信號的氨芐抗性基因PCR產(chǎn)物的回收與純化(1)將實施例1中的PCR產(chǎn)物用1.0。/。瓊脂糖凝膠進行電泳(1XTAE)， 用紫外燈觀察電泳情況，當要回收的DNA帶與其他帶完全分離時，停止電泳， 在紫外燈下用刀片切下欲回收帶，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化。(2)在 Eppendorf管中將膠搗碎，加入等體積的溶膠液Binding Buffer, 65'C水浴 7min，其間每2min輕搖Eppendorf管一次直至膠完全融解。(3)將融解的23樣品加入層析柱中，12000rpm離心lmin，棄去液體。(4)加300nl Binding Buffer,離心棄去液體。(5)加750 u 1 Washing Buffer,離心棄去液體。(6)重復步驟(5) —次。(7)空柱子12000rpra離心lmin以甩干液體。(8) 將柱子放于1. 5ml Eppendorf管，加入30 y 1 EIution buffer, 37。C保溫 2min， 12000rpm離心lmin，將得到的PCR產(chǎn)物取2 y 1電泳檢測定量，其余 的貯于-2CTC備用。此步得到了純化過的帶有啟動子和轉錄終止信號的氨芐抗性 基因序列。實施例3質粒pEGFP-Nl被Afl II單酶切反應體系5 ii 1 10X0 buffer; pEGFP-Nl plasmid 15 u 1; 5" 1 Afl II 酶；補無菌水ddH20至50 u 1。反應過程將反應體系組分在冰上混合并混勻，5000rpm瞬時離心10s， 置于37'C水浴鍋中保溫反應2-4h,用1%的瓊脂糖凝膠電泳紫外燈下切下目 的條帶，用膠回收試劑盒進行回收純化。最后用30u 1無菌水洗脫。取2ul 樣品1%瓊脂糖電泳檢測，其余貯于-2(TC備用。此步得到了被被AflII單酶 切過的pEGFP-Nl。實施例4質粒pEGFP-Nl被Af 1 II單酶切后通過K0D DNA聚合酶補成平末端 反應體系5^1被Afl II單酶切的pEGFP-Nl; 1 plMgCl2(25mM); 2 |il dNTP(2.5 mM); 1 pi 10x 1# buffer; 1 pl T0Y0B0 KOD酶(2.5 U4d)。反應過程將反應體系組分在冰上混合并混勻，5000rpm瞬時離心10s，放入PCR儀中于7(TC反應30分鐘。此步得到了通過KOD DNA聚合酶被補成平末端的pEGFP-Nl。實施例5用Cycle-Pure Kit (E.Z.N.A公司產(chǎn)品)純化被補平的質粒pEGFP-Nl 具體過程如下(1)將實施例4中被Afl II單酶切的質粒pEGFP-Nl酶切體系轉移到一個 千凈的1. 5nd的離心管中，加入4一5倍體積的Buffer CP。 (2)完全振蕩混和， 對離心管進行簡短離心，將溶液集中于管底。(3)將HiBind DNA柱子置入 一個試劑盒中提供的2ml的收集管中。(4)將步驟(2)中的樣品加入到HiBind DNA柱子中，在室溫(20-25°C) 10， OOOXg離心l分鐘。(5)倒掉管底離心下來的液體，將HiBindDNA柱子放回上述的收集管中。(6)用700 u 1被 無水乙醇稀釋過的DNA wash溶液沖洗HiBind DNA柱子。在室溫10， 000 Xg離心l分鐘。(7)倒掉管底離心下來的液體，重復步驟(6) —次。(8) 倒掉管底離心下來的液體，以最大轉速空轉HiBind DNA柱子2分鐘以甩干 柱子中的基質。(9)將HiBind DNA柱子放入到一干凈的1.5ml離心管中， 直接滴加15-30y 1無菌水到柱子的基質上，在室溫靜置1一2分鐘。以最大 轉速離心1分鐘將DNA洗脫下來。此步得到了被純化過的補平的質粒 pEGFP-Nl。實施例6對被補平的pEGFP-Nl質粒進行去磷酸化操作，以及對擴增出的氨 芐抗性基因進行磷酸化操作去磷酸化反應體系1 20 pmol被補成平末端的pEGFP-Nl質粒；5 pl IOX堿 性磷酸酶buffer; 2plTaKaRa堿性磷酸酶(10U/pl);補無菌水ddH20至50 y1。磷酸化擴增出的氨芐抗性基因反應體系l 50pmol利用KOD擴增出的氨芐抗 性基因；5 |_U 10XT4多核苷酸激酶buffer; 2. 5 ^ ATP (10 mM); 2. 5 ^ T4多核 苷酸激酶；補無菌水ddH20至50 "1。反應過程分別將去磷酸化和磷酸化體系組分在冰上混合并混勻，5000rpm 瞬時離心10s，隨后于37'C反應30分鐘，在7(TC變性15分鐘失活蛋白，最后 分別用Cycle-Pure Kit (E.Z.N.A公司產(chǎn)品)進行純化。此步分別得到了被去磷酸化和 被補平的pEGFP-Nl質粒和被磷酸化的氨芐抗性基因。實施例7將被去磷酸化的pEGFP-Nl質粒和被磷酸化的氨芐抗性基因進行連 接反應將以上被去磷酸化的pEGFP-Nl質粒和被磷酸化的氨芐抗性基因進行連接反 應，其連接體系為3^1 (lOng/pl )被去磷酸化的pEGFP-Nl質粒；3^1 (28 ng/pl )被磷酸化的氨芐抗性基因；6pl Solution I (Takara)。在冰上混合上述液 體，將12^1混合液放在250pl的無菌離心管中，用移液槍輕輕抽吸幾下混 勻，5000rpm瞬時離心，將混合液集中在管底，然后4"C連接過夜。實施例8大腸桿菌的轉化和帶有氨節(jié)霉素和卡那霉素抗性質粒pEGFP-N卜Ampicillin的篩選(1) 采用冷氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞(a)以無菌牙簽挑取 平板上的大腸桿菌DH5a單菌落，接種到5mL LB培養(yǎng)基中，37°C， 220rpm 活化過夜。(b)取10 20^上述活化大腸桿菌，接種到5mL新鮮的LB培養(yǎng) 基中，37°C, 220rpm培養(yǎng)2 3h,至0D600值為0. 4 0. 6。 (c)取1. 5mL 步驟(b)中的菌液加入無菌的Eppendorf離心管中，4， OOOrpm離心10min， 抽干上清。(d)加入800pl冰預冷的0. 1M氯化鈣，輕輕振蕩重懸菌體沉淀， 冰浴30min。 4， OOOrpm離心10rain,抽干上清。(e)加入100pl冰預冷的 0. 1M氯化鈣重懸沉淀，得到制備好的感受態(tài)細胞。4。C保存，7 10天內(nèi)使 用。(2) 質粒轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞(a)取12^U連接反應液， 加入到100pl上述制備的感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30min。 (b) 42 °C 水浴中熱激90s，迅速移至冰中冰浴2-3min。 (c)加入390^1新鮮LB液體 培養(yǎng)基，37°C， 150rpm輕搖，50rain。 (d) 4， 000rpra離心5min，吸棄400W 上清，將剩余的菌液用移液槍輕輕混勻。(e)將剩余的菌液接種到5mL含 有60叱/ml氨芐青霉素和50 (ig/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C搖床中 220rpm過夜培養(yǎng)。(f) 24小時后，觀察結果。(3) 質粒pEGFP-N1-A卿icillin的篩選24小時后收集生長起來的細菌，用 堿法抽提出質粒，將所得質粒再次轉化DH5a感受態(tài)細胞，將被轉化細胞鋪板于含 60嗎/ml氨芐青霉素和50 pg/ml卡那霉素的雙抗平板上，于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過 夜。挑選單克隆，酶切證明有插入。同時將重組質粒pEGFP-N1-A即icilliri送往 上海聯(lián)合基因研究院測序。所能測出的部分證明氨芐抗性基因以順時針方向 插入。最終得到了有氨芐抗性的載體pEGFP-N1-Ampicillin。具體克隆過程及圖 譜見圖1。實施例9衍生質粒pMD18-EGFP的構建(具體圖譜見圖2) (l)擴增引物合成設計和合成方法以及操作過程同實施例1。所用5'引 物P3為AGGCCTGTCGACCGCCACCATG (下劃標記為引入的Stu I和Sal I酶切位點)；3'引物P4為TTACTTGTAC AGCTCGTCCATGCC 。以pEGFP-N 1(BD Biosciences Clontech公司產(chǎn)品)為模板，用上游引物和下游引物，利 用PCR儀擴增出綠色熒光蛋白基因EGFP。 PCR體系組分25 ^2xGCbufferl， 5^1 dNTP(2mM)，1 pl引物P3 (10 ^M)， 1 pl引物P4 (10 ^M)， 1 pl模板pEGFP-Nl， 0.4 pi Takara LA Taq酶(5 U/(xl)，補無菌ddH20至50 u 1 。PCR反應條件94°C， 3min; 94°C ， 30 s; 50°C ， 60 s; 72°C， 90s, 30次；74°C , 5min。(2) PCR產(chǎn)物的回收與純化過程同實施例2。將回收和純化過的EGFP 基因PCR產(chǎn)物與pMD18-T vector(Takara公司產(chǎn)品)迸行連接反應。其連接體系為EGFP PCR產(chǎn)物；0. 5|il pMD18-T vector; 5jJ Solution I; 0. 5fxl T4 DNA連接 酶。具體連接操作過程同實施例7。(3) 大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞的制備同實施例8，質粒轉化大腸桿菌 DH5a感受態(tài)細胞過程如下(a)取lOuL連接反應液，加入到lOOuL上述制 備的感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30min。 (b) 42'C水浴中熱激90秒， 迅速移至冰中冰浴2-3min 。 ( c)加入390uL新鮮LB液體培養(yǎng)基，37 °C ， 150rpm 輕搖，50min。 (d) 4, 000rpm離心5min，吸棄400uL上清，將剩余的菌液用 移液槍輕輕混勻。(e)取100uL細菌懸液，用無菌三角玻璃涂棒涂布于含氨 芐青霉素的LB平板上，正向放置1-2小時，直至液體被充分吸收，倒置平 板，于37'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。(f) 12-16小時后，觀察結果。(4) 陽性重組子p腦18-EGFP的鑒定。(a)雙酶切鑒定，反應體系lpl 10XK buffer; 7pl plasmid; 1^1 Hind III酶；lpl BamH I酶；補無菌水 ddH20至lOpl。反應過程將反應體系組分在冰上混合并混勻，5000rpm瞬 時離心10s，置于水浴鍋中37'C保溫反應2-4h,加反應量0. 1倍體積的10 X loading Buffer終止反應，取8|^1酶切產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測 酶切結果。根據(jù)雙酶切后是否有大小正確的帶來判斷該質粒是否為陽性重組 子pMD18-EGFP。 (b) EGFP序列測定將經(jīng)過雙酶切鑒定的p腦18-EGFP重 組質粒送往上海聯(lián)合基因研究院測序。序列測定結果表明EGFP在PCR擴增 時發(fā)生了一個堿基的突變使得酪氨酸-183突變?yōu)樘於０?，即從起始?碼子開始的第547位的T突變?yōu)锳。實施例10衍生質粒pMD18-EGFP-polyA的構建(具體圖譜見圖3)(1) 以pEGFP-Nl (BD Biosciences Clontech公司產(chǎn)品)為模板，擴增出 pEGFP-Nl (BD Biosciences Clontech公司產(chǎn)品)中從3424到3860間的一段序 列(此序列為單純皰疹病毒胸苷激酶的轉錄終止信號——HSV TK poly A),使得 該序列的兩邊分別含有Pst I和Hirul III酶切位點。擴增引物合成設和合 成方法以及操作過程同實施例1 。所用5'引物P5 : TTGCTGCAGGCGGGACTCTGGGGT (下劃標記為引入的Pst I酶切位點)；3' 引物P6: GCCAAGCTTAGGGCCTGCCGC (下劃線為引入的Hind III酶切位 點；虛線為模板序列中本身含有的Dra II酶切位點)。PCR體系組分5 pi 10xbufferl， 5 ^ dNTP(2mM)， 1^1引物P5 (lOpM)， 1 ^引物P6 (lOpM)， 1^1模 板pEGFP-Nl ， 2 |id Mgcl2 (25mM)， 1 ^ TOYOBO KOD酶(2.5 U/jlU)，補無菌 ddH20至50y 1。PCR反應條件94。C， 30 s; 58°C， 30 s; 74°C ，60s,30次；74。C ， 5m i n 。(2) PCR產(chǎn)物的回收與純化過程同實施例2。將回收和純化過的PCR產(chǎn) 物與pMD18-EGFP (衍生質粒)進行雙酶切后連接反應。其雙酶切體系為11.5^1 pMD18-EGFP或者PCR產(chǎn)物；1. 5^1 10 X M buffer; l^il Hind III酶；l|til Pst I酶；補無菌水dd&O至15^1。酶切后純化回收，具體操作同實施例2。隨 后進行連接反應，其連接體系為2plpMD18-EGFP質粒；6|id PCR回收產(chǎn)物； l^il 10Xbuffer; lplT4DNA連接酶。具體連接操作過程同實施例7 。(3) 大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞的制備和轉化同實施例8。(4) 陽性重組子pMD18-EGFP-polyA的鑒定。(a)雙酶切鑒定大體上同 實施例9中的(4a)，所用限制性內(nèi)切酶為Pst I和Hind III。 (b) polyA 信號的序列測定，同實施例9中的(4b),測序結果正確。實施例11衍生質粒pEGFP/EGFP的構建(具體圖譜見圖4) (1)用Fermentas公司生產(chǎn)的Dra II (Eco0109 I)和Stu I雙酶切上述衍生 質粒pMD18-EGFP-polyA，回收其中被切出的大小為1， 188bp的片斷(此片斷包含EGFP 和HSV TK poly A的DNA序列)，同時也用Dra II (Eco0109 I)和Stu I雙酶切pEGFP-Nl-Ampici]in。具體雙酶切實施過程如下(a)首先Stu I單酶切 pMD18-EGFP-polyA禾口 pEGFP-N卜Ampicillin,體系如下2^1 10XB buffer; 16. 5pl plasmid; 1. 5pl Stu I酶；補無菌水ddH20至20^1。 (b)分別回收純 化被StuI切動的質粒，具體操作過程同實施例2。 (c)然后用DraII單酶 切被純化回收的質粒，體系如下2j_il lOXTango buffer; 16.5^1 plasraid; 1.5^U Dra II酶；補無菌水ddH20至20W。 (d)分別回收純化被切出的大小 約1. 2Kb的和4. 5Kb的條帶，具體操作過程同實施例2。(2 )將此1, 188bp的片斷亞克隆進上述已經(jīng)制備好的衍生質粒 pEGFP-Nl-Arapicillin相應位置處。具體連接體系如下4pl 1, 188bp的EGFP-polyA 片斷；l)nlpEGFP-Nl-Ampici 11 in vector; 5pl Solution I; 0. 5^1 T4 DNA連接酶。具 體連接操作過程同實施例7。(3) 大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞的制備和連接產(chǎn)物的轉化同實施例8。(4) 陽性重組子pEGFP/EGFP的鑒定。因為在載體的設計中，申請人在 EGFP基因的兩端都帶上了 Sal I酶切位點，當用Sal I單酶切時如果能切 出大約為750bp的條帶，則說明構建的質粒成功。具體Sal I (Takara公司 產(chǎn)品)單酶切體系如下lpl 10XH buffer; 4^1 plasmid; 0.5nlSalI酶； 0. 5plRnaseA (降解質粒中的RNA);補無菌水ddH20至10M1。最后有目的條帶 被切出，證明亞克隆構建成功。實施例12目的質粒pEGFP/DsRed的最終構建(具體圖譜見圖5)(1) 用NheI和Not I切下質粒pDsRed-Monomer-Nl (BD Biosciences Clontech 公司產(chǎn)品)從多克隆位點到DsRed-Monomer基因(BD Biosciences Clontech公司產(chǎn) 品)末尾處的一段775bp的片斷。將此片段亞克隆進上述已經(jīng)構建好的衍生質粒 pEGFP/EGFP的相應位點。具體雙酶切方法和克隆過程同實施例11，只是過程中 使用的限制性內(nèi)切酶分別為Nhe I和Not I，并且從pDsRed-Monomer-Nl上回 收的插入片斷大小為768bp，從pEGFP/EGFP上回收的載體片斷大小為5000bp。(2) 陽性重組子pEGFP/DsRed的鑒定。對DsRed-Monoraer基因序列的測 序，具體實施方式
同實施例9中的(4b)，測序結果正確。實施例13目的質粒pEGFP/DsRed-HBx的最終構建(具體圖譜見圖6)(1) 以含有HBx基因的質粒為模板，利用PCR擴增出在HBx基因兩邊分 別含有Not I和Xba I酶切位點的片斷，所用5'引物P7 : ATAGCGGCCGCATGGCTGCTGCTAGGCTGTGCT (下劃線為引入的Not I酶切 位點)；3'引物P8: ATATCTAGAGGCAGAGGTGAAAAAG (下劃線為引入的 Xbal酶切位點)。擴增引物合成設計和合成方法以及操作過程同實施例1。PCR體系組分5 pi 10x buffer ， 5 ^ dNTP (2 mM)， 1 pi引物P7 (10闊，1 |il 引物P8 (10 nM)， 1 Hl模板pCMV-flag2a-HBx, 0.4 pi Pfu酶(2.5 ,)，補無菌 ddH20至50y 1。PCR反應條件94°C, 3min; 94°C ， 30 s; 58°C， 60 s; 72°C ， 卯s， 30次；74°C， 5min。(2) 可被Xba I酶切的雙色熒光報告載體pEGFP/DsRed的獲得 因為本發(fā)明中的載體pEGFP/DsRed在大腸桿菌E.coli DH5 a內(nèi)增殖時所抽提出的pEGFP/DsRed質粒上的Xba I酶切位點被甲基化了 ，這樣使得pEGFP/DsRed不 可被Xba I消化。為了獲得可被Xba I消化的pEGFP/DsRed, pEGFP/DsRed質粒被 轉化到了 ER2925菌株(New England Biolabs公司產(chǎn)品)中，然后從ER2925菌株 (New England Biolabs公司產(chǎn)品)中抽提出pEGFP/DsRed質粒，這樣就避免了甲基化 對Xba I酶切活性的影響。大腸桿菌ER2925感受態(tài)細胞的制備和載體 pEGFP/DsRed的轉化同實施例8。(3) HBx基因的PCR產(chǎn)物的回收與純化過程同實施例2。將回收和純化 過的HBx基因PCR產(chǎn)物與pEGFP/DsRed (衍生質粒)分別進行雙酶切反應以便將HBx 插入到pEGFP/DsRed的相應位置處。具體雙酶切方法和克隆過程同實施例11。只 是過程中使用的限制性內(nèi)切酶分別為Xba I和Not I，并且回收的HBx基因 的PCR片斷大小約為465bp，回收的載體pEGFP/DsRed片斷大小約為5600bp。具 體連接體系和操作過程同實施例11。(4) 陽性重組子pEGFP/DsRed-朋x的鑒定。HBx基因的序列測定，同實 施例9中的(4b)，測序結果正確。實施例14載體pEGFP/DsRed在真核細胞內(nèi)表達熒光蛋白功能的鑒定(具體 試驗結果見圖8)因為本發(fā)明pEGFP/DsRed理論上可以在真核細胞中既表達出綠色熒光蛋白也 可以表達出紅色熒光蛋白，如果將質粒轉染入真核細胞內(nèi)，在顯微鏡下既可以觀察 到綠色熒光信號而且也可以觀察到紅色熒光信號的話，那么可以表明pEGFP/DsRed 所克隆進入的EGFP基因和DsRed-Monomer基因具有生物學功能。具體細胞的相關操 作技術如下(1) 本發(fā)明中所用Hela細胞的培養(yǎng)。Hela細胞系從中國典型培養(yǎng)物保藏 中心購買，保藏編號CCTCC GDC009，為普通細胞株。Hela細胞系培養(yǎng)于含 10。/。熱失活小牛血清FCS (FCS; Gibco)、 lmM L-谷氨酸的DMEM (DMEM; Invitrogen， Gibco)培養(yǎng)基中于37。C、 5%0)2中培養(yǎng)。(a)細胞的傳代培養(yǎng)。待細 胞長到80%豐度時，吸去培養(yǎng)瓶內(nèi)的陳舊培養(yǎng)液。(b)用無菌PBS緩沖液(0.2g KC1， 0.2gKH2PO4,8.0gNaCl， 1.56gNa2HP04 . 7H20，融解在1 L雙蒸水中)漂洗細胞 單層兩次，吸去漂洗液，以除去少數(shù)老化或死去的細胞。(c)用無菌吸管吸取lml 0.25%的胰酶加入培養(yǎng)瓶中，置于37'C培養(yǎng)箱消化至細胞變圓(胰酶約2-5分鐘)。(d)加入10ml新鮮DMEM完全培養(yǎng)基，迅速吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形 成細胞懸液。(e)把細胞懸液分成等份，分裝入兩個無菌的細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)。(2) 本發(fā)明中所用Hela細胞進行的轉染操作。本發(fā)明中的細胞轉染都是在24 孔板中進行。轉染全過程必須嚴格無菌操作。具體過程如下(a)在轉染前一天將 待轉染細胞接種于24孔板中，37'C培養(yǎng)。轉染前的細胞密度以60 — 70%為準。(b) 準備以下溶液①稀釋250ng pEGFP/DsRed于50W無血清、無抗菌素的DMEM培養(yǎng) 基中?；靹蚝笫覝?20-25°C，以下相同)靜置10分鐘。②稀釋Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司產(chǎn)品)試劑于50W無血清、無抗菌素的DMEM培養(yǎng)基中?；?勻后室溫靜置5分鐘。(c)混合①、②兩種溶液，室溫靜置15 — 20分鐘。(溶液 可能會呈霧狀渾濁，但不影響轉染)。(d)棄掉培養(yǎng)板中的舊培養(yǎng)基，用0.5 ml 無血清、無抗菌素的DMEM培養(yǎng)基清洗細胞2次，最后每孔加入400W無血清、無抗 菌素的DMEM培養(yǎng)基。(e)將以上Lipofectaraine 2000 — DNA混合物加入到此24 孔板中，前后左右振蕩24孔板使溶液均勻。(f) 37'C溫育6小時。(g)吸出轉染 液，加入正常生長培養(yǎng)基，37'C培養(yǎng)。(h)轉染24-72小時后檢測。(3) 細胞轉染24小時后在熒光顯微鏡下的觀察。24小時后，細胞用倒置熒光 顯微鏡(Leica DMIRB)進行觀察。本發(fā)明表達的DsRed-Monomer用綠光激發(fā)；而 本發(fā)明表達的EGF用藍光激發(fā)。 一旦找到合適的視野之后，那么當分別用綠光和藍 光進行激發(fā)時必須保證所觀察結果是在同一個視野下觀察的結果，而這可以通過僅 僅只改變激發(fā)光源而達到。(4) 在熒光顯微鏡下觀察到的結果如圖8所示，表明pEGFP/DsRed能夠表達 出有生物活性的EGFP和DsRed-Monomer的熒光蛋白。實施例15分別在轉染Linx細胞24小時，48小時，72小時后在熒光顯 微鏡下檢測pEGFP/DsRed-HBx中熒光蛋白的表達(具體試驗結果見圖9)(1) 本發(fā)明中所用的Linx細胞系來源請見Tong WP， Zhou Y, Wang X， Yang F, Wu KL， Wu J"， Zhang Y 2008 An accurate quantitative method for screening effective siRNA probes targeting a Hepatitis B virus transcript in single living cells. A'o/ 力"^fe C。鵬肌367:866-73。
Linx 細 胞系具體的培養(yǎng)、轉染和熒光顯微鏡相關操作技術同實施例H。(2) 在熒光顯微鏡下觀察到的結果如圖9所示。表明本發(fā)明在一定時間范 圍內(nèi)能穩(wěn)定地表達出紅/綠熒光蛋白。實施例16定量熒光流式細胞術對pEGFP/DsRed-HBx表達出的紅/綠熒光蛋白各 自所發(fā)出的熒光強度之間相關性的檢測(具體試驗結果見圖10和11)(1) 將4 nM的siNC與不同濃度的pEGFP/DsRed-HBx進行共轉染Linx細胞系。 轉染質粒的質量分別如下100 ng， 120 ng， 140 ng， 160 ng, 180 ng， 200 ng, 220 ng， 250 ng， 300 ng， 350 ng， 400 ng， 500 ng。 Linx細胞系具體的培養(yǎng)、轉 染相關操作技術同實施例14。(2) 在熒光顯微鏡下觀察到的結果如圖10所示。熒光觀察完之后準備對細胞 進行流式細胞術分析。(3) 流式細胞術分析之前對細胞的處理。(a)棄掉24孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基， 用冰冷的1XPBS清洗兩次；(b)在每個孔中加入lml冰冷的1XPBS，所后用移液 管滴入數(shù)滴0. 25%胰酶，前后左右振蕩平板混勻溶液，將24孔板置于37'C培養(yǎng)約 10分鐘；(c)用移液器反復吹打約50次以吹散Linx細胞；(d)將打散的Linx細胞懸液吸入到2ralEP管中于冰上放置；(e)于4'C在轉速為600Xg的冷凍 離心機下以加速度為6進行離心；(f)棄掉上層液體，在此加入lml冰冷的1XPBS， 重懸細胞，重復5中操作；(g)最后加入500W冰冷的1XPBS于冰上放置以進行 流式細胞儀分析。(4) 分析細胞之前對流式細胞儀的設置。選用EPICS ALTRA IKBeckman Coulter 公司產(chǎn)品)此款流式細胞儀來分析已經(jīng)處理好的細胞。(a)選取流式細胞儀的PMT2 和PMT4通道來收集對應的綠色和紅色熒光。其中PMT2對應的波長范圍為[515， 535]收集EGFP發(fā)出的綠色熒光信號，PMT4對應的波長范圍為[610， 630]收集 DsRed-Monomer發(fā)出的紅色熒光信號；(b)用空白樣品作為流式分析的對照；(c) 樣品的流式結果用軟件Expo32 VI. 2B (Beckman Coulter公司產(chǎn)品)統(tǒng)一分析；(5) 為了更進一步地研究本發(fā)明所表達的紅綠熒光間確實存在著一種曲線關 系，將圖10中的細胞用流式細胞儀進行了分析。對流式細胞儀的參數(shù)進行設置之后， 上樣分析的細胞被分成了4個區(qū)域僅僅只發(fā)紅色熒光的細胞位于B1區(qū)；既發(fā)紅光 也發(fā)綠光的細胞位于B2區(qū)；既不發(fā)紅光也不發(fā)綠光的細胞位于B3區(qū)；僅僅只發(fā)綠光 的細胞位于B4區(qū)。流式結果中的Y軸(PMT4Log)表征的是DsRed-Monomer的紅色 熒光強度；X軸(PMT2 Log)表征的是EGFP的綠色熒光強度。沒有經(jīng)過轉染處理 過的細胞(空白樣品)作為進行流式分析時的內(nèi)參?？瞻讟悠返牧魇浇Y果表明在未 轉染本發(fā)明的細胞中既沒有紅色信號也沒有綠色信號，見圖ll (A)。當轉染了本 發(fā)明之后，那些檢測到熒光信號的細胞大部分位于B2區(qū)，另有一小部分位于B1和 B4區(qū)，見圖ll (B)。流式細胞儀同時將不同區(qū)域內(nèi)的細胞參數(shù)都具體地顯示出來。 例如位于該區(qū)中細胞的數(shù)目(Number)、區(qū)內(nèi)每個細胞的平均綠色熒光強度(X-mean)、區(qū)內(nèi)每個細胞的平均紅色熒光強度(Y-mean)等等。將圖ll (A)和 (B)中的流式結果按照發(fā)明內(nèi)容中提到的方程(1)和(2)計算得到不同質粒濃 度下的平均紅/綠熒光強度，然后用平均紅色熒光強度(MFIofDsRed-Monomer)對 與之相應的平均綠色熒光強度(MFI of EGFP)作圖擬合而成曲線關系圖。方程如 下所示.-MFI (EGFP)=X-mean(B2) X N(B2) + X-mean(B4) X N—/N(B2) + N(B4)—方程(1)MFI (DsRed-Monomer) = (Y-mean(B2) X N(B2> + Y-mean(B4> X N(B4>/N(B2> + N(B4)1—-方程(2)圖11 (C)的結果證明了本發(fā)明所表達的紅/綠熒光蛋白的平均熒光強度間的確 存在著直線關系。將此曲線稱之為校準曲線。方程用R package軟件 (http:〃w冊.r-project. org)擬合而成。實施例17 pEGFP/DsRed-朋x在高通量篩選和精確定量siRNA效率中的應用(具 體試驗結果見圖12和13)(1) 本發(fā)明中使用的siRNA的合成。本發(fā)明中所用的5個靶向HBx的siRNA 和一個耙向無關序列的siRNA (siNC)(詳細信息見發(fā)明內(nèi)容中的表1)均由廣州市 銳博生物科技有限公司合成。所有siRNA干粉溶于無核酸酶的水中以達到25 txM 的儲存濃度。(2) 選取5個siRNA (si9， sil2, sil9-l, si22,和si25)做濃度梯度實驗。 250 ng的pEGFP/DsRed-冊x分別同濃度遞減的siRNA和siNC (25 nM， 50 nM和100 nM) —起共轉染Linx細胞。Linx細胞系具體的培養(yǎng)、轉染和熒光顯微鏡相關操作 技術同實施例M。轉染之后48小時，熒光顯微鏡下觀察到的結果如圖12所示。 在每個濃度下，siNC與250 ng pEGFP/DsRed-HBx共轉染10次，以擬合出在此濃 度下的校準曲線。(3) 每個濃度下的校準曲線都根據(jù)各自濃度下的siNC與250 ng pEGFP/DsRed-HBx共轉染的10個樣品的流式數(shù)據(jù)擬合而成。流式細胞術分析及各自 濃度下校準曲線的繪制同實施例16。(4) 依據(jù)方程式(3)，直接計算出siRNA的效率(圖3b)。方程如 下所示抑制百分率-(tMFl-MFI)DsRed/tMFIDsRe<l X 100%。 tMFI表示的是理論MFI?！匠?3)憶FI表示的是DsRed-Monomer的理論MFI。為了計算出DsRed-Monomer的理論 MFI (tMFI),根據(jù)實施例16中所述的方法，在25 nM， 50 nM和100 nM下依據(jù) siNC的轉染結果，3條不同濃度下各自對應的校準曲線通過方程(l)和方程(2)被 擬合出來(見圖13)?；谛是€，可以輕易地計算出siRNA的效率。基于方程(1)可以計算出待求樣品中細胞表達的EGFP的MFI,另一方面在此校準曲線上與 此EGFP的MFI相對應處就有一個紅色熒光蛋白的MFI,把此從校準曲線上推導出來 的理論上的紅色熒光蛋白的MFI定義為tMFI。 tMFI表示的是當RNAi沒有發(fā)生時細 胞中紅色熒光蛋白的MFI。當RNAi發(fā)生后，利用方程(2)可以計算出此時觀測到 的紅色熒光蛋白的MFI。那么siRNA的抑制效率就可以用DsRed-Monomer的tMFI和 MFI間的差值推導出來，這也就是方程(3)所表示的意義?；诖酥蟹椒?， 一次性 地計算出了此5種siRNA分別在25 nM、 50 nM和100 nM這三個不同的濃度下的抑 制效率，快速高效地得到了 15個樣品的抑制結果(見圖13)。SEQUENCE LISTING<110〉武漢大學〈120〉 一種雙色熒光報告載體構建方法和應用〈130〉 一種雙色熒光報告載體構建方法和應用〈160〉 1<170〉 Patentln version 3. 5〈210〉 1〈211〉 5686<212> 腿〈213〉 人工構建的重組DNA序列〈400〉 1cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccattatgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagtacatggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta ccggactcag atctcgagct caagcttcga attctgcagt cgacggtacc gcgggcccgg gatccaccgg tcgccaccat ggacaacacc gaggacgtca tcaaggagtt catgcagttc aaggtgcgca tggagggctc cgtgaacggc cactacttcg agatcgaggg cgagggcgag ggcaagccct acgagggcac ccagaccgcc aagctgcagg tgaccaaggg cggccccctg60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 84036cccttcgcct gggacatcct gtccccccag ttccagtacg gctccaaggc ctacgtgaag 900caccccgccg acatccccga ctacatgaag ctgtccttcc ccgagggctt cacctgggag 960cgctccatga acttcgagga cggcggcgtg gtggaggtgc agcaggactc ctccctgcag 1020gacggcacct tcatctacaa ggtgaagttc aagggcgtga acttccccgc cgacggcccc 1080gtaatgcaga ag犯gactgc cggctgggag ccctccaccg agaagctgta cccccaggac 1140ggcgtgctga agggcgagat ctcccacgcc ctgaagctga aggacggcgg ccactacacc 1200tgcgacttca agaccgtgta caaggccaag aagcccgtgc agctgcccgg caaccactac 1260gtggactcca agctggacat caccaaccac aacgaggact acaccgtggt ggagcagtac 1320gagcacgccg aggcccgcca ctccggctcc cagt卿gcg gccgcgactc t卿tcataa 1380tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc 1440tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata 1500atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 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4140tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac aaccagcaga 4200acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt 4260ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga 4320ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaagtcgac ctgcaggcgg 4380gactctgggg ttcgaaatga ccgaccaagc gacgcccaac ctgccatcac gagatttcga 4440ttccaccgcc gccttctatg aaaggttggg cttcggaatc gttttccggg acgccggctg 4500gatgatcctc cagcgcgggg atctcatgct ggagttcttc gcccacccta gggggaggct 4560aactgaaaca cggaaggaga c犯taccgga aggaacccgc gctatgacgg caataaaaag 4620acagaataaa acgcacggtg ttgggtcgtt tgttcataaa cgcggggttc ggtcccaggg 4680ctggcactct gtcgataccc caccgagacc ccattggggc caatacgccc gcgtttcttc 4740cttttcccca ccccaccccc caagttcggg tgaaggccca gggctcgcag ccaacgtcgg 4800ggcggcaggc cctgccatag cctcaggtta ctcatatata ctttagattg atttaaaact 4860tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 4920cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 4980ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 5040accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 5100cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 5160cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 5220tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 5280taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg Ucgtgcaca cagcccagct tggagcg認 5340gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga 5400aggg鄉(xiāng)卿gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 5460ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 5520acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 5580 caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc 5640 tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc atgcat 568權利要求
1. 一種雙色熒光報告載體，其序列為SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
2、 一種用于制備權利要求1所述的雙色熒光報告載體的方法，它包括下列步驟A. 衍生質粒pEGFP-Nl-Ampicillin的構建PCR擴增出帶有啟動子和轉錄終 止信號的氨芐基因，此序列是以pUC18為模板利用KOD DNA聚合酶擴增出的 pUCI8中從1566至lj 2617的一段DNA序列，將此序列以平末端的方式插入到 pEGFP-Nl載體的Afl II酶切位點，由此衍生出的質粒為pEGFP-Nl-A卿icillin;B. 衍生質粒pMD18-EGFP的構建PCR擴增出在EGFP基因5'端含有Stu I-Sal I酶切位點的產(chǎn)物，然后將此產(chǎn)物連接到pMD18-T vector中，為pMD18-EGFP;C. 衍生質粒pMD18-EGFP-polyA的構建利用PCR擴增出pEGFP-Nl中從3424 到3860間的一段序列，該序列的兩邊分別含有Pst I和Hind III酶切位點，此 PCR產(chǎn)物經(jīng)Pst I和Hind III雙酶切后連接到上述衍生質粒pMD18-EGFP相應位點， 由此生成的質粒為pMD18-EGFP-polyA;D. 衍生質粒pEGFP/EGFP的構建用Dra II和Stu I雙酶切上述衍生質粒 pMD18-EGFP-polyA，回收其中被切出的大小為1, 188bp的片斷，將此片段亞克隆進 上述己經(jīng)制備好的衍生質粒pEGFP-Nl-Ampicillin相應位置處，由此衍生出的質粒 為pEGFP/EGFP;E. 目的質粒pEGFP/DsRed的最終構建用Nhe I和Not I切下質粒 pDsRed-Monomer-Nl從多克隆位點到DsRed-Monomer基因末尾處的一段775bp的片 斷，將此片段亞克隆進上述己經(jīng)構建好的衍生質粒pEGFP/EGFP的相應位點，由此得 到雙色熒光報告載體pEGFP/DsRed，用此載體轉化大腸桿菌E. coli DH5 a感受態(tài)細 胞，用于其增殖和保藏；F. 雙色熒光報告載體pEGFP/DsRed的 一 種衍生雙色熒光載體 pEGFP/DsRed-HBx的制備方法，步驟如下a.HBx基因片斷的PCR擴增制備:利用PCR擴增出在HBx基因兩邊分別含有NotI和Xba I酶切位點的片斷；b. Xba I酶切的雙色熒光報告載體pEGFP/DsRed的獲得為了獲得Xba I消 化的雙色熒光報告載體pEGFP/DsRed，將雙色熒光報告載體pEGFP/DsRed轉化到 ER2925菌株中，然后從ER2925菌株中抽提出pEGFP/DsRed質粒；c. pEGFP/DsRed-朋x克隆的構建用Not I和Xba I分別雙酶切HBx基因的 PCR產(chǎn)物和從ER2925菌株中抽提出來的雙色熒光報告載體pEGFP/DsRed，將HBx基 因產(chǎn)物連接到pEGFP/DsRed的相應位置，轉化ER2925菌株，得到雙色熒光報告載體 pEGFP/DsRed-HBx。
3、 一種雙色熒光報告載體在高通量篩選且定量siRNA效率中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雙色熒光報告載體的構建方法和應用，一種雙色熒光報告載體，其序列為SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其構建方法步驟為A.衍生質粒pEGFP-N1-Ampicillin的構建；B.衍生質粒pMD18-EGFP的構建；C.衍生質粒pMD18-EGFP-polyA的構建；D.衍生質粒pEGFP/EGFP的構建；E.目的質粒pEGFP/DsRed的最終構建；F.雙色熒光報告載體pEGFP/DsRed的一種衍生雙色熒光載體pEGFP/DsRed-HBx的制備。本發(fā)明方法易行，操作方便，該載體在高通量篩選且定量siRNA效率中的應用。
文檔編號C12N15/63GK101260408SQ200810047159
公開日2008年9月10日 申請日期2008年3月27日 優(yōu)先權日2008年3月27日
發(fā)明者翼 張, 王欣欣, 童文平, 謝茂華 申請人:武漢大學