專利名稱：胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)的制作方法
胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)5相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)要求2006年06月26日遞交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 60/816,514的優(yōu)先權(quán)，通過引用將該文獻(xiàn)整體在此并入本申請(qǐng)。技術(shù)領(lǐng)域10 本發(fā)明總的涉及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。在某些具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了與干細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的系統(tǒng)、試劑盒和方法。
背景技術(shù)：
胚胎干細(xì)胞(ESC)可在受精后任何時(shí)間來源于胚前、胚胎或胎兒組 is織。各種類型干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)以前已有過記載，參見例如Robertson, 1997, Afefk^ o/Ce〃 B油gy 75:173^ Thompson et al. 1995, /Voc.脂/.Scz.. USA 92:7844; Thompson et al. 1998, 5We"ce 282:114;美國(guó)專利 No. 5,166,065; 5,332,672; 5，405，772; 5,453,357; 5，639，618; 5，672，499; 5,843,780; 5,914,268; 5,922,597; 5'968，829; 6，040，180; 6,090,622; 6,833,269; 20 6,5 06,574; 6,458,589; 6,667,176; 7,041,438;國(guó)際專利出版物 WO99/20741。當(dāng)在合適條件下培養(yǎng)時(shí)，ESC能以未分化狀態(tài)體外無限增殖，能保 持正常的核型，以及能保持分化成所有三種胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外 胚層)的衍生器官的能力。 25 ESC有潛在的廣泛應(yīng)用。它們可用于藥物開發(fā)領(lǐng)域和基礎(chǔ)科學(xué)研究，在此指出的所述應(yīng)用只是一部分。藥物開發(fā)過程的早期開發(fā)涉及靶位鑒 定和確認(rèn)。耙位確認(rèn)的一部分是利用遺傳修飾的動(dòng)物模型。除了藥物開 發(fā)，也要求開發(fā)功能缺失("基因敲除")和功能增加("基因轉(zhuǎn)入")的 動(dòng)物模型，以基礎(chǔ)闡釋疾病發(fā)展路徑和疾病狀態(tài)。人類干細(xì)胞可特別用于治療廣泛的疾病和病癥，包括自身免疫疾病、傳染病、器官和組織移植以及外傷和老化。培養(yǎng)和維持各種來源的人ESC 5為所有后續(xù)應(yīng)用提供了起點(diǎn)。然而，培養(yǎng)人干細(xì)胞的任務(wù)令人沮喪。目 前培養(yǎng)人干細(xì)胞的方法，通常涉及利用與人ESC直接接觸而培養(yǎng)的飼養(yǎng) 細(xì)胞(鼠胚胎成纖維細(xì)胞)，或者涉及在鼠胚胎成纖維細(xì)胞條件化的培養(yǎng) 基存在下，將人ESC培養(yǎng)于基質(zhì)例如膠原蛋白、纖連蛋白等等。ESC是遺傳修飾鼠模型開發(fā)的基本工具。為了確保用于ESC的遺傳 io改變能在基因工程鼠的基因型中保持，ESC必須在培養(yǎng)操作、擴(kuò)增和后 續(xù)胚泡注射整個(gè)期間保持全部多能性。將ESC保持在未分化狀態(tài)的要求, 是克隆分離和擴(kuò)增過程中的常規(guī)挑戰(zhàn)。目前的方法典型地是通過將ESC 與鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)而完成的，其中在共培 養(yǎng)時(shí)，兩類細(xì)胞直接接觸。該方法目前在96孔組織培養(yǎng)處理板上進(jìn)行。 15 該工藝流程復(fù)雜，涉及在96孔板中培養(yǎng)MEF，用Y輻射或絲裂霉素C處理，將MEF有絲分裂去活以阻止其過度生長(zhǎng)，以及接著在ESC胚泡 注射前除去MEF。除了涉及許多步驟以外，ESC-MEF共培養(yǎng)物代謝也非 常活躍，由于96孔制式中培養(yǎng)基體積較小，所以這要求培養(yǎng)基每天更換 兩次。20 因此，體外培養(yǎng)和維持任何來源ESC的條件一般復(fù)雜、耗時(shí)、勞動(dòng)強(qiáng)度高、困難而昂貴。因此，需要適合體外生長(zhǎng)ESC的方法、系統(tǒng)和試 劑盒，它們相對(duì)簡(jiǎn)單、容易使用，并能以最小的人力和財(cái)力付出提供穩(wěn) 定的結(jié)果。本文公開的本發(fā)明的某些實(shí)施方式滿足這些需求。25發(fā)明內(nèi)容在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及ESC能培養(yǎng)在多孔膜表面上這個(gè)驚 人發(fā)現(xiàn)。多孔膜可與包括飼養(yǎng)細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)物以流體連通，從而
消除ESC與飼養(yǎng)細(xì)胞層或含胞外基質(zhì)蛋白的基材或它們兩者直接接觸的 需要。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的體外培養(yǎng)ESC的方法包括a)使 多孔膜表面與ESC接觸；b)使固相支持物表面與飼養(yǎng)細(xì)胞，例如胚胎成5纖維細(xì)胞、胎兒成纖維細(xì)胞接觸；C)向所述ESC提供培養(yǎng)基；d)向飼養(yǎng)細(xì)胞提供培養(yǎng)基，其中多孔膜與d)中的培養(yǎng)基以流體連通。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了在含一孔或多孔的組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)ESC的方法，其中每孔包括多孔膜插件和與該多孔膜插件以流體連通的固相支持物，其中所述方法包括a)使多孔膜表面與ESC接觸；b) io使位于多孔膜插件下方的固相支持物表面與飼養(yǎng)細(xì)胞接觸；c)向ESC提供培養(yǎng)基；d)向詞養(yǎng)細(xì)胞提供培養(yǎng)基。在又一其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了體外培養(yǎng)ESC的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括固相支持物；與固相支持物以流體連通的多孔膜；以及適于培養(yǎng)ESC的培養(yǎng)基。本系統(tǒng)可進(jìn)一步包括一種或多種下列物質(zhì)飼養(yǎng)細(xì)胞 15(例如胚胎成纖維細(xì)胞、胎兒成纖維細(xì)胞)、胚胎干細(xì)胞、培養(yǎng)基添加齊U、哺乳動(dòng)物血清、必需氨基酸、抗生素、遺傳篩選轉(zhuǎn)化體試劑、生長(zhǎng)因子、以及白血病抑制因子(LIF)。在再一其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了培養(yǎng)ESC的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括含一孔或多孔的組織培養(yǎng)板，其中每孔包括多孔膜插件和能與多孔 20膜插件以流體連通的固相支持物以及適于培養(yǎng)ESC的培養(yǎng)基。該系統(tǒng)可進(jìn)一步包括含成纖維細(xì)胞例如胚胎成纖維細(xì)胞、胎兒成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng) 細(xì)胞、和/或ESC、培養(yǎng)基添加劑、哺乳動(dòng)物血清、必需氨基酸、抗生素、 用于遺傳篩選轉(zhuǎn)化體的因子、生長(zhǎng)因子、以及白血病抑制因子(LIF)。 在進(jìn)一步實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了培養(yǎng)ESC的試劑盒，所述試劑 25盒包括固相支持物；與固相支持物以流體連通的多孔膜；至少一種容器; 以及培養(yǎng)ESC的說明書。該試劑盒任選地可包括一種或多種下列物質(zhì) 適于培養(yǎng)ESC的培養(yǎng)基；適于培養(yǎng)胚胎成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基；ESC;飼
養(yǎng)細(xì)胞，例如胎兒成纖維細(xì)胞、胚胎成纖維細(xì)胞； 一種或多種緩沖液或 洗滌液；以及培養(yǎng)基添加劑。


5 圖1顯示了適用于本發(fā)明特定實(shí)施方式中的組織培養(yǎng)板的一個(gè)實(shí)例，所述培養(yǎng)板包括適于體外培養(yǎng)ESC的多孔板。圖2顯示了于96孔板中體外培養(yǎng)的ESC培養(yǎng)物的照片，其中每孔包 括0.4pm的PCF膜上層孔，所述膜上層孔插入含飼養(yǎng)細(xì)胞的塑料下層托 盤。圖2a顯示了培養(yǎng)于不同條件下6天后堿性磷酸酶活性染色的ESC克10隆。圖2b顯示了培養(yǎng)于不同條件下堿性磷酸酶活性染色的連續(xù)稀釋用于 克隆篩選的ESC克隆。圖3顯示了于96孔板中體外培養(yǎng)的ESC培養(yǎng)物的照片，其中每孔包 括l.Opm的PET膜上層孔，所述PET膜上層孔插入至塑料下層飼養(yǎng)盤。 該圖比較了用絲裂霉素C和白血病抑制因子(LIF)處理或者單獨(dú)使用絲15裂霉素C處理的飼養(yǎng)細(xì)胞層。圖4顯示了于96孔板中體外培養(yǎng)的ESC培養(yǎng)物的照片，其中每孔包 括l.Opm的PET膜上層孔，所述PET膜上層孔插入至塑料下層飼養(yǎng)盤。 飼養(yǎng)孔包括鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF); MEF和LIF;僅LIF;或除培 養(yǎng)基外的飼養(yǎng)盤空白。20具體實(shí)施方式
培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的方法在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了體外培養(yǎng)ESC的方法，所述方法 簡(jiǎn)單、可靠且相對(duì)容易操作。所述細(xì)胞可保持在未分化狀態(tài)。在一些實(shí) 25施方式中，所述方法包括將ESC與飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)，但消除了在飼養(yǎng)細(xì) 胞層和ESC層之間直接物理接觸的需要。因此，本發(fā)明提供了體外培養(yǎng) ESC的方法，其中ESC可在物理和空間上與詞養(yǎng)細(xì)胞層分離，如借助多孔膜，以使經(jīng)飼養(yǎng)細(xì)胞條件化的培養(yǎng)基能被ESC利用。飼養(yǎng)細(xì)胞層與ESC 層的物理分離有數(shù)種潛在的優(yōu)點(diǎn)。因?yàn)轱曫B(yǎng)細(xì)胞層的生長(zhǎng)不再需要被抑 制，所以飼養(yǎng)層細(xì)胞不再需要被有絲分裂去活。因此，可以消除因子例 如絲裂霉素C或Y輻射的使用。這些因子都具有潛在毒性，由此可引起 5 —些問題——這不僅涉及飼養(yǎng)細(xì)胞本身的良好，而且對(duì)于使用絲裂霉素C 的情況，還涉及在這些條件下所產(chǎn)生的ESC的潛在下游應(yīng)用。從飼養(yǎng)細(xì)胞層物理分離ESC，也將有益于觀察ESC克隆，例如通過 顯微鏡觀察，因此，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N更好的監(jiān)測(cè)ESC的生長(zhǎng)和狀況的 方法。此外，兩層分離有利于分離和/或收集ESC克隆，所述克隆用于克 io隆稀釋或下游操作，例如轉(zhuǎn)染、植入至動(dòng)物或胚泡。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了在多孔膜上培養(yǎng)ESC的方法。本 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，多孔膜表面特別適于培養(yǎng)ESC，因此不需要一般用于培養(yǎng) 人類ESC的含胞外基質(zhì)蛋白的基材，多孔膜由此通過免除試劑花費(fèi)而節(jié) 省了時(shí)間和金錢。15 ESC的接種密度可以根據(jù)培養(yǎng)盤或培養(yǎng)孔的大小調(diào)整。接種密度可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定。培養(yǎng)干細(xì)胞是為了從單細(xì)胞分離物擴(kuò) 增克隆(例如通過連續(xù)稀釋)，或者是為了細(xì)胞分取(splitting)之后擴(kuò)增 已建立的細(xì)胞系。在前一種情況下，細(xì)胞從分取培養(yǎng)物典型稀釋而擴(kuò)增， 以確保干細(xì)胞擴(kuò)增的典型的細(xì)胞密度(即20-80。/。融合(confluence))，然20后再分取，例如1: 2、 1: 4，這取決于期望密度。在一些實(shí)施方式中， 例如當(dāng)ESC是人源細(xì)胞時(shí)，可培養(yǎng)細(xì)胞直至克隆達(dá)到合適大小而無論總 培養(yǎng)物融合情況如何，然后分取。例如，當(dāng)細(xì)胞接種至96孔膜板時(shí)(圖 1 )， ESC可以每膜1-3000個(gè)細(xì)胞、1-2000個(gè)細(xì)胞、1-1500個(gè)細(xì)胞、10-1000 個(gè)細(xì)胞、20-500個(gè)細(xì)胞、50-300個(gè)細(xì)胞的數(shù)量范圍接種在多孔膜上。25 飼養(yǎng)細(xì)胞可以每孔1-5000個(gè)細(xì)胞、1-3000個(gè)細(xì)胞、1-2000個(gè)細(xì)胞、1-1500個(gè)細(xì)胞、10-1000個(gè)細(xì)胞、20-500個(gè)細(xì)胞、50-300個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞密 度接種在固相支持物上，例如塑料盤或位于96孔板下的孔(圖1)。典型 地，可接種飼養(yǎng)細(xì)胞以使細(xì)胞形成單層——可得到1/3融合的初始單層。 在將ESC接種在與飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物以流體連通的膜之前，可使所述細(xì)胞 生長(zhǎng)至融合。適于培養(yǎng)ESC或飼養(yǎng)細(xì)胞例如鼠胚胎成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括 5 Dulbeco的改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基，Dulbeco，s Modified Eagle Media)(Invitrogen， Carlsbad， CA)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以獲得適于 體外培養(yǎng)干細(xì)胞的廣泛培養(yǎng)基，例如特制培養(yǎng)基(Specialty Media)(MilliporeCorporation,Billerica，MA); ResgroTM(Millipore Corporation, Billerica, MA); StemXvivo(R&D Systems, Minneapolis, MN)。 10培養(yǎng)基可以補(bǔ)加血清，例如胎牛血清、經(jīng)ES認(rèn)證的血清(ES qualified serum)(Invitrogen， Carlsbad, CA)， 抗生素，例如Pen Strep(Invitrogen, Carlsbad, CA)，非必需氨基酸(Invitrogen, Carlsbad, CA)，以及谷氨酰胺， 例如Glutamax-l (Invitrogen, Carlsbad, CA)。某些ESC培養(yǎng)物可進(jìn)一步 補(bǔ)加白血病抑制因子，例如Esgro ( Millipore Corporation, Billerica, MA)。 15 細(xì)胞本發(fā)明某些實(shí)施方式涉及與飼養(yǎng)細(xì)胞系共培養(yǎng)干細(xì)胞。合適的干細(xì)胞可包括任何哺乳動(dòng)物干細(xì)胞，例如下列來源的干細(xì)胞包括人類、非 人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物、嚙齒類、鼠、兔、牛、山羊、綿羊、狗、貓、等等。在一個(gè)實(shí)施方式中，干細(xì)胞例如ESC可以是鼠ESC。在另一個(gè)實(shí)施方式 20中，干細(xì)胞可以是例如人ESC。干細(xì)胞可以是有能力形成外胚膜、組織和胚胎本身的全能干細(xì)胞。 干細(xì)胞也可以是有能力形成生物體的大多數(shù)組織，例如內(nèi)胚層、中胚層 或外胚層所衍生組織的多能干細(xì)胞。干細(xì)胞可以是多能干細(xì)胞，例如造 血干細(xì)胞。25 干細(xì)胞可以分離自培養(yǎng)的胚泡并在培養(yǎng)中傳代一次或多次，這樣，可以選擇來自單一袓先的克隆。干細(xì)胞可進(jìn)行遺傳操作以表達(dá)期望的性 狀或基因型。本領(lǐng)域的已知標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可用于將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞，例
如電脂質(zhì)或電穿孔轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)移的遺傳物質(zhì)可包括可選擇標(biāo)記，例如潮霉 素抗性標(biāo)記，等等。
在某些實(shí)施方式中，期望將ESC保持在未分化狀態(tài)。幾種標(biāo)記可用 于監(jiān)測(cè)ESC分化。例如，細(xì)胞表面蛋白OCT-3/4和SSEA-1的高表達(dá)水 5平是未分化ESC的指征。類似地，高水平的堿性磷酸酶活性也是未分化 ESC的指征。相反，ESC的分化以例如OCT-3/4、堿性磷酸酶表達(dá)、SSEA (人或鼠特異性的)的標(biāo)記的缺失和/或胚層特異性標(biāo)記的獲得為指征。
任何合適的飼養(yǎng)細(xì)胞都可用于本發(fā)明。合適的飼養(yǎng)細(xì)胞可允許ESC 生長(zhǎng)和傳代而不會(huì)有顯著的細(xì)胞死亡或分化。不受任何特別理論的限制， H)據(jù)某些文獻(xiàn)提示，飼養(yǎng)細(xì)胞是通過分泌合適的細(xì)胞因子來維持ESC存活 和未分化，而其他文獻(xiàn)最近提示，詞養(yǎng)細(xì)胞起海綿作用，其隔離了 ESC 所產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子。通過隔離正常將會(huì)導(dǎo)致ESC分化的因子，ESC保持 于未分化狀態(tài)。飼養(yǎng)細(xì)胞可以是成纖維細(xì)胞，例如胚胎成纖維細(xì)胞、胎 兒成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞可來自臍帶。成纖維細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物來 15源的，例如人、鼠等等。 固相支持物和多孔膜在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，固相支持物可作為培養(yǎng)詞養(yǎng)細(xì)胞的基 材。作為本發(fā)明實(shí)施方式的一個(gè)實(shí)例，多孔板可用于培養(yǎng)ESC。該板可 以包括由合適材料例如塑料構(gòu)成的底部托盤，其可用于培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞。
20接著，可將ESC培養(yǎng)于位于托盤頂部的多孔膜構(gòu)成的插件。該插件包括 連接或鎖定裝置以確保插件能穩(wěn)定連接于底部托盤。此外，固相支持物 可用作多孔膜基底，如下文所述。因此，多孔膜可位于固相支持物上或 部分位于固相支持物內(nèi)(例如圍繞邊緣)。固相支持物可由任何塑性材料 構(gòu)成，所述材料包括如聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯的聚合物，因此固相25支持物可制成堅(jiān)硬的非延展性平坦表面。
在某些實(shí)施方式中，固相支持物可包括一元設(shè)計(jì)，例如單一的組織 培養(yǎng)孔、盤、板、瓶等等。例如，固相支持物可制成單一組織培養(yǎng)盤，
其包括用于培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞的含單孔的基底和位于該基底頂部或孔內(nèi)的插件，其中所述插件包括適于培養(yǎng)ESC的固相支持物和多孔膜?；蛘撸?相支持物可制成多元裝置。在該實(shí)施方式中，基底可以包括一個(gè)或多個(gè) 適于培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞的孔，而插件可以制成含固相支持物和多孔膜、適于5培養(yǎng)ESC的多孔板。典型地，形成固相支持物以使詞養(yǎng)細(xì)胞位于ESC基 側(cè)，并且ESC頂面暴露于多孔膜頂部。在某些實(shí)施方式中，固相支持物可包括延展性聚合物，例如用于中 空纖維生物反應(yīng)器的纖維素管或乙酸纖維素管。如果該管是多孔的，那 么它可以同時(shí)用作固相支持物和多孔膜。例如，ESC可培養(yǎng)于管的一側(cè)，io而詞養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)于管的對(duì)側(cè)?；蛘撸曫B(yǎng)細(xì)胞和ESC都培養(yǎng)于管周圍毛 細(xì)管外空間中分離的管上。用于本發(fā)明的多孔膜可以包括本領(lǐng)域已知的任何多孔材料。合適的 多孔材料實(shí)例包括但不限于，聚對(duì)苯二甲酸乙二酯、聚合物涂覆纖維(如 Millicel吸)(Millipore Corp.， Billerica， MA)、聚醚砜，聚酰胺、例如瓊脂15糖、纖維素、多糖、聚四氟乙烯、聚砜、聚酯、聚偏二氟乙烯、聚丙烯、 碳氟化合物、例如聚(四氟乙烯-共-全氟(烷基乙烯醚))、聚碳酸酯、聚 乙烯、玻璃、陶瓷、尼龍、以及金屬。 系統(tǒng)本發(fā)明的某些實(shí)施方式提供了體外培養(yǎng)干細(xì)胞的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)可 20以包括固相支持物和與固相支持物以流體連通的多孔膜。固相支持物可 適于培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞，例如胚胎成纖維細(xì)胞。所述系統(tǒng)可包括一種或多種 下列物質(zhì)適于培養(yǎng)ESC的培養(yǎng)基；適于培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基；飼養(yǎng) 細(xì)胞，洗滌緩沖液及用于間接共培養(yǎng)ESC和飼養(yǎng)細(xì)胞的添加劑，例如LIF、 纖連蛋白或其它胞外基質(zhì)蛋白。 25 試劑盒在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明也提供了用于體外培養(yǎng)ESC的試劑盒。 該試劑盒可包括固相支持物；適于制成與固相支持物以流體連通的多孔 膜；至少一種容器；以及ESC培養(yǎng)說明書。任選地，所述試劑盒可含有 用于培養(yǎng)ESC和MEF的不同細(xì)胞培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基可以液體或粉末形 式提供。試劑盒也可包括細(xì)胞培養(yǎng)試劑和添加物，例如谷氨酰胺，必需 氨基酸，等等。添加物也可以液體或粉末形式提供。類似地，試劑盒可5包括一種或多種緩沖液和/或洗滌液。緩沖液和洗滌液也可以液體或粉末 形式提供。試劑盒也可再包括細(xì)胞樣品，例如ESC，飼養(yǎng)細(xì)胞，例如MEF。 細(xì)胞可作為下游應(yīng)用的起始材料，或者將細(xì)胞作為未來實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。細(xì) 胞可以每獨(dú)立容器冷凍提供。固相支持物和多孔膜可以套裝的且容易使 用的預(yù)組裝形式提供，或者它們可以非組裝形式提供，其中非組裝部分10被任選地單獨(dú)包裝。說明書可以一種或多種語言提供，例如英語、法語、 德語、日語等等。實(shí)施例實(shí)施例l:纖連蛋白包被方法15 材料纖連蛋白0.1%溶液(Sigma, St Louis , MO)未處理的原代CF-1品系小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF) (Chemicon, Temecula， C A )MEF培養(yǎng)基DMEM (Invitorgen, Carlsbad, CA) 20 10%胎牛血清(Hyclone Logan, UT)1 %Glutamax-1 (Invitorgen， Carlsbad, CA ) l%PenStrep (Invitorgen, Carlsbad, CA) 1%非必需氨基酸(Sigma, St Louis, MO) DPBS (Hyclone Logan, UT) 25 將纖連蛋白(0.1%溶液)(Sigma，StLouis，MO)于無菌DPBS中稀釋至25嗎/ml。加入DPBS中足夠量的纖連蛋白(25pg/ml)以包被單孔 托盤(約5-10mL/盤)。將托盤在室溫下孵育至少45分鐘。在接種MEF 之前，除去過量的纖連蛋白。將存于-8(TC冰箱的MEF解凍。在37。C水 浴中輕搖MEF瓶。將MEF轉(zhuǎn)移至含10mL預(yù)溫MEF培養(yǎng)基的15mL管 中。將細(xì)胞以1000rpm沉淀4分鐘。除去上清液，將細(xì)胞重懸于新鮮的 預(yù)溫MEF培養(yǎng)基。將纖連蛋白包被的單孔飼養(yǎng)盤用MEF飼養(yǎng)細(xì)胞懸液 5接種。每單孔盤接種1.67 X1(^MEF細(xì)胞，24小時(shí)內(nèi)將產(chǎn)生95°/。融合。 將板蓋上蓋子，37X:孵育過夜。實(shí)施例2:胚胎干細(xì)胞與詞養(yǎng)細(xì)胞間接共培養(yǎng) 所用材料0 Millipore細(xì)胞培養(yǎng)濾板和單孔飼養(yǎng)盤，24孔，有0.4nm PCF膜或l.OpmPE丁膜96孔0.4pm PCF膜(Millipore Corp.， Billerica, MA)ESC培養(yǎng)基去除(Knock out) DMEM (Invitorgen， Carlsbad, CA)20% ES認(rèn)證血清(Invitorgen, Carlsbad, CA) 15 1 %Glutamax-1 (Invitorgen, Carlsbad, CA )l0/oPenStrep (Invitorgen, Carlsbad, CA)1%非必需氨基酸(Sigma, St Louis ， MO)0.1% ESGRO (LIF) (Chemicon, Temecula， CA)0.1% 2-|;充基乙醇(Invitorgen, Carlsbad, CA)MEF培養(yǎng)基DMEM (Invitorgen, Carlsbad, CA) 10%胎牛血清(Hyclone Logan, UT) l%Glutamax-l (Invitorgen, Carlsbad, CA) l%PenStrep (Invitorgen, Carlsbad, CA) 25 1%非必需氨基酸(Sigma, St Louis ， MO)2%明膠溶液(Sigma，StLouis,MO)未處理的原代CF-1品系小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF) (Chemicon,Temecula， CA)絲裂霉素C粉末(Sigma, St Louis , MO) 129/S6鼠胚胎干細(xì)胞(ESC) (Chemicon， Temecula, CA) DPBS (Hyclone Logan, UT) 5 TrypLE Select (IX)，液體(Invitorgen， Carlsbad, CA)堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒(Chemicon, Temecula， CA) 0.1%纖連蛋白溶液(Sigma, St Louis , MO)第1天，將T75培養(yǎng)瓶用10mL 0.1W明膠DPBS液包被，37。C孵育 至少30分鐘。將存于-8(TC冰箱的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)解凍，io在37t水浴中輕搖MEF瓶。將MEF轉(zhuǎn)移至含10mL預(yù)溫MEF培養(yǎng)基的 15mL管中。將細(xì)胞以1000rpm沉淀4分鐘。除去上清液，將細(xì)胞重懸于 新鮮預(yù)溫MEF培養(yǎng)基。接種前從培養(yǎng)瓶去除過量明膠。將培養(yǎng)瓶用MEF 飼養(yǎng)細(xì)胞懸液接種。細(xì)胞37。C孵育過夜。在T75培養(yǎng)瓶中每25mLMEF 培養(yǎng)基用3.75-5 X106MEF細(xì)胞，將在24小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生95°/。的融合。15 第2天，用絲裂霉素C處理MEF飼養(yǎng)細(xì)胞，以有絲分裂去活細(xì)胞。絲裂霉素C用2mg粉狀原料制備。將粉末溶于4 mL無菌H20中以制備 500|ig/mL溶液。MEF培養(yǎng)基所用工作濃度為10^ig/mL。將細(xì)胞37。C孵 育2小時(shí)。去除含絲裂霉素C的MEF培養(yǎng)基，將細(xì)胞用預(yù)溫的DPBS洗 滌3次(T75培養(yǎng)瓶每次洗滌10mL)。將新的胚胎干細(xì)胞(ESC)培養(yǎng)基20加入，37C孵育細(xì)胞直至準(zhǔn)備接種ESC。將存于液氮罐的鼠ESC解凍。 在37""C水浴中輕搖含細(xì)胞的瓶。將ESC轉(zhuǎn)移至含10mL預(yù)溫的ESC培養(yǎng) 基的15mL管中。將細(xì)胞以1000rpm造粒4分鐘。除去上清液，將細(xì)胞 重懸于新鮮的預(yù)溫ESC培養(yǎng)基。將含有絲分裂去活的MEF飼養(yǎng)細(xì)胞層 和ESC培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，用ESC懸液以每30rnL ESC培養(yǎng)基4.5 X106 ESC25細(xì)胞T75培養(yǎng)瓶接種。將細(xì)胞37t:孵育過夜。第3天，用ESC培養(yǎng)基飼養(yǎng)MEF飼養(yǎng)層上的ESC。第4天，用ESC 培養(yǎng)基飼養(yǎng)MEF飼養(yǎng)層上的ESC或者如果需要以1: 2的比例傳代。通
常，允許ESC生長(zhǎng)至20-80。/。融合的密度，然后分取。第4天之后接著是 第5-8天。ESC解凍后，在接種至多孔細(xì)胞培養(yǎng)濾板之前， 一般進(jìn)行2-3 次傳代。第9天，用ESC培養(yǎng)基飼養(yǎng)MEF飼養(yǎng)層上的ESC。將單孔飼養(yǎng)盤 5用纖連蛋白DPBS溶液包被，室溫孵育45分鐘。母液是0.1%纖DPBS 液。加入足量連蛋白(1000jig/mL)。所用工作濃度是25嗎/mL無菌纖連 蛋白DPBS液(25嗎/mL)以包被單孔盤，每個(gè)托盤使用約5-10mL。去除過量纖連蛋白，單孔盤備用。將存于-8(TC冰箱的MEF解凍。在37r水浴中輕搖細(xì)胞瓶。將MEF io轉(zhuǎn)移至含10mL預(yù)溫的MEF培養(yǎng)基的15mL管中。將細(xì)胞以1000rpm造 粒4分鐘。除去上清液，將細(xì)胞重懸于新鮮的預(yù)溫MEF培養(yǎng)基中。將包 被有纖連蛋白的單孔飼養(yǎng)盤用MEF飼養(yǎng)細(xì)胞懸液接種。每單孔盤1.67 X106 MEF細(xì)胞通常可在24小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生95%的融合。將托盤蓋上蓋子， 37'C孵育過夜。15 第10天，根據(jù)下列方案，將ESC和MEF飼養(yǎng)細(xì)胞從T75培養(yǎng)瓶除去。將培養(yǎng)瓶用預(yù)溫的DPBS洗滌2次(每次洗滌10mL)。每次洗漆， 培養(yǎng)瓶應(yīng)靜置1-2分鐘。去除DPBS，每培養(yǎng)瓶加入3mL TrypLE( Irwitorgen， Carisbad，CA)。將培養(yǎng)瓶室溫孵育2-3分鐘。在顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶，當(dāng) 細(xì)胞成球并從培養(yǎng)瓶脫離時(shí)，加入ESC培養(yǎng)基以去活TrypLE(Invitorgen,20 Carlsbad, CA)?；旌门囵B(yǎng)瓶并洗滌，以從培養(yǎng)瓶除去所有細(xì)胞。按下列 方法將ESC從MEF飼養(yǎng)細(xì)胞中分離將ESC/MEF細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新 T75培養(yǎng)瓶，37。C孵育45分鐘；除去未附著細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移至另一新T75 培養(yǎng)瓶，37。C溫育45分鐘；除去未附著細(xì)胞，用ESC懸液接種細(xì)胞培養(yǎng) 濾板孔。將每孔200-500細(xì)胞接種于％孔細(xì)胞培養(yǎng)濾板頂孔的100|il ESC25培養(yǎng)基中。將每孔1000-1500細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)濾板頂孔的400W ESC培養(yǎng)基中。去除單孔盤中的MEF培養(yǎng)基，換為ESC培養(yǎng)基，每盤 使用32mLESC培養(yǎng)基。將接種ESC的細(xì)胞培養(yǎng)濾板加至單孔盤中，將
該裝置37'C溫育過夜。第12天和14天，將ESC和MEF間接共培養(yǎng)物用ESC培養(yǎng)基飼養(yǎng)。 第16天，按制造商說明書，用試劑盒(堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒)(Serologicals Corporation, Norcross,GA)分析ESC的堿性磷酸酶活性。結(jié)果顯示，培養(yǎng)5于多孔膜與飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基有流體連通的ESC未分化(圖2和3)。在培 養(yǎng)基中含LIF (ESGRO ) (Serologicals, Corporation, Norcross, GA)的實(shí)驗(yàn) 中，LIF在測(cè)試ESC擴(kuò)增期間以1000單位/ml的濃度使用，實(shí)驗(yàn)期間也 以該指示的相同濃度(初步擴(kuò)增后)使用。說明書和權(quán)利要求書中所用的所有表示成分?jǐn)?shù)量、反應(yīng)條件等的數(shù)10字，都應(yīng)理解為在該所有情況下用術(shù)語"約"進(jìn)行修飾。因此，除非有 相反指示，說明書和所附權(quán)利要求書中所涉及的數(shù)量參數(shù)都應(yīng)該是近似 值，其可根據(jù)本發(fā)明所獲尋求的期望屬性變化。最少，且無意于限制在 權(quán)利要求書的范圍內(nèi)應(yīng)用等同原則，每數(shù)值參數(shù)應(yīng)該根據(jù)重要數(shù)據(jù)的數(shù) 值和常規(guī)舍入法來解釋。15 在不偏離其精神和范圍的情況下，本發(fā)明可以有許多修飾和變化，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。本文記載的具體實(shí)施方式
只是 以實(shí)施例的方式提供，而不意味著任何方式的限制。應(yīng)該想到，說明書 和實(shí)施例只是例證，本發(fā)明的真實(shí)范圍和精神應(yīng)由下列權(quán)利要求書所指 示。
權(quán)利要求
1、一種體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞(ESC)的方法，包括a)使多孔膜表面與ESC接觸；b)使固相支持物表面與飼養(yǎng)細(xì)胞接觸；c)向ESC提供培養(yǎng)基；d)向飼養(yǎng)細(xì)胞提供培養(yǎng)基，其中多孔膜與d)中的培養(yǎng)基以流體連通。
2、 權(quán)利要求l的方法，其中ESC保持在未分化狀態(tài)。
3、 權(quán)利要求1的方法，其中ESC選自鼠胚胎干細(xì)胞和人胚胎干細(xì)胞。
4、 權(quán)利要求1的方法，其中飼養(yǎng)細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
5、 權(quán)利要求4的方法，其中成纖維細(xì)胞選自鼠成纖維細(xì)胞和人成纖 10維細(xì)胞。
6、 權(quán)利要求5的方法，其中成纖維細(xì)胞是胚胎成纖維細(xì)胞。
7、 權(quán)利要求1的方法，其中ESC培養(yǎng)基包括血清。
8、 權(quán)利要求l的方法，其中ESC培養(yǎng)基任選地包括LIF。
9、 權(quán)利要求1的方法，其中將多孔膜和固相支持物提供于多孔板內(nèi)。
10、權(quán)利要求9的方法，其中多孔板選自6、 12、 48或96孔板。
11、 權(quán)利要求l的方法，其中多孔膜由聚合物組成。
12、 權(quán)利要求ll的方法，其中聚合物選自聚對(duì)苯二甲酸乙二酯、聚 合物涂覆纖維、聚醚砜、聚酰胺、瓊脂糖、纖維素、多糖、聚四氟乙烯、 聚砜、聚酯、聚偏二氟乙烯、聚丙烯、碳氟化合物、例如聚(四氟乙烯- 共-全氟(烷基乙烯醚))、聚碳酸酯、聚乙烯、玻璃、陶瓷、尼龍、以及 金屬。
13、 一種體外培養(yǎng)ESC的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括固相支持物；與固相 支持物以流體連通的多孔膜；以及適于培養(yǎng)ESC的培養(yǎng)基。
14、 權(quán)利要求13的系統(tǒng)，進(jìn)一步包括胚胎成纖維細(xì)胞。
15、權(quán)利要求13的系統(tǒng)，其中將多孔膜和固相支持物提供于多孔板內(nèi)。
16、權(quán)利要求15的系統(tǒng)，其中多孔板選自6、 12、 48或96孔板。
17、 權(quán)利要求13的系統(tǒng)，進(jìn)一步包括ESC。
18、 權(quán)利要求17的系統(tǒng)，其中ESC選自鼠ESC和人ESC。
19、 一種培養(yǎng)ESC的試劑盒，所述試劑盒包括固相支持物；與固相 支持物以流體連通的多孔膜；至少一種容器；以及ESC培養(yǎng)說明書。5
20、權(quán)利要求19的試劑盒，其中將多孔膜和固相支持物提供于多孔板內(nèi)。
21、 在包含一孔或多孔的組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)ESC的方法，其中每孔包括多孔膜插件和與多孔膜插件以流體連通的固相支持物，其中所述方 法包括a)使多孔膜表面與ESC接觸；b)使位于多孔膜插件下方的固相 io支持物表面與胚胎成纖維細(xì)胞接觸；c)向ESC提供培養(yǎng)基；d)向胚胎成 纖維細(xì)胞提供培養(yǎng)基。
22、 權(quán)利要求1的方法，其中培養(yǎng)基不含血清。
全文摘要
本發(fā)明提供了方法、系統(tǒng)、和試劑盒，其用于在體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞，其中所述方法、系統(tǒng)和試劑盒至少部分利用多孔膜插入物與固相支持物，其相互之間通過流體連通。
文檔編號(hào)C12N5/0735GK101126078SQ20071013796
公開日2008年2月20日 申請(qǐng)日期2007年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月26日
發(fā)明者S·D·謝里登, S·吉爾 申請(qǐng)人:米利波爾公司