專利名稱：一種蓋玻片上生長細胞克隆球的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)細胞克隆球的方法，尤其是指一種蓋玻片上生長細 胞克隆球的方法。背暈技術細胞培養(yǎng)是許多生物學、醫(yī)學和藥學研究中的基本步驟，在腫瘤細胞和 干細胞研究中，有時希望在蓋玻片上生長克隆球，以方便后續(xù)研究(后續(xù)研 究例如用抗體標記細胞膜、細胞質，或者細胞核之蛋白質等)。目前細胞克隆 球培養(yǎng)主要在培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿中進行，尚無在蓋玻片上直接生長貼附的細胞 克隆球的方法。發(fā)明內容本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種蓋玻片上生長細胞克隆球的方 法，其能直接在蓋玻片上生長貼附的細胞克隆球。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案 一種蓋玻片上生長細 胞克隆球的方法，包括如下步驟a. 將細胞在有血清培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)；b. 采用胰酶消化步驟a培養(yǎng)的細胞液，制作單細胞懸液；C.將步驟b制得的單細胞懸液移入放置有蓋玻片的多孔培養(yǎng)板，用含 血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)；d. 培養(yǎng)24 48小時后，當細胞貼底后，即棄去原培養(yǎng)基，根據需要而 添加相應的新培養(yǎng)基，并每隔3 5天更換一次此種新培養(yǎng)基；e. 培養(yǎng)10 20天，在蓋玻片上即生長出可明顯觀察到的細胞克隆球， 繼續(xù)培養(yǎng)，直到細胞克隆球的大小達到實驗需要，然后吸除培養(yǎng)基，清洗后 進行存貯處理或直接使用。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明方法簡單實用，由于可直接在蓋玻片上生 長貼附細胞克隆球，從而可滿足相應的使用需求，例如在干細胞理論研究
領域，在蓋玻片上生長細胞克隆球可直接細胞表面抗原鑒定實驗；在新藥開 發(fā)方面，在蓋玻片上生長細胞克隆球可進行藥物篩選實驗。
具體實施方式
本發(fā)明提供一種蓋玻片上生長細胞克隆球的方法，包括如下步驟a. 將細胞在有血清培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)；b. 采用胰酶消化步驟a培養(yǎng)的細胞，制作單細胞懸液；c. 將步驟b制得的單細胞懸液移入放置有蓋玻片的多孔培養(yǎng)板，用含血 清的培養(yǎng)基培養(yǎng)；d. 培養(yǎng)一定時間后， 一般在培養(yǎng)24~48小時后，當細胞貼底后，即棄去 原培養(yǎng)基，添加含有生長因子及/或細胞因子的無血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并每 隔3~5天更換一次此種無血清培養(yǎng)基；e. 培養(yǎng)10~20天，在蓋玻片上即生長出可明顯觀察到的細胞克隆球，繼 續(xù)培養(yǎng)，直到細胞克隆球的大小達到實驗需要，然后吸除培養(yǎng)基，清洗后即 供存貯或直接使用。上述各步驟的操作均在無菌條件下進行。 若要獲得干細胞克隆球，需要用相應的干細胞培養(yǎng)基。 下面以一個實例來進一步對本發(fā)明方法作詳細描述-實例具體培養(yǎng)步驟如下a. 將細胞在有血清培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)；b. 用常規(guī)酶消化培養(yǎng)的細胞液，制作單細胞懸液；c. 將單細胞懸液移入事先放置有圓形蓋玻片的24孔培養(yǎng)板，用含血清的 培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞初始密度為1000-10000個/ml，每孔0.3 0.5ml;d. 培養(yǎng)24 48小時后，當細胞貼底，細胞覆蓋率達到60%以上時，即棄 去原培養(yǎng)基，并添加含有生長因子無血清培養(yǎng)基，3~5天更換一次此種無血清 培養(yǎng)基，在培養(yǎng)腦膠質瘤細胞系U251和IN1612時，添加的無血清培養(yǎng)基含 有的生長因子為bFGF、 EGF兩種，添加量為20~25ug/ml;e. 培養(yǎng)約10~20天，即在蓋玻片上生長出可明顯觀察到的細胞克隆球， 此時，可繼續(xù)培養(yǎng)，直到細胞克隆球的大小達到實驗需要，吸掉培養(yǎng)基， HBSS液清洗3次，即可供存貯或直接使用。當要進行存貯時，先空氣干燥 10-15小時，然后即可將蓋玻片(仍可放在原24孔培養(yǎng)板上)放入-8(TC冰箱 凍存，以供后續(xù)實驗用。若直接用于實驗，則在空氣干燥后即可直接使用， 對于需使用活的細胞克隆球進行實驗時，則不需進行干燥而直接進行后續(xù)實 驗。
權利要求
1、一種蓋玻片上生長細胞克隆球的方法，其特征在于，包括如下步驟a.將細胞在有血清培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)；b.采用胰酶消化步驟a培養(yǎng)的細胞液，制作單細胞懸液；c.將步驟b制得的單細胞懸液移入放置有蓋玻片的多孔培養(yǎng)板，用含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)；d.培養(yǎng)24～48小時后，當細胞貼底后，即棄去原培養(yǎng)基，根據需要而添加相應的新培養(yǎng)基，并每隔3～5天更換一次此種新培養(yǎng)基；e.培養(yǎng)10～20天，在蓋玻片上即生長出可明顯觀察到的細胞克隆球，繼續(xù)培養(yǎng)，直到細胞克隆球的大小達到實驗需要，然后吸除培養(yǎng)基，清洗后進行存貯處理或直接使用。
2、 如權利要求1所述的一種蓋玻片上生長細胞克隆球的方法，其特征在 于步驟d中所添加的新培養(yǎng)基為含有生長因子的無血清培養(yǎng)基。
3、 如權利要求2所述的一種蓋玻片上生長細胞克隆球的方法，其特征在 于步驟d中所添加的含有生長因子的無血清培養(yǎng)基中還添加有細胞因子。
4、 如權利要求1所述的一種蓋玻片上生長細胞克隆球的方法，其特征在 于步驟d中，當培養(yǎng)干細胞克隆球時，添加的新培養(yǎng)基為干細胞培養(yǎng)基。
5、 如權利要求1所述的一種蓋玻片上生長細胞克隆球的方法，其特征在于步驟d中，當培養(yǎng)腫瘤細胞時，添加的新培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。
6、 如權利要求1所述的一種蓋玻片上生長細胞克隆球的方法，其特征在 于步驟e中，吸除培養(yǎng)基后是采用HBSS液清洗3次。
7、 如權利要求2所述的一種蓋玻片上生長細胞克隆球的方法，其特征在 于培養(yǎng)腦膠質瘤細胞系U251和IN1612時，步驟d中添加的無血清培養(yǎng)基 含有的生長因子為bFGF、 EGF，生長因子添加量為20~25ug/ml。
8、 如權利要求1所述的一種蓋玻片上生長細胞克隆球的方法，其特征在 于步驟e中，清洗后，還進行空氣干燥處理，干燥時間為10 15小時，干 燥后即進行存貯或直接使用。
9、 如權利要求1所述的一種蓋玻片上生長細胞克隆球的方法，其特征在 于各步驟的操作均在無菌條件下進行。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蓋玻片上生長細胞克隆球的方法，包括如下步驟a.將細胞在有血清培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)；b.采用胰酶消化步驟a培養(yǎng)的細胞液，制作單細胞懸液；c.將步驟b制得的單細胞懸液移入放置有蓋玻片的多孔培養(yǎng)板，用含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)；d.培養(yǎng)24～48小時后，當細胞貼底后，即棄去原培養(yǎng)基，根據需要而添加相應的新培養(yǎng)基，并每隔3～5天更換一次此種新培養(yǎng)基；e.培養(yǎng)10～20天，在蓋玻片上即生長出可明顯觀察到的細胞克隆球，繼續(xù)培養(yǎng)，直到細胞克隆球的大小達到實驗需要，然后吸除培養(yǎng)基，清洗后進行存貯處理或直接使用。本發(fā)明方法簡單實用，由于可直接在蓋玻片上生長貼附細胞克隆球，從而可滿足相應的使用需求。
文檔編號C12N5/06GK101148655SQ20071007653
公開日2008年3月26日 申請日期2007年8月22日 優(yōu)先權日2007年8月22日
發(fā)明者代建國, 李世敏, 剛 金 申請人:深圳職業(yè)技術學院