專利名稱：：凝血酶原分離及其激活的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種凝血酶原分離及其激活的方法。
背景技術(shù)：
：凝血酶是在血液凝固系統(tǒng)中起重要作用的絲氨酸蛋白水解酶，具有較高的專一性，是一種新型速效局部止血藥。1939年Seegers等從血清中成功分離了凝血酶，用于肝臟實(shí)質(zhì)性出血和骨髓出血止血取得顯著效果，隨后Rogers使用凝血酶進(jìn)行消化道止血獲得良好效果，凝血酶制劑開始廣泛使用，應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大，外傷出血止血，手術(shù)中不易結(jié)扎小血管的止血等均有應(yīng)用。我國(guó)于二十世紀(jì)八十年代后期使用豬血中提取的國(guó)產(chǎn)凝血酶治療重型肝炎、肝炎后肝硬化、上消化道出血等。隨后凝血酶又應(yīng)用于急性上消化道出血，鼻出血、扁桃腺摘除、牙出血、手術(shù)中毛細(xì)管滲血及外傷出血等，并收錄于中國(guó)藥典1995年版、2000年版和2005年版。人們通常先提取凝血酶原，再將凝血酶原激活成凝血酶，然后進(jìn)一步分離純化，凝血酶原的制備方法通常有等電點(diǎn)沉淀法、吸附洗脫法、丙酮沉淀法、硫酸銨鹽析法等，在實(shí)際操作中往往合用以上幾種方法；另外也有層析法聯(lián)合其他方法、也有釆用親和層析法純化凝血酶原等。凝血酶原的激活多采用檸檬酸鈉、組織凝血活酶、CaCl2。目前凝血酶原分離及其激活的方法較復(fù)雜，有的需要在低溫條件下完成，有的要采用有機(jī)溶劑，操作繁瑣，而且，所得的凝血酶產(chǎn)品的比活力也不是很高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提供一種工藝方法簡(jiǎn)單、操作容易的凝血酶原分離及其激活的方法，該方法避免了使用有機(jī)溶劑，而且所得到的凝血酶產(chǎn)品的比活力要明顯優(yōu)于現(xiàn)有方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的凝血酶原分離及其激活的方法，其步驟為a.將新鮮血液加入0.38wtn/。檸檬酸鈉作抗凝劑，離心取上清液得抗凝血漿；b.將血漿稀釋10倍后，調(diào)節(jié)pH至5.05.5進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀，收集凝血酶原粗品沉淀；c.用濃度為0.075wt。/。的草酸鉀和0.85wtT。的氯化鈉混合液溶解粗品沉淀，進(jìn)行提?。籨.用透析或超濾方法降低提取液中的電導(dǎo)率到400ns/cm，離心，除去沉淀物，將清液繼續(xù)透析或超濾使其電導(dǎo)率進(jìn)一步下降到1505ps/cm，離心取沉淀物即為凝血酶原沉淀；e.用0.9wt。/。的NaCl溶液對(duì)凝血酶原沉淀進(jìn)行溶解，離心除去不溶物，得凝血酶原溶液；f.加入pH6.88.0的Tris-HCl緩沖液，使其終濃度達(dá)到00.2mol/L，再加入0.252.0wt%CaCO3于545。C激活溫度下激活113分鐘后，離心除去沉淀，所得清液即為凝血酶溶液。本發(fā)明的凝血酶原分離及其激活的方法其所述新鮮血液可為豬血、牛血或人血。本發(fā)明方法利用透析或超濾控制凝血酶原粗提液的電導(dǎo)率的方法，使凝血酶原粗提液中的雜蛋白和凝血酶原在不同的電導(dǎo)率下發(fā)生沉淀，從而使凝血酶原和雜蛋白分離。將凝血酶原的提取液用透析法透析，可以用透析袋進(jìn)行透析，也可以用透析器進(jìn)行透析，截流分子量為530000，使凝血酶原提取液的電導(dǎo)率降低。也可用超濾法來降低凝血酶原提取液的電導(dǎo)率用超濾法濃縮凝血酶提取液，超濾膜的截流分子量為530000，濃縮后加入純水進(jìn)行稀釋，再進(jìn)行超濾濃縮，再稀釋；反復(fù)進(jìn)行濃縮一稀釋，使凝血酶原提取液的電導(dǎo)率降低。當(dāng)用透析法或超濾法使含有不同種類鹽離子的凝血酶原提取液的電導(dǎo)率達(dá)到15(^s/cm5ns/cm范圍時(shí)，凝血酶原便會(huì)沉淀，得到的凝血酶比活力更佳。碳酸銬(CaC03)作為凝血酶原的激活劑是有效而可行的。終濃度為0.252.0wtn/o范圍的CaC03用量都能夠起到激活凝血酶原的作用，優(yōu)選CaC03用量為0.51.5wt%,進(jìn)一步優(yōu)選CaC03用量為1.0wt%。545'C的溫度范圍都可以激活凝血酶原，優(yōu)選激活溫度為1535°C，最優(yōu)選激活溫度為35'C。激活時(shí)間在113分鐘范圍都可以較好地激活凝血酶原，優(yōu)選的激活時(shí)間在410分鐘，最優(yōu)選的激活時(shí)間為7分鐘。Tris-HCl緩沖液對(duì)碳酸鈣(CaC03)激活凝血酶原具有良好的促進(jìn)作用，較適的Tris-HCl濃度為0.050.1mol/L，pH為7.4。按本發(fā)明的凝血酶原分離及其激活的方法所得到的凝血酶產(chǎn)品比活力(即每lmg的效價(jià))可以達(dá)到150u/mg，產(chǎn)量可以達(dá)到9500u/L(血漿)以上；若按中國(guó)藥典的比活力指標(biāo)計(jì)，產(chǎn)量可達(dá)到15000u/L(血漿)以上，比活力大大超過中國(guó)藥典(2005版)規(guī)定的10.0u/mg。本發(fā)明提供的凝血酶原分離及其激活的方法，避免了使用有機(jī)溶劑，使操作簡(jiǎn)便，成本低，所得到的凝血酶產(chǎn)品的比活力要明顯優(yōu)于現(xiàn)有方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l將新鮮牛血加入0.38%檸檬酸鈉作抗凝劑，4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心510分鐘，取上清液，以蒸餾水或純水稀釋10倍，用2X醋酸調(diào)pH至5.05.5，4'C放置過夜。去掉上清液，取出沉淀，4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，收集沉淀。用草酸鉀和氯化鈉的混合液溶解沉淀，進(jìn)行提取，其中混合液中重量百分比濃度草酸鉀為0.075%，氯化鈉為0.85%。提取過程中用1.0%NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH,使其維持在6.5左右。提取約1小時(shí)后，提取液經(jīng)4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去沉淀，得清液。利用超濾方法使凝血酶原提取液濃縮，濃縮后加入蒸餾水或純水(加入水后的總體積不超過原來的總體積)繼續(xù)超濾濃縮，再加入蒸餾水或純水，監(jiān)測(cè)其電導(dǎo)率，當(dāng)被超濾的提取液的電導(dǎo)率達(dá)到設(shè)定的值400ns/cm時(shí)，離心去除沉淀物；離心得到的清液繼續(xù)超濾濃縮，濃縮后再加入蒸餾水或純水，監(jiān)測(cè)其電導(dǎo)率，當(dāng)被超濾的提取液的電導(dǎo)率達(dá)到設(shè)定的值150ps/cm時(shí)，離心得到的沉淀物即為凝血酶原，留下的清液可以轉(zhuǎn)入到實(shí)施例2之中。所得凝血酶原用0.9。/。的NaCl溶液溶解，再離心除去沉淀物后即為凝血酶原溶液。取一定體積的凝血酶原溶液，加入0.1mol/LpH=7.4的Tris-HCl緩沖液，預(yù)熱到35°C;稱取CaC03加入到凝血酶原溶液中，使其濃度達(dá)到1.0wt%，35'C下保溫激活7分鐘，4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘后收集上清液，置冰箱冷藏(一18'C),以測(cè)定酶活力。實(shí)施例2將新鮮豬血加入0.38%檸檬酸鈉作抗凝劑，4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心510分鐘，取上清液，以蒸餾水或純水稀釋10倍，用2X醋酸調(diào)pH至5.05.5,4'C放置過夜。去掉上清液，取出沉淀，4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，收集沉淀。用草酸鉀和氯化鈉的混合液溶解沉淀，進(jìn)行提取，其中混合液中重量百分比濃度草酸鉀為0.075%，氯化鈉為0.85%。提取過程中用1.0%NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH,使其維持在6.5左右。提取約1小時(shí)后，提取液經(jīng)4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去沉淀，得清液。將清液注入透析袋或透析機(jī)中，對(duì)04'C純水進(jìn)行透析，監(jiān)測(cè)其電導(dǎo)率，當(dāng)被透析的提取液的電導(dǎo)率達(dá)到設(shè)定的值400ns/cm時(shí)，離心除去沉淀物；離心得到的清液繼續(xù)透析，當(dāng)被透析的提取液的電導(dǎo)率達(dá)到設(shè)定的值150ias/cm時(shí)，離心得到沉淀為凝血酶原1;得到的清液繼續(xù)透析，當(dāng)被透析的提取液的電導(dǎo)率達(dá)到設(shè)定的值10ps/cm時(shí)，離心得到的沉淀物即為凝血酶原2。所得凝血酶原1和2都用0.9%的NaCl溶液溶解，再離心除去沉淀物后即分別為凝血酶原1和凝血酶原2溶液。取一定體積的凝血酶原2溶液,加入O.lmol/LpH=6.8的Tris-HCl緩沖液，預(yù)熱到35'C;稱取CaC03加入到凝血酶原溶液中，使其濃度達(dá)到1.0wt%，35'C下保溫激活7分鐘，4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘后收集上清液，置冰箱冷藏(一18'C)，以測(cè)定酶活力。實(shí)施例318的操作方法步驟同實(shí)施例2，具體條件參數(shù)見表1所示。表l本發(fā)明實(shí)施例采用的不同泰l作條件<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>采用本發(fā)明的凝血酶原分離及其激活的方法制的凝血酶，為說明其效果，我們參照中國(guó)藥典(2005版)對(duì)其活力進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定方法如下(1)纖維蛋白原溶液的配制纖維蛋白原溶液的配制參考中國(guó)藥典(2005版)。稱取0.1g的纖維蛋白原(瑞士Fluka公司產(chǎn)品)，先加0.9%NaCl溶液50ml，用0.05mol/L磷酸二氫鈉或0.05mol/L磷酸氫二鈉調(diào)pH至7.0-7.4溶解，再稀釋至100ml，即為纖維蛋白原溶液。(2)酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)sigma公司產(chǎn)品)，用0.9%氯化鈉溶液分別制成每ml中含10.0、8.0、6.4、5.0個(gè)活力單位的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。另取內(nèi)徑lcm、長(zhǎng)度10cm的試管4支，各精密加入纖維蛋白原溶液0.9ml，置37'C水浴中保溫5分鐘，再分別精密量取上述4種濃度的凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液各O.lml,迅速加入上述各試管中，立即搖勻并計(jì)時(shí),觀察纖維蛋白原的初凝時(shí)間,每種濃度測(cè)5次,求平均值(5次測(cè)定最大值與最小值的差不得超過平均值的10%)。標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度定為控制凝結(jié)時(shí)間在14-60秒內(nèi)。在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)上，以每管中標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)際活力單位數(shù)(U)為橫坐標(biāo),凝結(jié)時(shí)間(sec)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)樣品酶活測(cè)定取待測(cè)凝血酶樣品液，按酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制中的方法求出凝結(jié)時(shí)間均值，在酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線上或用直線回歸方程求得酶活單位數(shù)。(4)凝血酶溶液中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定牛血漿清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用福林一酚試劑法，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0.3mg/ml牛血清蛋白。試劑甲10mg/ml硫酸銅溶液和20mg/ml酒石酸鉀鈉溶液1:1混合液，取20g無水碳酸鈉、4g氫氧化鈉溶于1L蒸餾水中制得混合液，兩種混合液以1:50混合均勻，放置30分鐘后使用。(試劑甲只能用一天)。試劑乙福林試劑(酚試劑)。取內(nèi)徑lcm,長(zhǎng)10cm的試管6支，分別加入O、0.2、0.4、0.6、0.8、l.Oml的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再用蒸餾水補(bǔ)足為l.Oml，配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。然后加入5ml福林試劑甲，迅速混勻，靜置10分鐘；加入0，5ml福林試劑乙，迅速混勻，靜置15分鐘，見表l。用分光光度計(jì)測(cè)定上述6種濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液在750nm處吸光度，以每管中標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的相對(duì)濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表2福林一酚試劑法測(cè)蛋白的方法<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>凝血酶樣品的蛋白含量的測(cè)定用分光光度計(jì)測(cè)定凝血酶樣品液的吸光度，在牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線上或用回歸方程?hào)顺銎湎鄳?yīng)的蛋白質(zhì)含量，從而計(jì)算出凝血酶樣品液的蛋白質(zhì)濃度(pg/ml)。(5)凝血酶比活的測(cè)定用單位體積內(nèi)酶活單位數(shù)除以單位體積凝血酶樣品液的蛋白質(zhì)含量，計(jì)算出單位蛋白質(zhì)含量中的酶活力單位數(shù)(u/mg)。根據(jù)上述測(cè)試方法，我們測(cè)到各實(shí)施例的凝血酶活力數(shù)值如表3所示。表3本發(fā)明實(shí)施例的凝血酶活力數(shù)值<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從表中可以看出，用透析法或超濾濃縮后進(jìn)行稀釋等方法使含有不同種類鹽的凝血酶原提取液的電導(dǎo)率達(dá)到400ns/cm時(shí)，離心，除去沉淀物，將清液繼續(xù)透析或超濾使其電導(dǎo)率進(jìn)一步下降到1505ns/cm，離心取沉淀物即為凝血酶原沉淀。電導(dǎo)率在150fis/cm5ps/cm范圍的沉淀物激活后得到的凝血酶比活力可達(dá)到150.0u/mg，得率為55.9%。碳酸鈣(CaC03)作為凝血酶原的激活劑是有效而可行的，它的激活效果明顯優(yōu)于常用的激活劑氯化鈣(CaCl2)的激活效果(比活力為ll.lu/mg)。0-0.2mol/L的Tris-HCl濃度，0.25~2.0wt%CaC03，545'C激活溫度，113分鐘的激活時(shí)間也都是適合的操作條件。上述實(shí)施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。權(quán)利要求1、一種凝血酶原分離及其激活的方法，其特征在于其步驟為a.將新鮮血液加入0.38wt％檸檬酸鈉作抗凝劑，離心取上清液得抗凝血漿；b.將血漿稀釋10倍后，調(diào)節(jié)pH至5.0～5.5進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀，收集凝血酶原粗品沉淀；c.用濃度為0.075wt％的草酸鉀和0.85wt％的氯化鈉混合液溶解粗品沉淀，進(jìn)行提取；d.用透析或超濾方法降低提取液中的電導(dǎo)率到400μs/cm，離心，除去沉淀物，將清液繼續(xù)透析或超濾使其電導(dǎo)率進(jìn)一步下降到150～5μs/cm，離心取沉淀物即為凝血酶原沉淀；e.用0.9wt％的NaCl溶液對(duì)凝血酶原沉淀進(jìn)行溶解，離心除去不溶物，得凝血酶原溶液；f.加入pH6.8～8.0的Tris-HCl緩沖液，使其終濃度達(dá)到0～0.2mol/L，再加入0.25～2.0wt％CaCO3于5～45℃激活溫度下激活1～13分鐘后，離心除去沉淀，所得清液即為凝血酶溶液。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的凝血酶原分離及其激活的方法，其特征在于所述新鮮血液為豬血、牛血或人血。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的凝血酶原分離及其激活的方法，其特征在于所述步驟d中清液繼續(xù)透析或超濾使其電導(dǎo)率降低到10ns/cm。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的凝血酶原分離及其激活的方法，其特征在于所述步驟沖加入的Tris-HCl緩沖液其pH7.4，終濃度達(dá)到0.050.1mol/L。5、根據(jù)權(quán)利要求l所述的凝血酶原分離及其激活的方法，其特征在于所述步驟f中CaC03加入量為0.51.5wt%。6、根據(jù)權(quán)利要求l所述的凝血酶原分離及其激活的方法，其特征在于所述步驟沖激活溫度為1535'C。7、根據(jù)權(quán)利要求l所述的凝血酶原分離及其激活的方法，其特征在于所述步驟沖激活時(shí)間為410分鐘。8、根據(jù)權(quán)利要求5所述的凝血酶原分離及其激活的方法，其特征在于所述步驟f中CaC03加入量為lwt。/。。9、根據(jù)權(quán)利要求l所述的凝血酶原分離及其激活的方法，其特征在于所述步驟沖激活溫度為35'C。10、根據(jù)權(quán)利要求l所述的凝血酶原分離及其激活的方法，其特征在于所述步驟沖激活時(shí)間為7分鐘。全文摘要本發(fā)明涉及一種凝血酶原分離及其激活的方法，該方法利用透析或超濾控制凝血酶原粗提液的電導(dǎo)率的方法，使凝血酶原粗提液中的雜蛋白和凝血酶原在不同的電導(dǎo)率下發(fā)生沉淀，從而使凝血酶原和雜蛋白分離。另一方面，選用碳酸鈣(CaCO₃)作為激活劑對(duì)凝血酶原進(jìn)行激活。本發(fā)明工藝方法簡(jiǎn)單、操作容易，避免了使用有機(jī)溶劑，而且所得到的凝血酶產(chǎn)品的比活力要明顯優(yōu)于現(xiàn)有方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號(hào)C12N9/74GK101182505SQ200710156430公開日2008年5月21日申請(qǐng)日期2007年10月29日優(yōu)先權(quán)日2007年10月29日發(fā)明者張連波,章慧益,童微星申請(qǐng)人:浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院