專利名稱：一種作為豬標記輔助選擇的與生產(chǎn)性狀相關(guān)的分子標記的克隆及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于豬的分子標記輔助選擇技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種作為豬標記輔助選擇的與生產(chǎn)性狀相關(guān)的分子標記的克隆及應(yīng)用，該分子標記與尸A^/尸/ /^基因有關(guān)，利用本發(fā)明克隆的分子標記對豬與生產(chǎn)性狀 進行關(guān)聯(lián)分析。
背景技術(shù)：
養(yǎng)豬業(yè)是我國肉類產(chǎn)品來源的重要支撐產(chǎn)業(yè)，在我國畜牧業(yè)和國民經(jīng)濟中有著舉足輕重的地位。豬的 分子遺傳育種在近年來取得了很大的進展，許多影響豬生長性狀、胴體性狀與肉質(zhì)性狀的新基因被分離克 隆，為現(xiàn)代分子生物技術(shù)應(yīng)用于豬育種提供了分子遺傳基礎(chǔ)。由肥胖而帶來的心血管疾病嚴重影響人類的 健康，人們越來越關(guān)注肉類食品的脂肪含量，因此豬的育種目標由脂肪型向瘦肉型轉(zhuǎn)變。所以分離克隆影 響豬的重要經(jīng)濟性狀的新基因，為加速豬新品種的選育、加快我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展具有及其重要的意義。目前，將現(xiàn)代分子生物學與常規(guī)育種方法結(jié)合所應(yīng)用最多的領(lǐng)域是標記輔助選擇(MAS)與標記輔助導(dǎo) 入(MAI)，它們都是借助分子標記選擇某一座位基因來改變該座位基因頻率的過程。近幾年來，分子標記 有了迅猛的發(fā)展，己經(jīng)從第一代的限制性片段長度多態(tài)性標記和第二代的微衛(wèi)星多態(tài)性標記發(fā)展到第三代 新型分子標記一單核苷酸多態(tài)性(SNP)。 SNP是指由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性， 包括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換，以及單堿基的插入、缺失等。在特定群體中，某一種堿基即某一等位基因出現(xiàn) 于特定位置的概率要大于1%,此位點才能稱之為SNP位點，否則只能稱為突變位點。根據(jù)SNP在基因組 內(nèi)的位置可以人為地劃分為三種形式第一種是基因編碼區(qū)的功能突變，主要分布于基因編碼區(qū)(cording region)，故又稱之為cSNP:另外兩種是遍布于基因組的大量單堿基變異，包括基因周邊SNP(perigenic SNP, pSNP)以及基因間SNP(intergenic SNP, iSNP)。在SNP檢測技術(shù)上， 一般常用的比較成熟的具有代表性的方法如下l.RFLP.限制性內(nèi)切酶是一類能識 另ljDNA序列上的特異位點(通常為4 6bp的反向重復(fù)序列)，并在特異位點處切割的DNA酶類。對于一條DNA 分子來說會產(chǎn)生特定大小和數(shù)目的酶切片段。基因的突變會產(chǎn)生或消除某些酶切位點，從而改變酶切片段 的大小和數(shù)目，這些酶切片段可以通過電泳方法檢測出來。因此RFLP只適于檢測酶切位點處的SNPs，對于 酶切位點以外的SNPs則無法檢測。2.SSCP.—定條件下，單鏈DNA具有一定的折疊結(jié)構(gòu)，這種折疊結(jié)構(gòu)是由 它的核苷酸序列決定的。由于基因突變，DNA分子單鏈的構(gòu)像就會發(fā)生變化，從而在電場中具有不同的遷 移率，因此可以通過電泳方法檢測出來。SSCP的簡單易行，儀器要求低，但"差異靈敏度"較低。另外， DNA單鏈在一定溫度下可能有多種熱溫定性相近的構(gòu)型，那么電泳時同一條DNA分子就可能產(chǎn)生多個條帶' 而且DNA構(gòu)像對溫度的改變非常敏感，所以還需要用別的方法對其進行矯正。隨著SNP技術(shù)的研究的深入，SNP已經(jīng)成為進行豬基因與基因組分析的一個重要研究手段，為豬重要經(jīng) 濟性狀QTL位點的定位與優(yōu)良性狀的選育提供了強有力的工具，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于豬分子育種領(lǐng)域。對 于豬胴體和肉質(zhì)性狀的候選基因，目前已有多例報道。激素敏感脂肪酸(HSL)是動物體內(nèi)脂肪分解的關(guān)鍵 酶，Harbitz等(1999)對8個梅山X大白祖代群體進行了HSL基因多態(tài)性分析表明第7內(nèi)含子1167處有一個Alu多態(tài)性位點，第8外顯子存在G—T的堿基變異，它引起谷氨酸一天冬氨酸的變化。胰島素樣生長因子 2 (IGF2)基因是影響豬瘦肉量的主要候選基因。Knoll等(2000)確定了IGF2基因內(nèi)含子2中G—A的突變 產(chǎn)生了NciI酶切位點。氟烷敏感基因(Hal)是影響豬肉質(zhì)的主效基因，F(xiàn)ujii等(1991)發(fā)現(xiàn)的Hal主要候 選基因I型蘭尼定受體基ra (RYRI )存在18處SNPs，其中第1843位突變(C—T)導(dǎo)致蛋白受體第615位的 Arg變?yōu)镃ys，是導(dǎo)致豬應(yīng)激敏感綜合征(PSS)的原因。豬肌內(nèi)脂肪(IMF)基因影響肉質(zhì)的嫩度、風味和 多汁性，心臟脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)基因主要在心臟、骨骼肌細胞和乳腺細胞表達，可作為影響IMF 含量的候選基因，曹紅鶴等(2002)在豬H-FABP基因內(nèi)發(fā)現(xiàn)了3個SNPs: 5'上游區(qū)第1324位點T—C突變， 第2內(nèi)含子1811位點C—G突變，1970位點T—C突變，它們引起了三個變異酶切位點。前人的研究表明，脂肪酶是水溶性的酶，能水解不能溶解的基質(zhì)，例如甘油二酸酯，磷脂和膽固醇酯。 因此，脂肪酶在脂類代謝和運輸中重要作用，同時它和一些嚴重的疾病例如肥胖，糖尿病和脂肪沉滯性動 脈硬化癥等相關(guān)聯(lián)。脂肪酶基肉家族包括肝酯酶，脂蛋白脂肪酶，內(nèi)皮脂肪酶，磷脂酶A1，胰脂肪酶和 胰脂肪酶相關(guān)蛋白l、 2。胰脂酶在體內(nèi)占優(yōu)勢，胰脂肪酶發(fā)揮作用與胰脂肪酶相關(guān)蛋白l和2緊密相關(guān)。有專家報道胰脂肪酶相關(guān)蛋白2 (PNLIPRP2)與酶原顆粒膜相關(guān)，這預(yù)示著這種酶有可能促進膜結(jié)構(gòu)和 顆粒運輸(M.J.Wishartetal 1993)。胰脂肪酶相關(guān)蛋白2在胰液中出現(xiàn)，它也參與腸內(nèi)的脂解作用。當日 糧脂肪含量達到4%時，為了促進脂肪沉積，避免血糖過多而引起糖尿病，TH鼠表現(xiàn)出(一種研究II一糖 尿病的模型動物)選擇性地減少PNLIPRP2的表達量(Brown et al 2005)。研究巳證實胰脂肪酶相關(guān)蛋白2 對鼠新生兒食物的三酸甘油酯消化起作用。不僅在鼠的小腸組織中能檢測到胰脂肪酶相關(guān)蛋白2的mRNA， 而且在腸上皮細胞和帕內(nèi)特細胞內(nèi)也能檢測到。胰脂肪酶相關(guān)蛋白2在帕內(nèi)特細胞內(nèi)的出現(xiàn)說明了這個酶 既有磷脂酶的活性，也有抗菌活性。對豬的胰脂肪酶相關(guān)蛋白2基因的研究在DNA水平上較少，主要集中在蛋白質(zhì)水平上，而對胰脂肪酶基 因的多態(tài)性研究在人類上研究的較多。研究突變位點在群體中的多態(tài)性，并進行性狀關(guān)聯(lián)分析是研究基因 功能的一個非常有力的手段。所以申請人對豬胰脂肪酶的部分內(nèi)含子進行了多態(tài)研究和關(guān)聯(lián)分析，以期能 夠發(fā)現(xiàn)它在豬的選種選育方面的功能。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，克隆一種作為豬標記輔助選擇的與生產(chǎn)性狀(例如胴體性狀與 肉質(zhì)性狀)相關(guān)的分子標記，并將該分子標記作為豬的標記輔助選擇的應(yīng)用。 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)申請人克隆得到與豬生產(chǎn)性狀(例如胴體性狀與肉質(zhì)性狀)相關(guān)基因/^VL/P/ F2的DNA片段，它的 cDNA序列(包括全長CDS及部分3，-UTR和部分5'-UTR)如序列表SEQ ID NO: 1所述。同時本發(fā)明利用上述克隆的DNA片段克隆得到一種作為豬標記輔助選擇應(yīng)用的與豬生產(chǎn)性狀相關(guān)的 分子標記，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 3所示。所述的分子標記，其特征在于序列表SEQ ID NO: 3所示序列的第190位堿基處有一個T190-C190的堿基突變'導(dǎo)致Ecol30 I -RFLP多態(tài)性。申請人制備了檢測上述堿基突變的正、反向引物'該引物的DNA序列如下所示 正向引物5'-TAGACAAGGCGGAGGATAGC -3'， 反向引物5' - CGTGGGCATCTCTTACAGGC -3'。制備上述分子標記的方法，按照以下步驟用人/W丄/尸/^2基W cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得同源性90n/。以上的表達序列標簽(EST); 然后對EST進行拼接；根據(jù)拼接的序列設(shè)計引物獲得豬的編碼區(qū)全長，根據(jù)與人PW丄/iV F2基因的cDNA 序列的比對結(jié)果大致得出豬尸A^/尸M2基因的3、 4外顯子，在第3、 4外顯子上分別設(shè)計正反擴增引物， 提取豬血液中的DNA，利用設(shè)計的引物PCR擴增豬尸A^/W P2基因的第三內(nèi)含子、PCR產(chǎn)物回收，克隆， 測序，獲得如序列表SEQIDNO: 3所示的核苷酸序列。更詳細的技術(shù)方案參見《具體實施方式
》。


序列表SEQ ID NO: 1是本發(fā)明克隆的豬生產(chǎn)性狀相關(guān)基因/W丄/ M2部分cDNA序列(包含CDS全長及部分3'-UTR和部分5'-UTR)。 序列表SEQ ID NO: 3是本發(fā)明克隆的第一頭外來豬種"大白豬"(即為圖3中的LI)尸A^/尸/2W基因包括第三內(nèi)含子的核苷酸序列。 圖1:本發(fā)明中豬尸W丄/尸W^基因第三內(nèi)含子序列電泳圖片，片段大小為1573bp(瓊脂糖膠濃度為1.5%)。圖中M泳道為DNA分子量標準(DL2000)。 圖2:本發(fā)明中豬尸A^/尸i^2基因部分的擴增序列的電泳圖譜(酶切片段)，片段大小為596bp (瓊脂糖膠濃度為1.5°/。)。圖中M泳道為DNA分子量標準(DL2000)。 圖3:應(yīng)用本發(fā)明的方法對2頭"大白豬"和2頭"梅山豬"包括第三內(nèi)含子的核苷酸序列比對結(jié)果。圖中M1、 M2代表"梅山豬"，Ll、 L2代表"大白豬"。 圖4:本發(fā)明中豬PW丄/尸/ /^基因第三內(nèi)含子的Ecol30l-RFLP的三種基因型(AAABBB)電泳圖譜。(瓊 脂糖膠濃度為2%)，圖中M泳道為DNA分子量標準(DL2000)。
具體實施方式
實施例1:(一)/Wi/ZW12基因CDS克隆及部分DNA序列擴增 (1)引物設(shè)計用人/W￡/P/ P2基因mRNA(GenBank收錄號NM_005396 )為信息探針，利用NCBI中的BLAST工 具在GenBank豬EST數(shù)據(jù)庫中做同源序列篩選，獲得一系列同源性為90%以上的ESTs (片段長度大于 lOObp),將這些ESTs的收錄號在NCBI中用ENTREZ (http:〃www.ncbi,nlm.nih.govAVeb/ Search/index.html) 查詢相應(yīng)序列，然后用序列分析軟件DNAStar中的SeqMan程序構(gòu)建豬EST-重疊群。根據(jù)與人/WiL/i^/>2 基因mRNA的同源比對初步確定起始與終止密碼子位置，設(shè)計引物克隆得到如序列表SEQ ID NO: 1所示 的cDNA序列(包括CDS全長及部分3，-UTR和部分5'-UTR);根據(jù)與人iW丄/尸朋2基因的基因組全長DNA 序列的比對結(jié)果大致得出豬尸W丄/PM基因外顯子的拼接位點，設(shè)計第三內(nèi)含子的擴增引物，選取2頭"大 白豬"和2頭"梅山豬"的DNA做模板，進行PCR擴增、回收、克隆、測序，獲得如序列表SEQIDNO: 3 (包括附圖3中L2、 Ml、 M2所示的序列，該附圖中的Ll序列已經(jīng)包括在SEQ ID NO: 3所示的序列中) 所示的核苷酸序列。通過Cluster W比對發(fā)現(xiàn)存在4處SNP，其中190bp處的T/C堿基突變恰好能被內(nèi)切 酶Eco130 I的識別。擴增iWL^i P2基因cDNA序列的引物如下所示(分3段擴增)第一段為部分5' UTR，第1-4外顯子和部分第5外顯子 正向引物5'ACATCCCGTGTGTGCTGAGG 3', 反向弓l物5'AGGCTGTGCCCGATGAGGTG3'。 第二段為部分3外顯子,4-10外顯子和部分11外顯子 正向弓l物5' TCATAGACAAGGGGGAGGATA3'， 反向引物5' CCCAGTTCGGGGTGGAATAAG 3'。 第三段為部分6外顯子,7-11外顯子和部分3' UTR 正向弓l物5'ACGGACTCTGCTCCCTTCAT3', 反向引物5' TTCAACGTCAAACCACTGGC3'。 擴增的包含尸7VL/尸/^2基因第三內(nèi)含子序列的引物如下所示 正向引物5' TGAGGCTTCAAACTTCC AAC3'， 反向弓I物5' TCTCCAGTCCACACAGATGC 3'。 檢測T190-C190處堿基突變所用的引物序列如下所示 正向引物5'- TAGACAAGGCGGAGGATAGC -3'' 反向引物5' - CGTGGGCATCTCTTACAGGC -3'。 (2) PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測序PCR擴增條件25uL的反應(yīng)體系中加入DNA模板1hL，10xPCR buffer 2.5pL ， MgCl2(25mM) 2|_iL ，dNTP(10mM )0.5nL ,lOmM引物前后各lpL， Taq酶1U,雙蒸水16nL， PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性 4min、 94'C變性40s、退火溫度見表1，退火時間45s; 72'C延伸時間見表1，共35個循環(huán)，最后72'C延 伸10min, 25'C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。表l:擴增用途及退火溫度和延伸時間擴增范圍退火溫度延仲時間為部分5' UTR,第1-4外顯子和部分第5外顯子60. 530s為部分3外顯子,4-10外顯子和部分11外顯子58,6lmin為部分6外顯子，7-ll外顯子和部分3' UTR61.550s包含/Wi/尸i!K 第三內(nèi)含子的序列57.6lmin30s檢測T190-C190處堿基突變的酶切片段60.340sPCR產(chǎn)物的純化具體操作步驟如下在紫外'J0"下從低熔點瓊脂糖凝膠上^刃下含目的片段的凝膠，放入1.5 mL Ependorff管中，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(購自Promega公司)純化PCR產(chǎn)物，按照該試劑盒 說明書操作，具體步驟是每100mg的凝膠中加300nL的Sl液，于65'C溫育10min至凝膠完全融化，將S1/DNA 混合物轉(zhuǎn)入回收柱，9200g離心30s，使?jié){液通過Minicolumn擠出。將下面管子中的廢液倒掉，再加入500nL 的W1液至管中，9200g離心15s，倒掉管中的廢液。再加入500jiL的Wl液，靜置lmin， 9200g離心30s，取下 Minicolumn裝入1.5mlEpendor贈中，加入25 nL的滅菌水或者TE液，靜置lmin之后，9200g離心l min，以 洗脫DNA存于Ependorff管中。連接反應(yīng)將純化PCR產(chǎn)物與PMD18-T Vector (購自TaKaRa公司)連接，連接反應(yīng)總體積是10 u L,其中包括2X Rapid Ligation Bufer, 2. 5 u L; Vector (50ng)， 0.5uL;回收DNA， 7-8nL。稍微彈打 混合均勻，于16'C連接lh以上或者4'C連接過夜。感受態(tài)細胞的制備從37'C培養(yǎng)了 16-20h的新鮮平板上挑取一個DH5a單菌落接種于2mLLB中， 于37'C振蕩培養(yǎng)3 h,轉(zhuǎn)接1 mL菌液于含有30 mL LB的鹽水瓶中，繼續(xù)在37'C振蕩培養(yǎng)約4 h,待OD600 達到0.3-0.4時將鹽水瓶從搖床取出置冰浴冷卻10-15 min，然后將菌液轉(zhuǎn)入離心管中于4°C 4,000g離心10 min以收集細胞，將離心管倒置以棄凈培養(yǎng)液，用10mL冰預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，冰浴30 min,重復(fù)4'C 4，000g離心10min—次，用4 ml冰預(yù)冷的0.1 mol/L的CaCl2重懸沉淀，置4'C保存?zhèn)溆谩＾D(zhuǎn)化在滅菌的1.5mL離心管中加入100"L感受態(tài)細胞，于冰上加入連接產(chǎn)物5nL，用移液槍吸打均 勻，冰浴30min;將離心管置于42'C的循環(huán)水浴中(勿震動)，熱激90s后迅速冰浴2min;再往離心管中 加入400uLLB培養(yǎng)液，在37。C搖床(200rpm/min)溫浴復(fù)蘇45-60rain;離心，去除部分上清液，取100uL 復(fù)蘇后的菌液布于含A即的平板上，鋪平；待液體充分吸收后，倒置平皿，于37'C培養(yǎng)14-16小時，觀察 有無菌落長出；陽性克隆子的鑒定及測序從平板上挑取轉(zhuǎn)化好的菌斑接入含lmL LB的1. 5mL離心管中并于37'C振搖培養(yǎng)約8h左右。以此菌液 為模板，選用原引物或M13 (上海生物工程有限公司提供)測序的通用引物(退火溫度58-6(TC)進行PCR 擴增。電泳檢測，挑取陽性克隆子的菌液送去測序，序列測定由上海生物工程有限公司完成。在本實施例中，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示均為特異的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物 回收純化后克隆測序，測序結(jié)果顯示PCR得到的cDNA序列長度為1573bp，包括CDS全長1416bP及部分 3' HJTK和部分5' -UTR，(如序列表SEQ ID NO: 1所示);PCR得到的三內(nèi)含子序列全長為1592bp,(如 圖1和序列表SEQ ID NO: 3所示)，測序結(jié)果表明在該DNA序列的190bp處存在T190-C190突變。 (3) DNA序列同源性檢索鑒定通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI， http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站的BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)軟件，將測序后獲得的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的己知生理功能基因進 行序列同源性比較，以鑒定和獲得該DNA序列的功能信息。(二) PCR-RFLP診斷施建立RFLP檢測:將PCR產(chǎn)物5jA， 10xBufferlnL，限制性內(nèi)切酶Eco130 I為0.3nL(3U),加雙蒸水補至 IOHL,將樣品混勻后離心，37'C培養(yǎng)箱放置12h，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，記錄基因型，在 紫外燈下拍照。用酶切引物擴增豬基因組DNA得到了 596bp特異性擴增片段(詳見圖2)，附圖3的序列分析結(jié)果表 明在190bp處存在T190-C1卯突變，并導(dǎo)致Ecol30 I -RFLP多態(tài)性。該基因突變位點由兩個等位基因控 制，其中C是沒有形成酶切位點的等位基因，T是形成酶切位點的等位基因。這兩個等位基因可組成三種 基因型其中AA型為未發(fā)生酶切的純合型(電泳檢測時只有596bp —條DNA帶)，BB型為發(fā)生酶切的純 合型(電泳檢測時出現(xiàn)465bp和131bp兩條DNA帶)，AB為雜合型(電泳檢測時出現(xiàn)596bp、 465bp和 131bp三條DNA帶)。(三) PCR—Eco130 1 —RFLP多態(tài)性在各豬種中的分布情況的檢測的應(yīng)用利用PCR—Eco130 I —RFLP檢測了 5個豬種其中屬于中國地方血緣的豬種分別是八眉豬，淮南豬， 梅山豬，屬于外來豬例如歐美血緣的豬種分別是長白豬和大白豬。該突變位點在不同豬種中的基因型和基 因頻率如表2所示，結(jié)果顯示在中國地方豬種中等位基因A和B所占比例差別較大，淮南豬以B等位基因 占優(yōu)勢，梅山豬均為A等位基因。而在國外豬種中A和B等位基因比例差別不大。表2:幾個豬品種中7WL/W 尸2基因l卯位點多態(tài)性的基因型和基因頻率品種個體數(shù)CC(AA〉基因型 TC(AB)TT卿C (A)等位基因頻率 T(B)八眉豬2241260. 4550. 545淮南豬3828280. 1580. 842梅山豬34340010長白豬2171130. 5950. 405大白豬2578100. 4400, 560實施例2:用于統(tǒng)計分析的試驗材料包括2003和2004年兩批大白X梅山F2代總共223頭豬，所分析的性狀主要 為胴體性狀和肉質(zhì)性狀。胴體性狀包括皮率，骨率，肥肉率，瘦肉率，瘦肥肉比例，胴體重，屠宰率，內(nèi) 脂率，至第一頸椎胴體長，至第一肋胸胴體長，6-7腰椎間背膘厚，肩部背膘厚，胸腰椎間背膘厚，臀部 背膘厚，眼肌高，眼肌寬，眼肌面積。肉質(zhì)性狀包括背最長肌pH，股二頭肌pH，頭半棘肌pH，失水率， 系水力，背最長肌色值，股二頭肌色值，背最長肌大理石紋，股二頭肌大理石紋，肌內(nèi)脂肪，肌內(nèi)水分。申請人采用采用SAS統(tǒng)計軟件(SAS Institute Inc, Version 8.0) glm程序進行單標記方差分析， 同時采用reg程序計算基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)，并進行顯著性檢驗，所采用模型為-J^為性狀表型值，W為平均值，^為基因型效應(yīng)；&、 K、巧為固定效應(yīng)，分別為性別、年度、家系 效應(yīng)，Z^w為屠宰體重或屠宰日齡的回歸系數(shù)，胴體性狀以屠宰體重為協(xié)變量，肉質(zhì)性狀以屠宰日齡為協(xié) 變量，生長不考慮協(xié)變量；e,力為殘差效應(yīng)?；蛐蜋z測結(jié)果表明在所檢測的223頭大白X梅山F2代個體中，AA基因型95頭，AB基因型107頭,BB基因型21頭。不同基因型與胴體性狀的統(tǒng)計結(jié)果總結(jié)于表3。不同基因型與肉質(zhì)性狀的統(tǒng)計結(jié)果總結(jié)于表4。 _表3: Eco130I-RFLP基因型與胴體性狀的統(tǒng)計分析表_PNLIPRP2-Eco130 I -RFLP基因型_基因效應(yīng)_性狀 ~---AA基因型 AB基因型_BB基因型_加性效應(yīng)_顯性效應(yīng)皮率(％) 0.094 ± 0.002 G.093土 0.002 0.090±0.004 0.002±0.002 -0.000±0.002骨率(％) 0. 125±0.002 0.124±0.002 0. 123±0.005 -0.005±0. 003 0.003±0.004肥肉率(％) 0.236± 0.005 0.242±0.005 0.245±0.010 0.006±0.003 0.002±0.004瘦肉率(％) 0.545 ± 0.004 0.542±0.004 0.544±0.008 0.115±0.049 -0.018±0.058瘦肥肉比例 2.478 ± 0.073 2.341±0.073 2.322± 0.148 -0.978±0.601 1.823±0.711胴體重(kg) 63.818±0.425 63.982±0.418 64.547±0.851 -0.415±0.421 -0.029±0.498屠宰率W 內(nèi)脂率(%) 至第一頸椎胴體長(cm) 至第一肋胸胴體長(cm)肩部背膘厚(cm) 6-7腰椎間背膘厚(cm) 胸腰椎間背膘厚(cm) 臀部背膘厚(cm) 平均背膘厚(cm) 眼肌高(厘米) 眼肌寬(厘米)眼肌面積 注以上數(shù)值為最小0. 726±0. 0050. 032±0. 001 90. 865±0. 439 77. 979±0. 382 3. 563±0. 083 2. 801±0. 065* 2. 053±0. 0611. 932±0. 0812. 587±0. 061 7. 062士0. 130 6. 621土0, m 29. 360±0. 5270. 728±0. 005 0. 031±0. 001 91.926±0 432 77.970±0.375 3. 6160±. 082 2. 819±0. 064ab2.071±0. 060 2. 017±0. 080 2. 631±0. 060 6. 977±0. 127 6. 7f)7士0. 1350. 732± 0. 010 0. 033土0. 002 90. 716±0. 879 76, 927±0. 763 3. 728±0. 167 3, 091±0. 130b 2. 205±0. 121 2. 023±0. 163 2. 762±0. 122 7. 020±0. 259 6. 951±0. 274 31. 184±1.054-0. 003±0. 005 -0. OOO土O, 001 0. 039±0. 495 0.515±0. 428 -0. 065±0. 098 -0. 134±0. 075 -0. 066±0. 070 -0， 041±0. 092 -0. 076士0. 071 -0. 137±0. 298 -0. 036±0. 262 —0. 996±0. 606-0. OOO士O. 004 -0. OOO土O. 001 -0. 494±0. 372 -0. 235±0. 283 -0. 022土0. 064 0. 039±0. 050 0. 008±0. 046 -0. 029±0. 060 -0. OOO士O. 047 0. 361±0. 197 -0. 228±0. 173 0.棚±0. 40029. 645士0. 518:乘均值士標準誤，數(shù)值上標的字母相同表示差異不顯著，字母不同時，大寫字母 表示差異極顯著，小寫字母表示差異顯著；加性效應(yīng)負值表示b等位基因降低性狀表型值，其上標*表示 p<0. 05，林表示p〈0.0L由表3可以看出，pnliprp2基因型與6-7腰椎間背膘厚呈相關(guān)顯著。在基因效應(yīng)方面，痩肉率加性效 應(yīng)達到顯著水平，瘦肥肉比例顯性效應(yīng)達到顯著水平。aa基因型個體6-7腰椎間背膘厚顯著低于bb基w 型個體，在育種中如果選擇aa基因型的個體可能在一定程度上改善胴體性狀。表4: Eco130I-RFLP基因型與肉質(zhì)性狀的統(tǒng)計分析表PNLIPRP2—Eco130 I -RFLP基,基因效應(yīng)性狀A(yù)A基因型AB基因型BB基因型加性效應(yīng)顯性效應(yīng)背最長肌pH6. 351±0.0136. 340±0.0136, 355±0. 025-0. 002±0.0140. 006±0.010股二頭肌pH6. 405土0. 0096. 404±0. 0096, 410±0.017-0, 002±0. 0100. 002±0. 007頭半棘肌pH6. 424±0. 0086. 420±0曙0086. 427±0. 016-0. 002±0. 0090. 003±0. 006失水率(％)6. 412±0. 175 a6， 979±0. 174 b6.鄉(xiāng)±0. 333ab0. 002±0. 189-0. 285±0. 129*系水率(％)91.284±0. 233 &90.533±0. 231b91.277±0. 444 &0. 004士0.2520. 374±0. m*背最長肌色值18. 709±0. 129&19. 082±0. 128 b18. 666士0. 245 ab0. 021±0.139-0. 197±0. 095*股二頭肌色值18. 027±0. 06718. 164±0. 06618.010±0. 1270. 009士0. 072-O. 073±0. 049背最長肌大理石紋評分3. 548±0.0163. 545士0. 0163.567±0. 031-0. 009士0.0180. 006±0.012股二頭肌大理石紋評分4. 048土0. 0164. 045±0.0164. 067±0. 031-0. 009±0. 0180. 006±0.012肌內(nèi)脂肪(%)3. 667±0. 0503.631±0. 0503. 781±0. 095-0. 057±0. 0540. 047士0. 037肌內(nèi)水分(%)73. 560士0. 06773.681+0, 06773.443士0. 1280. 058士0.073-0. 090±0. 049注以上數(shù)值為最小二乘均值士標準誤，數(shù)值上標的字母相同表示差異不顯著，字母不同時，大寫字 母表示差異極顯著，小寫字母表示差異顯著；加性效應(yīng)負值表示B等位基因降低性狀表型值，其上標*表 示p〈0. 05, *碌示p<0.01.由表4可以看出，失水率、系水力、背最長肌色值在不同基因型間的差異達到顯著水平，且在基因效應(yīng)方面均以顯性作用為主。AA基因型的個體比AB基因型的個體具有更低的失水率、更高的系水力。因 此在育種中選擇AA基因型的個體能改善肉質(zhì)性狀。_序列表_SEQUENCE LISTING<110>華中農(nóng)業(yè)大學<120> —種作為豬標記輔助選擇的與生產(chǎn)性狀相關(guān)的分子標記的克隆及應(yīng)用 <130〉〈141〉 2008-03-12 <■ 3<170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 1573 <212> DNA<213> 豬(Sus scrofa) <220><221> CDS<222> (95).. (1510)<223〉<400> 1acatcccgtg tgtgctgagg gccaccttcc ctgtctgcca gcctcgtgcc tgtgcctctg 60 ggtctccatg cgcgtctctg cttcatccac gaag atg eta ccc tct tgg acc ate 115Met Leu Pro Ser Trp Thr lie1 5ggc ctt etc ctg ctg gcc aca gtc aga gga肪g gag 3tc tgc tat caa 163 Gly Leu Leu Leu Leu Ala Thr Val Arg Gly Lys Glu lie Cys Tyr Gin10 15 20cct ttc ggc tgc ttc tec gat gaa aca cca tgg gcc鄉(xiāng)acc tgt cat 211 Pro Phe Gly Cys Phe Ser Asp Glu Thr Pro Trp Ala Arg Thr Cys His25 30 35tgg cct ttc卿tta ttt ccc tgg gcc ccc aag gac ate gac acc cat 259 Trp Pro Phe Lys Leu Phe Pro Trp Ala Pro Lys Asp lie Asp Thr His 40 45 50 55ttt ctt ctg tac act aat gag aat cca aat sac ttt caa ctg ate朋t 307Phe Leu Leu Tyr Thr Asn Glu Asn Pro Asn Asn Phe Gin Leu lie Asn60 65 70ate act aac ctg gac acc att gag get tea aac ttc caa ctg gac cgc 355lie Thr Asn Leu Asp Thr lie Glu Ala Ser Asn Phe Gin Leu Asp Arg75 80 85aag aca cgc ttc ate ate cat ggc ttc ata gac aag ggg gag gat age 403Lys Thr Arg Phe lie lie His Gly Phe lie Asp Lys Gly Glu Asp Ser 90 95 100tgg CCC tCt g犯3tg tgC 33g 333 atg ttt 333 gtg gag朋g gtg sac 451Trp Pro Ser Glu Met Cys Lys Lys Met Phe Lys Val Glu Lys Val Asn105 110 115tgc ate tgt gtg gac tgg aga cgt ggg gcc ctg acg cga tac acc caa 499 Cys lie Cys Val Asp Trp Arg Arg Gly Ala Leu Thr Arg Tyr Thr Gin 120 125 130 135get gtg cac aac act egg gtc gtg gga gcc gag ata get ttc tta att 547 Ala Val His Asn Thr Arg Val Val Gly Ala Glu lie Ala Phe Leu lie140 145 150caa ggg ctg teg ace aag ttt gac tac aac cct gag aac gtg cac etc 595 Gin Gly Leu Ser Thr Lys Phe Asp Tyr Asn Pro Glu Asn Val His Leu155 160 165ate ggg cac 8gc ctg ggc gcg esc acg gcc gcg geig gcg ggc sgg agg 643 lie Gly His Ser Leu Gly Ala His Thr Ala Ala Glu Ala Gly Arg Arg170 175 180ctg ggg ggc cac gtg ggc agg etc aca ggg ctg gat cca get cag cca 691 Leu Gly Gly His Val Gly Arg Leu Thr Gly Leu Asp Pro Ala Gin Pro185 190 195tgc ttc cag aac aca ccc gag gaa gtt egg ctg gac ccg tec gat gcc 739 Cys Phe Gin Asn Thr Pro Glu Glu Val Arg Leu Asp Pro Ser Asp 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1、一種作為豬標記輔助選擇應(yīng)用的與豬生產(chǎn)性狀相關(guān)的分子標記，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO3所示。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子標記，其特征在于，序列表SEQIDNO: 3所示序列的第190 位堿基處有一個T190-C190的堿基突變，導(dǎo)致Eco130 I -RFLP多態(tài)性。
3、 檢測權(quán)利要求2所述堿基突變的正、反向引物的DNA序列如下所示正向5，- TAGACAAGGCGGAGGATAGC -3，， 反向5' - CGTGGGCATCTCTTACAGGC -3'。
4、 一種實現(xiàn)權(quán)利要求1或2所述的分子標記的制備方法，其特征按照以下步驟用人/W丄/尸i 尸2基因cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得同源性90°/。以上的表達 序列標簽(EST);然后對EST進行拼接；根據(jù)拼接的序列設(shè)計引物獲得豬的編碼區(qū)全長，根 據(jù)與人/W丄/尸i 尸2基因的cDNA序列的比對結(jié)果大致得出豬/Wi:/尸i 尸2基因的3、 4外顯子， 在第3、 4外顯子上分別設(shè)計正反向擴增引物，提取豬血液中的DNA，利用設(shè)計的引物PCR 擴增豬/WZJP/ P2基因的第三內(nèi)含子、PCR產(chǎn)物回收，克隆，測序，獲得如序列表SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。
5、權(quán)利要求1或2所述的分子標記在豬分子標記輔助選擇中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于豬的分子標記輔助選擇技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與豬生產(chǎn)性狀分子標記的克隆及其應(yīng)用。本發(fā)明克隆得到如序列表SEQ ID NO3所示的與豬生產(chǎn)性狀相關(guān)的基因片段，其中在SEQ ID NO3的第190bp處有一個T190-C190的堿基突變，導(dǎo)致Eco130I-RFLP多態(tài)性。本發(fā)明還公開了獲得上述分子標記、引物的制備方法以及利用本發(fā)明克隆的分子標記進行豬生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)分析的方法。本發(fā)明為豬的分子標記輔助選擇提供了新的分子標記。
文檔編號C12Q1/68GK101245348SQ200810047038
公開日2008年8月20日 申請日期2008年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月12日
發(fā)明者付亞原, 任竹青, 波 左, 徐德全, 熊遠著, 蕾 程 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學