專利名稱：新城疫病毒lamp檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP )技術(shù)快速檢測(cè)新城 疫病毒的試劑盒，并涉及一種4吏用該種試劑盒快速檢測(cè)新i成疫病毒的方法。
背景技術(shù)：
新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的一種禽的急性、高度接觸性傳染病，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害嚴(yán)重。世界動(dòng)物衛(wèi)生組 織(0IE)將其列為法定通報(bào)傳染病，我國(guó)亦將其定為一類動(dòng)物傳染病。隨著高度集約化養(yǎng)禽業(yè)的t艮，ND的防治備受關(guān)注。ND的現(xiàn)場(chǎng)診斷主要依靠發(fā)病 史、臨床癥狀、病理變化和流行病學(xué)調(diào)查綜合判定，這給廣大獸醫(yī)工作人員帶來(lái)了超負(fù) 荷的工作，耗時(shí)費(fèi)力費(fèi)錢?，F(xiàn)場(chǎng)診斷工作中急需快速準(zhǔn)確的篩儉珍斷方法，以利于現(xiàn)場(chǎng) 疫情的確認(rèn)。因此，ND疫情現(xiàn)場(chǎng)快速確認(rèn)，對(duì)于采取果斷有效的樸滅和防控措施十分關(guān) 鍵。在本發(fā)明之前，0IE規(guī)定區(qū)分NDV毒力的經(jīng)典方法主要有雞胚平均致死時(shí)間(MDT)、 腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)、靜脈致病指數(shù)(IVPI)測(cè)定等方法。這些方法報(bào)告結(jié)果時(shí)間長(zhǎng)， 工作量大。而目前普遍采用的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR )技術(shù)需要專門的儀器，而且存在容 易交叉污染和操作過(guò)程繁瑣的缺點(diǎn)。熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time PCR)技 術(shù)雖然較好地解決了交叉污染的問(wèn)題，并簡(jiǎn)化了操作過(guò)程，但需要更復(fù)雜的定量測(cè)定儀 器，因此不適于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，同時(shí)由于4企測(cè)成本較高，也加大了推廣應(yīng)用的難度。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就在于克服上述缺陷，研制一種新城疫病毒LAMP檢測(cè)試劑盒及其檢 測(cè)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種新城疫病毒LAMP檢測(cè)試劑盒，包括以下成分(1) 反應(yīng)液A:含有10x等溫反應(yīng)緩沖液、AMV 8U/jul、 Rnasin 40U/m1、 Bst DM聚合酶8U/m 1、 lOmM dNTP、 100mM碌^酸4美、20laM內(nèi)引物l、 20jjM內(nèi)引物2、 IOjjM外引物I、 10 UM外引物2和5M甜菜堿，其中10x等溫反應(yīng)緩沖液含有200mM三羥基甲基氨基曱烷鹽酸鹽/pH8.8、 100mM氯化鉀、 1 OOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%曲拉通X-l00;內(nèi)引物1為TCCTTAAGCCGGAGGATGTTGGTTTTGCAACAGCTGCACAGATAAC內(nèi)引物2為ACTGACGGATTATCACAACTAGCTTTTGGTCATTAACAAACTGCTGCA外引物l為TTATYGGYRGTGTRGCTCT外引物2為TCRGTTAGGTAYARGTTGAG(2) 反應(yīng)液B: 1000 x的熒光染料SYBR Green I。 本發(fā)明的另一技術(shù)方案是一種新城疫病毒LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)新城疫病毒的方法，其主要技術(shù)步驟包括 (1)組織樣品中RNA的提取A. 取腦、肝等組織0. 5g，在液氮中研磨3-5min呈粉末，將粉末置于1. 5ml離心管 中，加入lml Trizol液后，劇烈搖勻，室溫方文置5-10rain;B. 加入200 in 1氯仿，劇烈搖勻，室溫放置3-5min;C. 12, 000 x g離心15min;D. 吸取上清，加入糖元8-10 in g混勻2min后加入異丙醇500 u 1,混勻，室溫放置 10min;E. 12, OOOxg離心lOrain,去上清，可見沉淀，用75°/。乙醇洗滌，緩慢混勻后靜置 2minjF. 7， 500 x g離心5min,完全去除乙醇，在超凈臺(tái)內(nèi)用風(fēng)吹5min后加入8 ji 1 ddH20 溶解，即為待檢RNA, -20°(:冰箱中保存?zhèn)溆茫?2 )家禽咽喉、泄殖腔棉拭子樣品中RNA的提取取咽喉、泄殖腔棉拭子浸泡于300 ju 1生理鹽水中10rain, 12， 000 x g離心15min,取上清200jal，采用(1)中從組織樣品中提取RNA的方法提取RM;(3 )新城疫病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在裝有23 ju 1反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入2 y 1待檢RNA,于60-65 。C恒溫水浴箱中放 置90min;(4)擴(kuò)增產(chǎn)物的顯色檢測(cè)在上述反應(yīng)管中加入lnl反應(yīng)液B，直接用肉眼觀察顏色變化，如顏色變?yōu)榫G色， 則說(shuō)明樣品中含有新城疫病毒；如果顏色為黃色，說(shuō)明待檢樣品不含有新城疫病毒。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)和積極效果表現(xiàn)在本發(fā)明建立了新城疫病毒LAMP 檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，本試劑盒根據(jù)新城疫病毒的基因保守區(qū)的六個(gè)序列設(shè)計(jì)了兩 個(gè)特異性內(nèi)引物和兩個(gè)特異性外引物，該保守基因序列為新城疫病毒所共有。本發(fā)明采 用LAMP技術(shù)，特異性強(qiáng)，且比PCR檢測(cè)方法有更高的靈敏度，但不需昂貴的PCR儀， 只需普通的金屬浴或水浴箱即可，且結(jié)果不必用凝膠電泳方法來(lái)觀察，使用熒光染料來(lái) 觀察即可，簡(jiǎn)單而快速?？捎糜谛鲁且卟《镜臋z測(cè)，特別適合于基層現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP)技術(shù)具有特 異性強(qiáng)、靈敏度高、快速且成本低等優(yōu)點(diǎn)，其特點(diǎn)是對(duì)耙基因的6個(gè)部位設(shè)定4種引物， 利用鏈置換反應(yīng)在恒溫下使把基因高效擴(kuò)增。由于其反應(yīng)是多種引物共同啟動(dòng)，使得反 應(yīng)結(jié)果比PCR更特異，另外，由于實(shí)行的是等溫?cái)U(kuò)增，反應(yīng)在恒溫水浴箱內(nèi)便可完成， 不僅節(jié)約儀器成本，而且操作方法更簡(jiǎn)單，適于現(xiàn)場(chǎng)快速;f企測(cè)。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)新城疫病毒的方法所需周期長(zhǎng)、靈敏度較低、成本高、 現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用困難等缺陷，提供的新城疫病毒的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，對(duì)新城疫病毒進(jìn) 行LAMP檢測(cè)，快速、準(zhǔn)確性高、靈敏性好、現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用方便，可廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)、食品、 出入境檢疫等領(lǐng)域。
具體實(shí)施方式
下列實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)該當(dāng)作對(duì)本發(fā)明的限制。 按下列配方制作新城疫病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒(1) LAMP反應(yīng)液A:含有10x等溫反應(yīng)緩沖液、AMV 8U/pl、 Rnasin 40U/|al、 Bst DM聚合酶8U/u 1、 10mM dNTP、 lOOmM硫酸鎂、20juM內(nèi)引物1、 20pM內(nèi)引物2、 IO)jM外引物I、 10 pM外引物2和5M甜菜堿，其中10 x等溫反應(yīng)緩沖液含有200mM三羥基曱基氨基甲烷鹽酸鹽/pH8. 8、 lOOraM氯化鉀、 1 OOmM硫酸銨、2OmM疏酸鎂和1%曲拉通X-l00;內(nèi)引物1為TCCTTAAGCCGGAGGATGTTGGTTTTGCAACAGCTGCACAGATAAC內(nèi)引物2為ACTGACGGATTATCACAACTAGCTTTTGGTCATTAACAAACTGCTGCA外引物1為TTATYGGYRGTGTRGCTCT外引物2為TCRGTTAGGTAYARGTTGAG(2) 反應(yīng)液B: 1000 x的熒光染料SYBR Green I。 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP )反應(yīng)液A每管23uL的最佳組成為2. 5 jj 1 10 x等溫反應(yīng)緩沖液、1. 0 u 1 AMV ( 8U/ n 1 )、 0. 25 |a 1 Rnasin ( 40U/ |a 1 )、 1. Om 1 Bst DNA聚合酶(8U/m 1 )、 1. 5p 1 lOraM dNTP、 1. 5 m 1 100mM錄^酸鎂、2. Op 1 20laM內(nèi)引物l、 2.0^1 20nM內(nèi)引物2、 0. 5 p 1 10pM外引物l、 0. 5 ju 1 lOpM外引 物2、 5. Oyl 5M甜菜堿和5. 25 u 1 DEPC處理水。上述新城疫病毒LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)新城疫病毒的方法，包括(1)組織樣品中RNA的提取A. 取腦、肝等組織O. 5g，在液氮中研磨3-5min呈粉末，將粉末置于1. 5ml離心管 中，加入lml Trizol液后，劇烈搖勻，室溫;改置5-10min;B. 加入200 p 1氯仿，劇烈搖勻，室溫放置3-5min;C. 12, 000 x g離心15rain;D. 吸取上清，加入糖元8-10 p g混勻2min后加入異丙醇500 |a 1,混勻，室溫放置 lOmin;E. 12, OOOxg離心lOmin,去上清，可見沉淀，用75%乙醇洗滌，緩慢混勻后靜置 2min;R 7，500 xg離心5min,完全去除乙醇，在超凈臺(tái)內(nèi)甩風(fēng)吹5min后加入8 ju 1 ddH20 溶解，即為待檢RNA， -2(TC水箱中保存?zhèn)溆谩?2 )家禽咽喉、泄殖腔棉拭子樣品中RM的提取取咽喉、泄殖腔棉4式子浸泡于300 ju 1生理鹽水中10min， 12， 000 x g離心15min， 取上清200 jj 1 ，采用(1 )中從組織樣品中提取rna的方法提取rna。(3 )新城疫病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在裝有23 jn 1反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入2 p 1待檢RM,于60-65。C恒溫水浴箱中放 置90min。(4)顯色檢測(cè)在上述反應(yīng)管中加入lMl反應(yīng)液B，直接用肉眼觀察顏色變化，如顏色變?yōu)榫G色， 則說(shuō)明樣品中含有新城疫病毒；如果顏色為黃色，說(shuō)明待檢樣品不含有新城疫病毒。
權(quán)利要求
1.一種新城疫病毒LAMP檢測(cè)試劑盒，包括以下成分(1)反應(yīng)液A含有10×等溫反應(yīng)緩沖液、AMV 8U/μl、Rnas in 40U/μl、Bs t DNA聚合酶8U/μl、10mM dNTP、100mM硫酸鎂、20μM內(nèi)引物1、20μM內(nèi)引物2、10μM外引物1、10μM外引物2和5M甜菜堿，其中10×等溫反應(yīng)緩沖液含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽/pH8.8、100mM氯化鉀、100mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1％曲拉通X-100；內(nèi)引物1為TCCTTAAGCCGGAGGATGTTGGTTTTGCAACAGCTGCACAGATAAC內(nèi)引物2為ACTGACGGATTATCACAACTAGCTTTTGGTCATTAACAAACTGCTGCA外引物1為TTATYGGYRGTGTRGCTCT外引物2為TCRGTTAGGTAYARGTTGAG(2)反應(yīng)液B1000×的熒光染料SYBR Green I。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種新城疫病毒LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于反應(yīng)液A每 管23|i 1的組成為2. 5 n 1 10 x等溫反應(yīng)緩沖液、1. 0m 1 AMV( 8U/ (j 1 )、 0. 25 p 1 Rnasin(40U/|al)、 l.Oial Bst DNA聚合酶(8U/jal)、 1. 5 ja 1 10mM dNTP、 1. 5 (i 1 lOOraM碌u 酸鎂、2.0(jl 20iuM內(nèi)引物1、 2.0m1 20jjM內(nèi)引物2、 0. 5 jj 1 IOjjM外引物I、 0.5 Ul 10juM外引物2、 5. Ojal 5M甜菜堿和5. 25 u 1 DEPC處理水。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新城疫病毒LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)新城疫病毒的方法，其 步驟包括(1)組織樣品中RNA的提取A. 取腦、肝等組織0. 5g,在液氮中研磨3-5min呈粉末，將粉末置于1. 5ml離心管 中，加入lml Trizol液后，劇烈搖勻，室溫放置5-10min;B. 加入200 pl氯仿，劇烈搖勻，室溫;改置3-5min;C. 12， 000 x g離心15rain;D. 吸取上清，加入糖元8-10 u g混勻2min后加入異丙醇500 ja 1 ，混勻，室溫放置 10minjE. 12， OOOxg離'& 10min，去上清，可見沉淀，用75%乙醇洗滌，緩慢混勻后靜置 2minjF. 7， 500 xg離心5fflin,完全去除乙醇，在超凈臺(tái)內(nèi)用風(fēng)吹5min后加入8 n 1 ddH20 溶解，即為待檢RM， -2(TC冰箱中保存?zhèn)溆茫?2 )家禽咽喉、泄殖腔棉拭子樣品中RM的提取取咽喉、泄殖腔棉4式子浸泡于300 ia 1生理鹽水中10min, 12, 000 x g離心15min, 取上清200 jli 1，采用(1)中從組織樣品中提取RM的方法提取RNA;(3 )新城疫病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在裝有23jLi 1反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入2(j 1待檢RNA，于60-65°C恒溫水浴箱中放 置90min;(4)擴(kuò)增產(chǎn)物的顯色檢測(cè)在上述反應(yīng)管中加入1 n 1反應(yīng)液B,直接用肉眼觀察顏色變化，如顏色變?yōu)榫G色， 則說(shuō)明樣品中含有新城疫病毒；如果顏色為黃色，說(shuō)明待檢樣品不含有新城疫病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)快速檢測(cè)新城疫病毒的試劑盒及檢測(cè)方法。本發(fā)明含有10×等溫反應(yīng)緩沖液、AMV 8U/μl、Rnasin 40U/μl、Bst DNA聚合酶8U/μl、10mM dNTP、100mM硫酸鎂、20μM內(nèi)引物1、20μM內(nèi)引物2、10μM外引物1、10μM外引物2和5M甜菜堿的反應(yīng)液A和反應(yīng)液B1000×的熒光染料SYBR GreenI。通過(guò)對(duì)組織樣品中RNA、家禽咽喉及泄殖腔棉拭子樣品中RNA提取、新城疫病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物的顯色檢測(cè)，從而檢測(cè)出新城疫病毒。解決了現(xiàn)有技術(shù)時(shí)間長(zhǎng)、工作量大、交叉污染、操作復(fù)雜等缺陷。本發(fā)明具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速且成本低、操作方法更簡(jiǎn)單，適于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101225447SQ200710192278
公開日2008年7月23日 申請(qǐng)日期2007年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月24日
發(fā)明者林 孫, 磊 張, 潘志明, 焦新安, 耿士忠, 祥 陳 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)