專利名稱：一種利用分子標(biāo)記檢測三系雜交水稻紅蓮型新型恢復(fù)基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用分子標(biāo)記的檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體而言即涉及一種利用分子標(biāo)記檢測三系雜交水稻紅蓮型新型恢復(fù)基因的方法，適用于紅蓮型和含orfH79基因變異類型的細(xì)胞質(zhì)雄性不育的恢復(fù)基因檢測。

背景技術(shù)：
利用分子標(biāo)記進行品種選擇或品種鑒定是當(dāng)前植物生物技術(shù)育種的主要內(nèi)容。它具有準(zhǔn)確、快速、不受季節(jié)限制等優(yōu)點，因而在生產(chǎn)中被廣為采用。分子標(biāo)記輔助選擇是現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)育種技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，它使傳統(tǒng)遺傳育種學(xué)中粗放、經(jīng)驗型的育種技術(shù)向現(xiàn)代精細(xì)、定向選擇轉(zhuǎn)變，使育種變得更加具有可操作性。如果知道某一標(biāo)簽的DNA序列，那么就可以通過簡單的PCR擴增技術(shù)或者RFLP/AFLP技術(shù)，跟蹤特定的有利基因。由于分子標(biāo)記具有唯一性，而且可借助PCR技術(shù)等方法，具有操作簡單、高效、準(zhǔn)確、不依賴表型等優(yōu)點，在遺傳育種上已被廣泛應(yīng)用，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。
細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核是一個有機統(tǒng)一的整體，植物受外界環(huán)境或進化的影響，線粒體基因組功能基因突變往往會導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)，相應(yīng)地細(xì)胞核也會通過突變產(chǎn)生特定的恢復(fù)基因，使不育株的育性恢復(fù)正常，保證子代的傳遞。這些育性恢復(fù)基因被認(rèn)為具有補償或改善細(xì)胞質(zhì)功能失調(diào)的作用從而使小孢子發(fā)育恢復(fù)正常。多數(shù)植物通常具有多種不同的細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型，各自有對應(yīng)的恢復(fù)基因。
有關(guān)細(xì)胞質(zhì)雄性不育及其育性恢復(fù)基因關(guān)系的研究在百里香(Thymusvulgaris)和車前草屬(Plantago)、甜菜野生群體中已有多年的文獻積累，并建立了簡單的進化模型。在百里香草中至少發(fā)現(xiàn)了5種CMS類型，每種CMS類型至少有一個以上相對應(yīng)的恢復(fù)基因位點，各自恢復(fù)基因的分布頻率不同，其中3種CMS細(xì)胞質(zhì)在其CMS起源的原始種群中具有相當(dāng)高的恢復(fù)頻率(Manicaci，et al.1998)。窄葉車前群體中根據(jù)花器官的表型可也劃分為MSI和MSII兩種，而根據(jù)恢保關(guān)系MSII又可劃分為MSIIa和MSIIb兩種，實際上存在三種CMS類型。CMS的育性分別受多個恢復(fù)基因位點單獨作用或由幾個基因通過上位互作實現(xiàn)。而且有趣的是在CMS1類型中恢復(fù)作用的進化在一定程度上是以植株自身生長抑制為代價的，因為群落中的雌性植株普遍比雌雄兩性植株生長旺盛(Budar，etal.2003)。在冠狀車前中同樣存在多種CMS類型，每種CMS至少存在5個以上顯性恢復(fù)或隱性恢復(fù)位點(Koelewijn and Van damme，1995)。甜菜中根據(jù)線粒體結(jié)構(gòu)可以劃分為G-CMS、E-CMS、H-CMS和Owen-CMS四種類型。雖然現(xiàn)在還沒有確切知道它們各自恢復(fù)基因的數(shù)目，但通過對G-CMS、E-CMS恢復(fù)頻率的比較，發(fā)現(xiàn)自然群體中E-CMS的恢復(fù)基因分布頻率比G-CMS的要高得多(Laporte，et al.2001)。
S-CMS細(xì)香蔥有三個獨立作用的恢復(fù)基因X、T和a，其中X能正常穩(wěn)定恢復(fù)不育系的育性。而T基因只有在較高氣溫(24℃/24℃，晝/夜)下才能有效恢復(fù)育性，當(dāng)溫度降低至20℃(20℃/12℃，晝/夜)以下時，便失去恢復(fù)能力。a基因則只有在四環(huán)素(tetracycline)處理條件下才能產(chǎn)生恢復(fù)作用(Engelke and Tatlioglu，2000)。
玉米有S、T和C-CMS三種細(xì)胞質(zhì)類型，三者在遺傳機制上表現(xiàn)差異，它們所對應(yīng)的恢復(fù)基因也截然不同。T-CMS系統(tǒng)的恢復(fù)基因主要是Rf1、Rf2、Rf8和Rf*；C-CMS的恢復(fù)基因為Rf4、Rf5和Rf6；而S-CMS玉米只有恢復(fù)基因Rf3，作用方式為配子體類型。T-CMS玉米恢復(fù)基因目前已有非常詳盡的研究，Rf1、Rf8、Rf*和Rf2是四個已知的T-CMS恢復(fù)基因。其中Rf1具有完全恢復(fù)能力，而Rf2有著協(xié)同的作用，單獨缺乏全恢能力，卻是小孢子正常發(fā)育所必需。而Rf8、Rf*具有替代Rf1的作用，與Rf2協(xié)作恢復(fù)CMS的育性。而定位研究表明Rf8、Rf*等位或者共分離位于同一個基因座，被定位在2L染色體，而Rf1則被定位在第3染色的體著絲粒附近(Wise and Pring，2002)。棉花中的CMS-D2-2和CMS-D8細(xì)胞質(zhì)一般認(rèn)為含有一對顯性恢復(fù)基因；CMS-D2-2型恢復(fù)系可以同時恢復(fù)CMS-D2-2、CMS-hir和CMS-D8細(xì)胞質(zhì)，其中對CMS-D8的恢復(fù)模式為配子體方式，其它為孢子體方式。但是相反，后兩種細(xì)胞質(zhì)的恢復(fù)基因則不能恢復(fù)CMS-D2-2，可見它們的恢保關(guān)系也存在差異(Zhang and McD.Stewart，2001)。小麥的細(xì)胞質(zhì)雄性不育種類繁多，在其常見的CMS系統(tǒng)中，T-CMS小麥目前至少已經(jīng)找到了三個定位在不同染色體上的恢復(fù)基因Rf3、Rf4和Rf6R(關(guān)容霞等，2002)。而D2-CMS小麥育性受兩對獨立遺傳的細(xì)胞核恢復(fù)基因控制，光敏的D2-CMS小麥育性受一對細(xì)胞核恢復(fù)基因控制。K-CMS和V-CMS小麥恢復(fù)性狀的分別受單基因和雙基因控制，這些不同的CMS恢復(fù)基因?qū)Σ煌腃MS細(xì)胞質(zhì)并不具備兼容性(劉春光等，2002)。S-CMS高粱A3細(xì)胞質(zhì)，是配子體不育類型，它是目前已知的植物配子體細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型中唯一的由兩對恢復(fù)基因(Rf3、Rf4)控制F1育性(Tang，et al.1998)。它同孢子體不育系A(chǔ)4、9E的恢復(fù)基因Rf1、Rf2的遺傳模式和位點完全不同。
水稻是中國最主要的糧食作物，以細(xì)胞質(zhì)雄性不育為基礎(chǔ)的三系雜交水稻的成功開發(fā)利用為保障我國糧食安全做出了巨大貢獻。根據(jù)遺傳和細(xì)胞學(xué)特征，水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育分為野敗、紅蓮和包臺三大類型，其各自擁有相應(yīng)的恢復(fù)基因。一般認(rèn)為野敗型有兩對恢復(fù)基因兩對獨立遺傳的恢復(fù)基因Rf3和Rf4，Rf3定位在第1染色體的短臂，與分子標(biāo)記RG532共分離，而Rf4則位于第10染色體的長臂，與分子標(biāo)記G4003連鎖(Yao，et al.1997)，Rf4具有完全恢復(fù)能力，而Rf3則需要Rf4的幫助。遺傳分析表明，野敗型細(xì)胞質(zhì)恢復(fù)基因存在多個恢復(fù)基因位點，野敗型的兩對恢復(fù)基因在不同品種中似乎并不等位。Govinda等(1988分析了6個恢復(fù)系(IR26、IR36、IR54、IR976-19-1、IR42和IR2797-105-2-2-3)之間F1對V20A測交分離群體的育性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有IR26×IR36和IR9761×IR54三交一代育性整齊，沒有不育株出現(xiàn)，其它組合均出現(xiàn)不同程度的育性分離。根據(jù)等位性的不同，將6個品種所具有的恢復(fù)基因分為4種類型IR26和IR36類、IR54和IR976-19-1類、IR42類、IR2797-105-2-2-3類。Ramalinggam等(1995)利用均為有效恢復(fù)系且為兩對基因遺傳的5個品種為試材，進行所有可能的R×R雜交，再用V20A測交，以花粉和小穗育性為指標(biāo)，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)恢復(fù)系間的等位基因是不同的。5個恢復(fù)系可分成兩組IR24、IR29723-143-3-2-1、ARC11353和IR54742-22-19-3、IR9761-19-1，它們擁有不同的R基因?qū)Γ魏蝺蓪Φ倪m宜組合似乎都能恢復(fù)雄性不育系的育性。雖然對這些恢復(fù)基因位點的作用方式并不清楚，但是它清楚說明了野敗恢復(fù)基因存在位點、作用方式的多樣性。
最近，何光華等利用SSR分子標(biāo)記將明恢63的兩對野敗恢復(fù)基因Rf3和Rf4分別定位于第1和第10染色體，其中Rf3距RM1 1.9cM，Rf4位于第RM258和RM304之間，分別相距2.9和0cM(何光華等，遺傳學(xué)報，2002，29(9)798-802)。而李廣賢等利用測交群體BC1F6對水稻恢復(fù)系密陽46的主效恢復(fù)基因進行定位，發(fā)現(xiàn)該基因與RM6100共分離(李廣賢等.中國水稻科學(xué)，2005，19(6)506-510)。推測野敗型恢復(fù)基因在第10染色體上可能存在多個家族成員。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用分子標(biāo)記檢測三系雜交水稻紅蓮型新型恢復(fù)基因的方法，該方法將傳統(tǒng)的遺傳分析和分子遺傳標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來，提高了紅蓮型恢復(fù)基因的選擇效率，對育種材料的選擇由盲目變?yōu)楦泳_了，有目的地發(fā)掘利用新的遺傳基因資源，拓寬恢復(fù)譜，提高了雜交水稻恢復(fù)系的恢復(fù)能力，有利于提高了優(yōu)良恢復(fù)基因的聚合選擇效率。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明涉及以下技術(shù)措施 紅蓮型CMS水稻的育性同包臺一樣受一對恢復(fù)基因控制，劉學(xué)群等(2004)比較分析紅蓮的育性遺傳時發(fā)現(xiàn)紅蓮型恢復(fù)系密陽23和9311之間的恢復(fù)基因并不等位，分別被命名為Rf5和Rf6。并將二者定位在第10染色體長臂，分別與分子標(biāo)記HL-1和HL-7緊密連鎖(Liu XQ et al.Mol Gen Genomics，2004，271586-594)。在此基礎(chǔ)上，申請人通過作圖開發(fā)了兩個更加精密的共分離標(biāo)記M1和M2，可以準(zhǔn)確跟蹤鑒定Rf5和Rf6。可見，不同的恢復(fù)基因分別與各自特異的分子標(biāo)記共分離，如果利用與已知的恢復(fù)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記作對照，與其它恢復(fù)系比較，即有可能發(fā)現(xiàn)一些新的恢復(fù)基因位點，這對于豐富恢復(fù)基因的多樣性、促進雜交水稻的發(fā)展非常有益。
1、恢復(fù)基因共分離分子標(biāo)記的PCR引物設(shè)計 引物設(shè)計基于本實驗室篩選的水稻紅蓮型細(xì)胞質(zhì)恢復(fù)基因共分離分子標(biāo)記M1和M2，序列如下 M1引物(與Rf5共分離) 正向引物F15’-ATGACAAATCTGCTCCGATG-3’ 反向引物R15’-CTTACTTAGGAAAGACTAC-3’ M2引物(與Rf6共分離) 正向引物F25’-GGAGATGCTATAGCAGCAGTG-3’ 反向引物R25’-ATTGCTCCTTACCACCTTGC-3’ 2、DNA的提取 (2)每個含恢復(fù)基因的水稻品種取一段長3-5cm、寬0.5-1cm，重約0.1克的水稻嫩葉及0.2克粉末狀石英沙，依次放入一1.5ml離心管中，作好標(biāo)記，然后在研磨儀上將葉片研磨成漿。
(3)加入500μl CTAB提取液，65℃水浴25-30min，其間每隔5min振蕩一次離心管。
(4)水浴結(jié)束后，每個離心管中加入500μl氯仿∶異戊醇24∶1，混勻20min至顏色深褐色，離心機上10000rpm離心5min。
(5)取上清300μl轉(zhuǎn)移至另一1.5ml離心管；加入600μl無水乙醇，-20℃，混勻，4℃冰上放置20min，12000rpm離心15min。
(6)倒掉上清液，將離心管倒置10min使酒精風(fēng)干，然后加入30μl無菌水溶解DNA沉淀即可。
3、PCR擴增體系的建立 標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴增反應(yīng)體系為15μl，組成如下 總DNA/50 ng1μl 10×PCR buffer/pH8.3 1.5μl 25 mM MgCl20.6μl 25μm dNTP 0.6μl 0.6單位Taq酶 0.6μl 5 pM的引物F1μl 5 pM的引物R1μl 去離子無菌水/ddH2O 8.7μl 合計 15μl 反應(yīng)混合物用礦物油(Sigma公司)覆蓋，PCR反應(yīng)程序如下 1 cycle 94℃ 5min 30 cycle94℃ 1min；50-58℃ 1min；72℃ 1min 1 cycle 72℃ 5min store4℃； 4、擴增DNA片段檢測 (1)分別以含紅蓮恢復(fù)基因Rf5、Rf6的水稻品種密陽23和9311作對照，分別以Rf5、Rf6共分離的分子標(biāo)記M1和M2進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物均在3.0％的瓊脂糖膠上電泳。
(2)電泳電壓為120V，時間1h，使擴增產(chǎn)物充分分開，然后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果。
(3)將每個品種擴增的帶型分別與9311(江蘇省里下河地區(qū)農(nóng)科所)、密陽23(韓國)中Rf5、Rf6共分離的分子標(biāo)記M1和M2帶型進行比較如果某一個水稻品種分子標(biāo)記的帶型與紅蓮型恢復(fù)基因Rf5(密陽23)、Rf6(9311)帶型不同，那么就確定該水稻品種可能攜帶一個與已知的紅蓮Rf5、Rf6不同的新恢復(fù)基因，將其確定為新恢復(fù)基因的候選材料。
5、紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育新恢復(fù)基因位點的確定 (1)以紅蓮不育系粵泰A(廣東省農(nóng)科院水稻所)作為測試對照，抽穗時選擇每個待測材料分別與兩個不育系與候選水稻材料測交，并套袋。雜交25天后即收種，50℃烘烤3天，打破休眠。
(2)將雜交種子在30℃下浸泡12h，然后露水用濕布包裹，30℃下保溫12h；然后在30℃下浸泡12h，繼續(xù)露水用濕布包裹，37℃下保溫12h催芽，當(dāng)芽長0.5cm左右，播種，秧苗30天移栽，按正常生產(chǎn)管理直到抽穗。
(3)抽穗時，用1％KI-I2染色考察每個雜交組合的花粉育性，即每個組合在抽穗時取當(dāng)天即將開放的穎花，挑出花藥，擠出花粉，然后在顯微鏡下觀察，全黑色的為可育花粉，其他的為不育花粉。成熟時考察套袋結(jié)實率和自然結(jié)實率。
(4)當(dāng)測交組合F1花粉育性在30％以上、套袋結(jié)實率在20％以上，其所對應(yīng)的水稻父本，即確定為含恢復(fù)基因。
(5)新恢復(fù)基因的驗證將含紅蓮型恢復(fù)基因的候選恢復(fù)系R’與對照品種雜交，配制雜種F1，即Rf5R’/密陽23；Rf6R’/9311；然后以紅蓮不育系粵泰A作母本與相應(yīng)的雜種F1測交，將測交組合(A//R’/密陽23，A//R’/9311)種植300株以上的群體，觀察育性分離，如果群體中出現(xiàn)不育株，說明候選恢復(fù)系R’的恢復(fù)基因與對照品種恢復(fù)系的恢復(fù)基因不等位，候選恢復(fù)系R’含新的紅蓮恢復(fù)基因。
本發(fā)明的優(yōu)點 本發(fā)明與傳統(tǒng)雜交育種方法相比具有以下優(yōu)點和效果 (1)快速、準(zhǔn)確、可靠核酸提取加上PCR反應(yīng)，總共僅需3-4小時。
(2)設(shè)備簡單，只需要PCR儀、臺式離心機等即可，普通的分子生物學(xué)實驗室皆可完成。
(3)方法簡便、操作方便、高通量PCR反應(yīng)不需要特別的技術(shù)培訓(xùn)，一般的大學(xué)畢業(yè)生或經(jīng)過培訓(xùn)的實驗員均可獨立操作，一次PCR反應(yīng)可以檢測96個材料，可以高通量操作。
(4)將傳統(tǒng)方法與現(xiàn)代生物技術(shù)相結(jié)合，大幅度提高選育效率傳統(tǒng)的雜交方法無法預(yù)測雜交的結(jié)果，而通過分子檢測的材料可以確定具有不同的恢復(fù)基因位點，可以事先對材料進行選擇，大幅度提高篩選效率。
(5)可以拓寬恢復(fù)系育種材料的選擇范圍，增加遺傳多樣性傳統(tǒng)選育恢復(fù)系的育種方法一般是利用已知的恢復(fù)系進行轉(zhuǎn)育，所以恢復(fù)基因類型完全一致，而利用該方法不僅在野生稻中，而且在栽培稻中也檢測到新的紅蓮型恢復(fù)基因。



圖1與紅蓮恢復(fù)基因共分離的分子標(biāo)記M1和M2在野生稻和栽培稻中的PCR擴增檢測示意圖。圖中所有的品種或生態(tài)型是從大量材料中篩選出來的與密陽23(Rf5)或9311(Rf6)有差異帶型的材料集中展示。Marker，DNA分子量標(biāo)記DL2000；含W字母的是野生稻，其余是栽培稻。M1和M2分別代表Rf5、Rf6的共分離標(biāo)記。

具體實施例方式 利用PCR擴增，快速檢測水稻紅蓮型新型恢復(fù)基因的分子標(biāo)記，結(jié)合遺傳分析以篩選紅蓮紅蓮型新型恢復(fù)基因為例，其具體步驟如下 1、PCR引物設(shè)計 引物設(shè)計基于水稻紅蓮型細(xì)胞質(zhì)恢復(fù)基因Rf5和Rf6共分離的分子標(biāo)記M1和M2，序列如下 M1引物 正向引物F15’-ATGACAAATCTGCTCCGATG-3’ 反向引物R15’-CTTACTTAGGAAAGACTAC-3’ M2引物 正向引物F25’-GGAGATGCTATAGCAGCAGTG-3’ 反向引物R25’-ATTGCTCCTTACCACCTTGC-3’ 2、DNA的提取 每個水稻品種取一段長3-5cm、寬0.5-1cm，重約0.1克的水稻嫩葉及0.2克粉末狀石英沙，依次放入一1.5ml離心管中，將葉片研磨成漿，加入500μlCTAB提取液，65℃水浴25-30min；其次是在水浴后的離心管中加入500μl氯仿∶∶異戊醇24∶1，混勻，離心機上10000rpm離心5min，取上清300μl轉(zhuǎn)移至另一1.5ml離心管；然后加入600μl無水乙醇，-20℃，混勻，4℃冰上放置20min，12000rpm離心15min，倒掉上清液，將離心管倒置10min使酒精風(fēng)干，最后溶于30μl無菌水即可。
3、紅蓮恢復(fù)基因連鎖分子標(biāo)記的PCR擴增 標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴增反應(yīng)體系為15μl，組成如下 總DNA/50 ng 1μl 10×PCR buffer/pH8.3 1.5μl 25mM MgCl2 0.6μl 25μm dNTP 0.6μl 0.6單位Taq酶 0.6μl 5 pM的引物F 1μl 5 pM的引物R 1μl 去離子無菌水/ddH2O 8.7μl 反應(yīng)混合物用礦物油覆蓋，PCR反應(yīng)程序如下 1 cycle 94℃ 5 min 30 cycle94℃ 1min；50℃ 0.5min；72℃ 1min 1 cycle 72℃ 5min store4℃； 4、擴增DNA片段電泳分析 (1)以含紅蓮恢復(fù)基因Rf5的密陽23和含Rf6的9311作對照，利用引物M1和M2對這些候選恢復(fù)系進行PCR擴增，所有擴增產(chǎn)物在3.0％的瓊脂糖膠上電泳。
(2)密陽23和9311含紅蓮恢復(fù)基因Rf5、Rf6兩個不同的位點，被檢測水稻品種的帶型同對照的兩個品種一致時，說明該被檢測的品種恢復(fù)基因與兩個對照的恢復(fù)基因等位；如果被檢測的水稻品種育對照的帶型不同，說明被檢測的水稻品種可能含有新的恢復(fù)基因位點。在本實驗中，初步篩選出來的8個材料與9311和密陽23的帶型不同，含有新的恢復(fù)基因(圖1)。
5、恢復(fù)基因的檢測 (1)以紅蓮不育系粵泰A作為測試對照，抽穗時用篩選出的8個待測材料分別與兩個不育系測交，并套袋。雜交20天后即收種，收獲的種子50℃下烘烤3天，打破休眠。
(2)將測交種子在30℃下泡10h，然后露水用濕布包裹，37℃下保溫12h；然后在30℃下泡10h，繼續(xù)露水用濕布包裹，37℃下保溫12h催芽，當(dāng)芽長0.5cm左右，播種，秧苗30天移栽，按正常生產(chǎn)管理直到抽穗。
(3)抽穗時，用1％KI-I2染色考察每個雜交組合的花粉育性，即每個組合在抽穗時取當(dāng)天即將開放的穎花，挑出花藥，擠出花粉，然后在顯微鏡下觀察，深黑色的為可育花粉，其他的為不育花粉。成熟時考察套袋結(jié)實率。
(4)當(dāng)雜種F1花粉育性在30％以上、套袋結(jié)實率在20％以上時，其雜交組合的父本即確定為含恢復(fù)基因。表1中篩選的8個品系測交F1的育性均正常(野生稻雜種由于容易掉粒，所以考種結(jié)果偏低)，說明全部含紅蓮型恢復(fù)基因。
表1 篩選的水稻品種與紅蓮粵泰A測恢雜種F1的育性(％) 6、紅蓮型新型恢復(fù)基因的確定 (1)以含紅蓮恢復(fù)基因Rf5的密陽23和含Rf6的9311分別作母本與測交含恢復(fù)基因的材料雜交，獲得雜種F1，然后以F1為父本與粵泰A測交，獲種子500粒以上，以保證BC1的群體足夠大于300株。
(2)BC1回交群體開花時，顯微鏡觀察每一株花粉的育性，并套袋自交，如果BC1群體中出現(xiàn)不育株，則說明該父本的恢復(fù)基因與9311或密陽23不等位。如果該父本的恢復(fù)基因與Rf5和Rf6都不等位，則說明該父本攜帶新的恢復(fù)基因。
表2.被篩選材料的紅蓮型恢復(fù)基因等位性分析 (3)綜合測交雜種F1的結(jié)實率和分子標(biāo)記分析的結(jié)果，則可確定恢復(fù)基因的位點特征。本試驗中W20的恢復(fù)基因與9311等位，其余的7個材料均攜帶的恢復(fù)基因與已知的Rf5、Rf6都不等位，屬于新的恢復(fù)基因(表2)。該方法綜合運用分子標(biāo)記和遺傳試驗進行分析，并得到了等位性分析的驗證，說明該方法可靠實用。
權(quán)利要求
1.一種利用分子標(biāo)記檢測三系雜交水稻紅蓮型新型恢復(fù)基因的方法，它包括下列步驟
A、共分離分子標(biāo)記的PCR引物設(shè)計
M1引物
正向引物F15’-ATGACAAATCTGCTCCGATG-3’
反向引物R15’-CTTACTTAGGAAAGACTAC-3’
M2引物
正向引物F25’-GGAGATGCTATAGCAGCAGTG-3’
反向引物R25’-ATTGCTCCTTACCACCTTGC-3’；
B、DNA的提取
(1)對每個待檢測的水稻品種取一段長3-5cm、寬0.5-1cm，重0.1克的水稻嫩葉及0.2克粉末狀石英沙，依次放入一1.5ml離心管中，然后在研磨儀上將葉片研磨成漿；
(2)加入500μl CTAB提取液，65℃水浴25-30min，其間每隔5min振蕩一次離心管；
(3)水浴結(jié)束后，每個離心管中加入500μl氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻20min至顏色深褐色，離心機上10000rpm離心5min；
(4)取上清300μl轉(zhuǎn)移至另一1.5m1離心管，加入600μ1無水乙醇，-20℃，混勻，冰上放置20min，12000rpm離心15min；
(5)倒掉上清液，將離心管倒置10min使酒精風(fēng)干，然后加入30μl無菌水溶解DNA沉淀即可；
C、PCR擴增體系的建立
標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴增反應(yīng)體系為15μl，組成如下
總DNA/50ng 1μl
10×PCR buffer/pH8.31.5μl
25mM MgCl2 0.6μl
25μm dNTP 0.6μl
0.6單位Taq酶0.6μl
5 pM的引物F1μl
5 pM的引物R1μl
去離子無菌水/ddH20 8.7μl
反應(yīng)混合物用礦物油覆蓋，PCR反應(yīng)程序如下
1 cycle 94℃ 5min
30 cycle94℃ 1min；50℃ 1min；72℃ 1min
1 cycle 72℃ 5min
store4℃；
D、擴增DNA片段檢測
(1)分別以含紅蓮恢復(fù)基因Rf5、Rf6的水稻品種密陽23和9311作對照，分別以Rf5、Rf6共分離的分子標(biāo)記M1和M2進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物均在3.0％的瓊脂糖膠上電泳；
(2)電泳電壓為120V，時間1h，使擴增產(chǎn)物充分分開，然后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果；
(3)將每個品種擴增的帶型分別與密陽23中Rf5和9311中Rf6共分離的分子標(biāo)記M1和M2帶型進行比較一個水稻品種分子標(biāo)記的帶型與紅蓮型恢復(fù)基因Rf5、Rf6帶型不同，確定該水稻品種攜帶一個與已知的紅蓮Rf5、Rf6不同的新恢復(fù)基因，將其確定為新恢復(fù)基因的候選材料；
E、紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育新恢復(fù)基因位點的確定
(1)以紅蓮不育系粵泰A作為測試對照，抽穗時選擇每個待測材料分別與兩個不育系與候選水稻材料測交，并套袋，雜交25天后即收種，50℃烘烤3天，打破休眠；
(2)將雜交種子在30℃下浸泡12h，然后露水用濕布包裹，30℃下保溫12h，然后在30℃下浸泡12h，繼續(xù)露水用濕布包裹，37℃下保溫12h催芽，芽長0.5cm，播種，秧苗30天移栽，直到抽穗；
(3)抽穗時，用1％KI-I2染色考察每個雜交組合的花粉育性，即每個組合在抽穗時取當(dāng)天即將開放的穎花，挑出花藥，擠出花粉，然后在顯微鏡下觀察，深黑色的為可育花粉，其他的為不育花粉；
(4)當(dāng)測交組合F1花粉育性在30％、套袋結(jié)實率在20％，其所對應(yīng)的水稻父本，即確定為含恢復(fù)基因；
(5)新恢復(fù)基因的驗證將含紅蓮型恢復(fù)基因的候選恢復(fù)系R’與對照品種雜交，配制雜種F1，即Rf5R’/密陽23；Rf6R’/9311；然后以紅蓮不育系粵泰A作母本與相應(yīng)的雜種F1測交，將測交組合(A//R’/密陽23，A//R’/9311)種植300株的群體，觀察育性分離，群體中出現(xiàn)不育株，候選恢復(fù)系R’的恢復(fù)基因與對照品種恢復(fù)系的恢復(fù)基因不等位，候選恢復(fù)系R’含新的紅蓮恢復(fù)基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用分子標(biāo)記檢測三系雜交水稻紅蓮型新型恢復(fù)基因的方法，該方法包括下列步驟首先是特定標(biāo)記的引物設(shè)計，其次是DNA的微量提??；第三是標(biāo)準(zhǔn)PCR擴增體系的建立；第四是擴增的分子標(biāo)記的檢測分析；第五是新恢復(fù)基因的確定。本發(fā)明方法簡便，操作方便，該方法以恢復(fù)基因共分離的分子標(biāo)記為基礎(chǔ)，快速、準(zhǔn)確、可靠地通過實驗室篩選水稻種質(zhì)材料，使新型恢復(fù)系的選育具有強烈的目的性和針對性，提高了新型恢復(fù)系的選育效率。
文檔編號C12Q1/68GK101225442SQ200710168919
公開日2008年7月23日 申請日期2007年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月14日
發(fā)明者李紹清, 譚艷平, 朱英國 申請人:武漢大學(xué)