專利名稱：利用博德特氏菌轉(zhuǎn)化膽固醇生產(chǎn)低分子量透明質(zhì)酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及博德特氏菌在生產(chǎn)多糖類物質(zhì)的應(yīng)用，尤其涉及利用博德特氏菌轉(zhuǎn)化膽 固醇生產(chǎn)低分子量透明質(zhì)酸的方法。
技術(shù)背景透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid， HA)是一種由p-D-N-乙酰氨基葡萄糖和(3-D-葡萄糖醛 酸為結(jié)構(gòu)單元，以P-1， 4-糖苷鍵連接而成的鏈狀高分子粘多糖。HA廣泛地存在于人或 動物的各種組織中，1934年由美國人Meyer和Palmer首先從牛眼玻璃體中分離出HA。HA也可用獸疫鏈球菌通過發(fā)酵的方法生產(chǎn)，其分子量分布在5xl()S和6xl06道爾 頓之間，主要受HA發(fā)酵和提純工藝的影響。透明質(zhì)酸在許多已開發(fā)和正在開發(fā)的領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，可以用于化妝品、面部 美容、眼科學(xué)、整形外科、風(fēng)濕病學(xué)、傷口復(fù)原、腫瘤學(xué)等領(lǐng)域。其生理學(xué)功能包括為 組織提供機械支持、彈性連接、溶質(zhì)傳輸和為潤滑之用保存水分。研究表明，HA的分子量對HA的活性有影響，不同分子量的HA甚至表現(xiàn)出截然相 反的活性。低分子量透明質(zhì)酸(LMW-HA)具有促血管生成、促進創(chuàng)傷愈合、抗腫瘤及免 疫調(diào)節(jié)等生物活性。此外，低分子量透明質(zhì)酸還可以添加到功能食品中，具有保健和美 容養(yǎng)顏的功效。目前國內(nèi)外主要通過對經(jīng)微生物發(fā)酵產(chǎn)生的高分子量透明質(zhì)酸進行降解獲得低分 子量透明質(zhì)酸，降解的方法主要有物理降解、化學(xué)降解、生物降解三大類。這幾種降解 方法具有歩驟較多，產(chǎn)物分子量不均一及成本較高等缺點。經(jīng)檢索，目前還未見通過微生物轉(zhuǎn)化膽固醇直接生產(chǎn)低分子量透明質(zhì)酸的專利及文獻報道。 發(fā)明內(nèi)容針對現(xiàn)有技術(shù)中所述的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種利用博德特氏菌轉(zhuǎn)化 膽固醇生產(chǎn)低分子量的透明質(zhì)酸的方法。本發(fā)明所述利用博德特氏菌轉(zhuǎn)化膽固醇生產(chǎn)低分子量透明質(zhì)酸的方法，其涉及的工藝步驟如下(1) 菌種選擇選用博德特氏菌(5on/W〃a平)54 CGMCCNo.2229;(2) 斜面培養(yǎng)將上述菌種接種于固體斜面基本無機鹽培養(yǎng)基上，25 37'C條件 下，靜止培養(yǎng)24 72小時；(3) 種子培養(yǎng)取步驟(2)培養(yǎng)后的菌株在無菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于20 100 mL含有質(zhì)量百分比為0.01% 1.0%膽固醇的基本無機鹽培養(yǎng)基中，25 37'C條件 下，振蕩培養(yǎng)24 72小時，制得種子液；(4) 擴大培養(yǎng)以體積百分比為2% 10%的接種量，將上述種子液接種于50 1000 mL含有質(zhì)量百分比為0.1% 1.0%的膽固醇的基本無機鹽培養(yǎng)基中，25 37。C條件下， 振蕩培養(yǎng)48 144小時；(5) 收集發(fā)酵產(chǎn)物將步驟(4)所得的發(fā)酵液以2000 8000 rpm轉(zhuǎn)速離心10 30分鐘，收集上清液，上清液即含低分子量透明質(zhì)酸；(6) 低分子量透明質(zhì)酸分離將步驟(5)中獲得的上清液利用超濾的方法濃縮至l~10ml，通過離子交換層析獲得含低分子量透明質(zhì)酸的溶液；(7) 乙醇沉淀將步驟(6)中獲得的含低分子量透明質(zhì)酸的溶液用3倍體積的無 水乙醇沉淀，收集沉淀即得低分子量透明質(zhì)酸。(8) 干燥將步驟(7)中獲得的低分子量透明質(zhì)酸沉淀置于IO(TC烘箱中干燥，得固體低分子量透明質(zhì)酸。上述利用博德特氏菌轉(zhuǎn)化膽固醇生產(chǎn)低分子量透明質(zhì)酸的方法中，步驟(1)所述的博德特氏菌(SwY/e^/to sp.) ￡4 CGMCC No. 2229已于2007年 10月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市 海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，郵政編碼100080。上述博德特氏菌(Aw/efe〃" sp.)似CGMCC No. 2229可以在基本無機鹽培養(yǎng)基 上以葡萄糖和膽固醇作為碳源生長。步驟(3)、 (4)中所述的基本無機鹽培養(yǎng)基配方為每1000毫升蒸餾水中添加 KH2P04 0.6g， Na2HP04 1.2g， NaCl O.lg， MgS04-7H20 2.7g， CaCl20.1g， (NH4)2S04 0.2g， FeSO40.02g; 115'C條件下滅菌30分鐘。步驟(2)中所述固體斜面基本無機鹽培養(yǎng)基配方為基本無機鹽培養(yǎng)基中添加質(zhì) 量百分比為1.5 2.0%的瓊脂；優(yōu)選添加質(zhì)量百分比為1.8%的瓊脂粉。步驟(2)、 G)、 (4)中所述的培養(yǎng)溫度優(yōu)選30 37'C。步驟(3)所述的菌株振蕩培養(yǎng)時間優(yōu)選36 72小時。步驟(3)、 (4)中所述的膽固醇的質(zhì)量百分比優(yōu)選0.3% 1.0%。步驟(4)所述的菌體振蕩培養(yǎng)時間優(yōu)選60 120小時。步驟(5)所述的離心轉(zhuǎn)速優(yōu)選5000 6000rpm ;離心時間優(yōu)選20 25分鐘。發(fā)明人從2005年即開始了能夠轉(zhuǎn)化膽固醇等甾體化合物的微生物菌株的篩選，本發(fā) 明所述博德特氏菌是發(fā)明人篩選獲得的一株能夠轉(zhuǎn)化膽固醇的博德特氏菌^w^^/to sp.WCGMCCNo.2229菌株，所述菌株己于2007年10月24日保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心。本發(fā)明利用博德特氏菌轉(zhuǎn)化膽固醇成功實現(xiàn)了低分子量透明質(zhì)酸的生產(chǎn)，所述利用 博德特氏菌生產(chǎn)低分子量的透明質(zhì)酸是首次報道。本發(fā)明方法生產(chǎn)的低分子量的透明質(zhì) 酸分子量為150 kD以下，得率達到2g/L以上，己經(jīng)達到或高于國際領(lǐng)先水平，如果通 過發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)會進一步提高產(chǎn)量。利用本發(fā)明所述的博德特氏菌B0Wwe//a Sp.54 CGMCC No. 2229可以制備低分子量 的透明質(zhì)酸，并且可以進一步降解生產(chǎn)寡聚透明質(zhì)酸，可以在醫(yī)藥工業(yè)中作為促血管生 成劑、促進創(chuàng)傷愈合藥物、抗腫瘤藥物及免疫調(diào)節(jié)劑等，具有極大的應(yīng)用前景。本發(fā)明的優(yōu)點在于利用微生物轉(zhuǎn)化膽固醇，生產(chǎn)膽固醇氧化酶和膽甾酮的同時，直 接產(chǎn)生低分子量的透明質(zhì)酸，不需經(jīng)過先生產(chǎn)高分子量的透明質(zhì)酸，再用酶法、物理法 或化學(xué)法進行降解的過程，過程簡單，收率較高，極大地降低了生產(chǎn)成本。
具體實施方式
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明內(nèi)容作進一步的說明。實施例l:(1)菌種選擇選用博德特氏菌(萬wrfefe〃"^.)萬￥ CGMCC No.2229;(2) 斜面培養(yǎng)將上述菌種接種于固體斜面基本無機鹽培養(yǎng)基上，27X:條件下， 靜止培養(yǎng)24小時；(3) 種子培養(yǎng)取步驟(2)培養(yǎng)后的菌株在無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于50mL 含有質(zhì)量百分比為0.02%膽固醇的基本無機鹽培養(yǎng)基中，27'C條件下，振蕩培養(yǎng)24小 時，制得種子液；(4) 擴大培養(yǎng)以體積百分比為3%的接種量，將上述種子液接種于500 mL含有 質(zhì)量百分比為0.2%的膽固醇的基本無機鹽培養(yǎng)基中，27C條件下，振蕩培養(yǎng)48小時；(5) 收集發(fā)酵產(chǎn)物將步驟(4)所得的發(fā)酵液以3000rpm轉(zhuǎn)速離心IO分鐘，收 集上清液，上清液即含低分子量透明質(zhì)酸；(6) 低分子量透明質(zhì)酸分離將歩驟(5)中獲得的上清液利用超濾的方法濃縮至 5ml，通過離子交換層析獲得含低分子量透明質(zhì)酸的溶液；(7) 乙醇沉淀將步驟(6)中獲得的含低分子量透明質(zhì)酸的溶液用3倍體積的無 水乙醇沉淀，收集沉淀即得低分子量透明質(zhì)酸；(8) 干燥將步驟(7)中獲得的低分子量透明質(zhì)酸沉淀置于IO(TC烘箱中干燥， 得固體低分子量透明質(zhì)酸。上述步驟(3)、 (4)中所述的基本無機鹽培養(yǎng)基配方為每1000毫升蒸餾水中添 力口 KH2P04 0.6g， Na2HP041.2g， NaCl O.lg， MgS04.7H20 2.7g， CaCl20.1g， (NH4)2S04 0.2g， FeSO4 0.02g;步驟(2)中所述固體斜面基本無機鹽培養(yǎng)基配方為基本無機鹽 培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百分比為1.8%的瓊脂。實施例2:(1) 菌種選擇選用博德特氏菌(5oWe&〃fl印.)54 CGMCCNo.2229;(2) 斜面培養(yǎng)將上述菌種接種于固體斜面基本無機鹽培養(yǎng)基上，3(TC條件下， 靜止培養(yǎng)36小時；(3) 種子培養(yǎng)取步驟(2)培養(yǎng)后的菌株在無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于60mL 含有質(zhì)量百分比為0.5%膽固醇的基本無機鹽培養(yǎng)基中，30'C條件下，振蕩培養(yǎng)36小時， 制得種子液；(4) 擴大培養(yǎng)以體積百分比為5%的接種量，將上述種子液接種于600 mL含有 質(zhì)量百分比為0.5%的膽固醇的基本無機鹽培養(yǎng)基中，30'C條件下，振蕩培養(yǎng)96小時；(5) 收集發(fā)酵產(chǎn)物將步驟(4)所得的發(fā)酵液以5000rpm轉(zhuǎn)速離心20分鐘，收 集上清液，上清液即含低分子量透明質(zhì)酸；(6) 低分子量透明質(zhì)酸分離將步驟(5)中獲得的上清液利用超濾的方法濃縮至 6ml，通過離子交換層析獲得含低分子量透明質(zhì)酸的溶液；(7) 乙醇沉淀將步驟(6)中獲得的含低分子量透明質(zhì)酸的溶液用3倍體積的無 水乙醇沉淀，收集沉淀即得低分子量透明質(zhì)酸；(8) 干燥將步驟(7)中獲得的低分子量透明質(zhì)酸沉淀置于IO(TC烘箱中干燥， 得固體低分子量透明質(zhì)酸。上述步驟(3)、 (4)中所述的基本無機鹽培養(yǎng)基配方為每1000毫升蒸餾水中添 力口 KH2P04 0.6g, Na2HP041.2g， NaC10.1g， MgS04-7H20 2.7g， CaCl20.1g， (NH4)2S04 0.2g， FeSO4 0.02g;步驟(2)中所述固體斜面基本無機鹽培養(yǎng)基配方為基本無機鹽培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百分比為1.8%的瓊脂。 實施例3:(1) 菌種選擇選用博德特氏菌(SoWe e〃a平)54 CGMCC No.2229;(2) 斜面培養(yǎng)將上述菌種接種于固體斜面基本無機鹽培養(yǎng)基上，32'C條件下， 靜止培養(yǎng)48小時；(3) 種子培養(yǎng)取步驟(2)培養(yǎng)后的菌株在無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于80mL 含有質(zhì)量百分比為0.7%膽固醇的基本無機鹽培養(yǎng)基中，32'C條件下，振蕩培養(yǎng)48小時， 制得種子液；(4) 擴大培養(yǎng)以體積百分比為8%的接種量，將上述種子液接種于800 mL含有 質(zhì)量百分比為0.9%的膽固醇的基本無機鹽培養(yǎng)基中，32'C條件下，振蕩培養(yǎng)120小時；(5) 收集發(fā)酵產(chǎn)物將歩驟(4)所得的發(fā)酵液以6000rpm轉(zhuǎn)速離心25分鐘，收 集上清液，上清液即含低分子量透明質(zhì)酸；(6) 低分子量透明質(zhì)酸分離將步驟(5)中獲得的上清液利用超濾的方法濃縮至 8ml，通過離子交換層析獲得含低分子量透明質(zhì)酸的溶液；(7) 乙醇沉淀將步驟(6)中獲得的含低分子量透明質(zhì)酸的溶液用3倍體積的無 水乙醇沉淀，收集沉淀即得低分子量透明質(zhì)酸；(8) 干燥將步驟(7)中獲得的低分子量透明質(zhì)酸沉淀置于IO(TC烘箱中干燥， 得固體低分子量透明質(zhì)酸。上述步驟(3)、 (4)中所述的基本無機鹽培養(yǎng)基配方為每1000毫升蒸餾水中添 力口 KH2P04 0.6g， Na2HP041.2g， NaC10,lg， MgS04-7H20 2.7g， CaCl20.1g， (NH4)2S04 0.2g， FeSO4 0.02g;步驟(2)中所述固體斜面基本無機鹽培養(yǎng)基配方為基本無機鹽 培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百分比為1.8%的瓊脂。實施例4:(1) 菌種選擇選用博德特氏菌(5wtfefe〃a^.) 54 CGMCC No.2229;(2) 斜面培養(yǎng)將上述菌種接種于固體斜面基本無機鹽培養(yǎng)基上，37'C條件下， 靜止培養(yǎng)72小時；(3) 種子培養(yǎng)取步驟(2)培養(yǎng)后的菌株在無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于100 mL 含有質(zhì)量百分比為1.0%膽固醇的基本無機鹽培養(yǎng)基中，37。C條件下，振蕩培養(yǎng)72小時， 制得種子液；(4) 擴大培養(yǎng)以體積百分比為10%的接種量，將上述種子液接種于1000 mL含 有質(zhì)量百分比為1.0%的膽固醇的基本無機鹽培養(yǎng)基中，37'C條件下，振蕩培養(yǎng)144小 時；(5) 收集發(fā)酵產(chǎn)物將步驟(4)所得的發(fā)酵液以8000卬m轉(zhuǎn)速離心IO分鐘，收 集上清液，上清液即含低分子量透明質(zhì)酸；(6) 低分子量透明質(zhì)酸分離將步驟(5)中獲得的上清液利用超濾的方法濃縮至 10ml，通過離子交換層析獲得含低分子量透明質(zhì)酸的溶液；(7) 乙醇沉淀將步驟(6)中獲得的含低分子量透明質(zhì)酸的溶液用3倍體積的無 水乙醇沉淀，收集沉淀即得低分子量透明質(zhì)酸；(8)干燥將步驟(7)中獲得的低分子量透明質(zhì)酸沉淀置于IO(TC烘箱中干燥， 得固體低分子量透明質(zhì)酸。上述步驟(3)、 (4)中所述的基本無機鹽培養(yǎng)基配方為每1000ml蒸餾水中添加 KH2PO40.6g， Na2HP04 1.2g， NaC10.1g， MgS04'7H20 2.7g， CaCl20.1g， (NH4)2S04 0.2g， FeSO4 0.02g; 115°C滅菌30分鐘。步驟(2)中所述固體斜面基本無機鹽培養(yǎng)基配方為 基本無機鹽培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百分比為1.8%的瓊脂；115°C滅菌30分鐘。
權(quán)利要求
1. 利用博德特氏菌轉(zhuǎn)化膽固醇生產(chǎn)低分子量透明質(zhì)酸的方法，其特征在于，所述方法涉及的工藝步驟如下(1)菌種選擇選用博德特氏菌(Bordetella sp.)B4 CGMCC No.2229；(2)斜面培養(yǎng)將上述菌種接種于固體斜面基本無機鹽培養(yǎng)基上，25～37℃條件下，靜止培養(yǎng)24～72小時；(3)種子培養(yǎng)取步驟(2)培養(yǎng)后的菌株在無菌條件下用接種環(huán)接1～2環(huán)于20～100mL含有質(zhì)量百分比為0.01％～1.0％膽固醇的基本無機鹽培養(yǎng)基中，25～37℃條件下，振蕩培養(yǎng)24～72小時，制得種子液；(4)擴大培養(yǎng)以體積百分比為2％～10％的接種量，將上述種子液接種于50～1000mL含有質(zhì)量百分比為0.1％～1.0％的膽固醇的基本無機鹽培養(yǎng)基中，25～37℃條件下，振蕩培養(yǎng)48～144小時；(5)收集發(fā)酵產(chǎn)物將步驟(4)所得的發(fā)酵液以2000～8000rpm轉(zhuǎn)速離心10～30分鐘，收集上清液，上清液即含低分子量透明質(zhì)酸；(6)低分子量透明質(zhì)酸分離將步驟(5)中獲得的上清液利用超濾的方法濃縮至1～10ml，通過離子交換層析獲得含低分子量透明質(zhì)酸的溶液；(7)乙醇沉淀將步驟(6)中獲得的含低分子量透明質(zhì)酸的溶液用3倍體積的無水乙醇沉淀，收集沉淀即得低分子量透明質(zhì)酸；(8)干燥將步驟(7)中獲得的低分子量透明質(zhì)酸沉淀置于100℃烘箱中干燥，得固體低分子量透明質(zhì)酸。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)、 (4)中所述的基本無機鹽培 養(yǎng)基配方為每1000毫升蒸餾水中添加KH2P04 0.6g， Na2HP04 1.2g， NaCl O.lg， MgS04'7H20 2.7g， CaCl20.1g, (NH4)2S04 0.2g, FeS04 0.02g;步驟(2)中所述固體斜 面基本無機鹽培養(yǎng)基配方為基本無機鹽培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百分比為1.5 2.0%的瓊脂。
3. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(2)、 (3)、 (4)中所述的培養(yǎng)溫度 是30 37。C。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述的菌株振蕩培養(yǎng)時間是36 72小時。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)、 (4)中所述的膽固醇的質(zhì)量 百分比為0.3% 1.0%。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述的菌體振蕩培養(yǎng)時間是60 120小時。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)所述的離心轉(zhuǎn)速是5000 6000 rpm ;離心時間是20 25分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用博德特氏菌轉(zhuǎn)化膽固醇生產(chǎn)低分子量透明質(zhì)酸的方法，其涉及的步驟為(1)菌種選擇；(2)斜面培養(yǎng)；(3)種子培養(yǎng)；(4)擴大培養(yǎng)；(5)收集發(fā)酵產(chǎn)物；(6)低分子量透明質(zhì)酸分離；(7)乙醇沉淀；(8)產(chǎn)物干燥。本發(fā)明利用微生物轉(zhuǎn)化膽固醇生成重要的甾體類藥物的過程中，同時獲得高附加值的低分子量透明質(zhì)酸，工藝步驟簡單，成本低，產(chǎn)率較高，具有重要的理論意義和極好的市場前景，能產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益。
文檔編號C12R1/01GK101250569SQ20081001548
公開日2008年8月27日 申請日期2008年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月2日
發(fā)明者欣 宋, 曲音波, 林建強, 林彥良 申請人:山東大學(xué)