專利名稱：：一種發(fā)酵改善三七主要功效成份的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其是設(shè)涉及一種采用微生物方法改善三七藥材主要功效成份(總皂芬)的方法。
背景技術(shù)：
：我國中藥歷史悠久，中藥資源豐富，為保證廣大人民的身體健康起到巨大作用，國際上正越來越意識到中藥在治療和預防疾病中的重要作用。但近幾十年來，我國在中藥現(xiàn)代化方面進展緩慢，主要原因是中藥加工技術(shù)陳舊，中藥中的有效成份不清楚等。近年來新興發(fā)展中藥發(fā)酵制藥技術(shù)是促使中藥資源和微生物資源有效結(jié)合的一個新型研究領(lǐng)域。中藥發(fā)酵制藥技術(shù)是繼承中藥炮制學發(fā)酵法的基礎(chǔ)上，吸取了微生態(tài)學研究成果，結(jié)合現(xiàn)代生物工程的發(fā)酵技術(shù)和目前熱點益生菌研究技術(shù)而形成的高科技中藥制藥新技術(shù)，是從天然的中藥中尋找藥物的新療效，具有很大的研究價值和市場開發(fā)意義。越來越多的研究表明，大部分中藥的有效成份是經(jīng)過人腸道內(nèi)益生菌代謝后才發(fā)揮藥效的，而且研究還發(fā)現(xiàn)部分中藥在腸道內(nèi)轉(zhuǎn)化后反而能促進人體胃腸道內(nèi)有益菌群的增殖，抑制了有害菌的繁殖。該項目開發(fā)出的益生菌中草藥制劑或含中草藥成份的復合益生菌產(chǎn)品不僅在人類疾病的預防和治療上有著很好的應用意義，在促進動物的生長和預防動物疾病上也有著顯著的作用，^i生物發(fā)酵中藥以其獨特的生物多樣性,為發(fā)現(xiàn)新的活性成份和開發(fā)新藥提供了極大的可能和研究價值。中藥發(fā)酵研究開始于20世紀80年代，但大部分研究僅僅限于真菌類自身發(fā)酵，而且是單一的菌發(fā)酵，雖有報道加入中藥，但也僅是將中藥作為菌絲體發(fā)酵的基質(zhì)。90年代初，日本學者小橋恭一發(fā)現(xiàn)中草藥成份如番瀉葉甙，可借助腸道細菌轉(zhuǎn)化為致泄有效成份而起到治療作用的。也有報道，在中藥有效成份與細菌的相互作用過程中，許多苷類、黃酮類、黃酮醇、香豆素類等均經(jīng)過腸道菌進行了化學修飾。另外，哈巴苷是玄參的主要環(huán)烯醚萜成份之一，經(jīng)人體腸道細菌生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生三個主要產(chǎn)物，其中包括一個已知的化合物和兩個新的化合物。因此，細菌尤其是人體胃腸道中益生菌群對中藥活性成份的轉(zhuǎn)化機理、生理活性及其自身生長代謝規(guī)律等都有待進一步深入研究。越來越多的實踐證明中草藥和益生菌在防病促生長方面是相輔相成的。田碧云研究表明阿膠、五味子、枸杞和刺五加等中藥對雙歧桿菌的生長具有促進作用，主要是因為這些中草藥中均含有被雙歧因子作用的多糖，從而促進雙歧桿菌的生長。英榮等在培養(yǎng)基中添加一定濃度的木瓜、括樓、女貞子、郁金等中草藥的浸提液，可明顯地促進光合細菌的生長，主要是因為這些中草藥中含有某些有機酸(蘋果酸、酒石酸等)，均能被光合細菌的一種或幾種利用，為其提供營養(yǎng)成份。此外，中草藥中的有機酸均為弱酸，在培養(yǎng)液中起緩沖作用，加入中草藥浸提液，可使培養(yǎng)液pH值相對穩(wěn)定，有利于光合細菌的生長。科寶中草藥生物飼料是以細菌、放線菌、酵母和絲狀真菌共4類21種微生物為主，將好氧、厭氧和兼性厭氧菌按一定正交比例組合成的發(fā)酵菌體系，輔以中草藥(主要成份為血竭)。其理論依據(jù)就是利用中草藥的活血化疚、益氣養(yǎng)血、滋補強壯、增強營養(yǎng)等功能，為益生菌提供良好的生存環(huán)境，以利于益生菌更好地發(fā)揮作用。中藥發(fā)酵技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)酵工程和傳統(tǒng)中藥炮制加工和益生菌理論的完美結(jié)合，是以生物技術(shù)生產(chǎn)中藥的一個嶄新領(lǐng)域和研究課題。中草藥發(fā)酵制藥具有突出的優(yōu)勢，主要體現(xiàn)在以下幾點一是藥物的有效組分及活性物質(zhì)得到最大限度的提取和利用；二是藥物前體進入人體后不能直接被利用的有效活性組分在微生物的降解下而轉(zhuǎn)化成被直接利用的小分子活性物質(zhì)；三是優(yōu)選的人體有益菌一益生菌系本身具有成為或增強原有藥物的功能；四是中藥發(fā)酵制藥與原有藥物相比產(chǎn)生了新的活性物質(zhì)，從而具有新的保健、預防或治療功能；五是中藥發(fā)酵制藥能很好地節(jié)約藥源，有利于資源保護和可持續(xù)發(fā)展；六是微生物的分解作用有可能將中藥中的有毒物質(zhì)進行分解，從而降低藥物的毒副作用；七是該領(lǐng)域是實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化水平的關(guān)鍵，同時也是研究中藥成份在人體腸道內(nèi)實現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)研究領(lǐng)域?，F(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)三七含有三七總皂苷、黃酮、多糖、三七索等多種有效成份，其中總皂苷為三七中的主要功效成份，其在血液系統(tǒng)、血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)以及抗炎、抗衰老、抗腫瘤等方面都具有生理活性，特別是在心腦血管系統(tǒng)疾病方面的獨特作用，為三七作為醫(yī)療和保健用品的開發(fā)利用提供了重要的科學依據(jù)。三七雖然作為開發(fā)和使用歷史悠久的名貴藥材，但由于開發(fā)應用程度還較低，因此，三七的研究應用大有可為。尤其是開展三七的綜合利用和縱深加工是發(fā)展三七產(chǎn)業(yè)的必然之路。三七中的主要功效成份并沒有得到充分利用，此外三七中還存在潛在的有毒或難以分解的成份，這些給三七主要功能成份提取或人體利用造成極大問題，因此有必要采用微生物方法改善和提高三七中主要成份的提取率，修飾其中主要活性成份，提高其生物利用度。目前國內(nèi)外并無開展三七的微生物轉(zhuǎn)化及其生物利用度研究的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種微生物法轉(zhuǎn)化提高三七中主要功效成份的提取率和生物利用度的方法。本發(fā)明所述的三七為五加科4直物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的根、葉或莖。一種發(fā)酵改善三七主要功效成份的方法，包括(1)將芽孢桿菌LB斜面種子培養(yǎng)24小時后轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基，在37。C、180r/min搖床中培養(yǎng)18~24小時得到培養(yǎng)液；(2)按每克三七添加0.25毫升蒸餾水，將三七與蒸餾水混合，于115。C下滅菌處理15分鐘，得到三七轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基；(3)將步驟(1)得到的培養(yǎng)液無菌接入三七轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，在37。C下對三七進行培養(yǎng)轉(zhuǎn)化48~72小時(4)將轉(zhuǎn)化后的三七置入干燥箱，6(TC干燥至恒重，得到經(jīng)過發(fā)酵轉(zhuǎn)化的三七。所述的芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或納豆芽孢桿菌。所述的三七的根、葉或莖使用時要經(jīng)過粉碎，一般粉碎至4060目。步驟(1)中,培養(yǎng)液內(nèi)菌種細胞的密度為lx108lxl09cfu/ml。步驟(3)中，培養(yǎng)液與三七轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的用量比為培養(yǎng)液的毫升數(shù)三七轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中三七的克數(shù)=1:2~10;優(yōu)選1:5。步驟(3)中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的時間優(yōu)選72小時。經(jīng)過發(fā)酵改善的三七按照常規(guī)溶劑提取法取樣進行總皂苷的提取與測定，以比較和監(jiān)測其主要功效成份的變化。所述的三七總皂苦提取方法為醇提法，主要步驟為取5g經(jīng)過發(fā)酵改善的三七，選用30~50%的乙醇濃度在提取溫度60~80。C和料液比為1:10~20下4是取120~144分鐘，收集濾過液。將濾液在水浴上揮至近干，殘渣用50ml曱醇分次溶解至所需刻度，并放置過夜，精密吸取上清液50Hl于具塞試管中，揮去溶劑，按照改進的分光光度法測定其總皂苷含量變化。所述的改進分光光度法主要包括最大吸收波長的選擇精密稱取于6(TC干燥恒重的三七皂香R16mg,溶解于5ml甲醇中，搖勻。用微量移液器吸取上述溶液20、40、60、80、100、120、140jal，分置具塞試管中，于6(TC水浴中揮去溶劑，加入新配制的5%香草醛~冰醋酸溶液0.2ml,高氯酸0.8ml,于60。C水浴中加熱15min,冰水冷卻，加水醋酸5ml，搖勻，放置15min，在波長400~600nm處測定吸收曲線，曱醇溶液隨行空白對照，發(fā)現(xiàn)在波長408~410nm處存在溶劑的干擾峰，因此選擇500~600進行波譜掃描，結(jié)果在540nm處有最大吸收。故選擇540nm測定吸光度。以吸收度為縱坐標，三七皂苷R1的含量為橫坐標，繪制標準曲線，經(jīng)統(tǒng)計處理求得回歸方程為y=0.0055x~0.0269(r=0.9969)。本發(fā)明采用微生物方法對三七進行生物轉(zhuǎn)化，比轉(zhuǎn)化前三七中主要功效成份含量提高了46倍，提取率液提高了將近兩倍。本發(fā)明的操作流程簡單，微生物細胞培養(yǎng)容易，生物轉(zhuǎn)化易于控制，微生物轉(zhuǎn)化對中藥材主要功效成份的提取具有較大提高作用，本發(fā)明的研究思路和結(jié)果為開發(fā)利用中藥材功能成份提供借鑒，為傳統(tǒng)中藥材的深度開發(fā)和利用提供更好的方法和平臺。圖l為本發(fā)明方法的流程示意圖；具體實施例方式實施例1不同菌種對三七葉的轉(zhuǎn)化效果試驗參見附圖l的流程，采用地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌為菌種分別對三七的葉進行轉(zhuǎn)化，對和轉(zhuǎn)化后的三七葉進行總急苷含量測定和提取，條件及結(jié)果如下各菌種分別在LB培養(yǎng)基中斜面保存，37。C活化24小時，再接種到液體種子培養(yǎng)基上。液體種子培養(yǎng)基為LB,無瓊脂，pH7，液體種子培養(yǎng)在250毫升的搖瓶裝液為25~30毫升，發(fā)酵溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速為180~200r/min，培養(yǎng)12~24小時得到培養(yǎng)液。三七葉粉碎按每克三七添加2毫升蒸餾水后于115"C下滅菌處理15分鐘，得到三七轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基；按每克三七轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基接入0.2毫升培養(yǎng)液，將培養(yǎng)液無菌接入三七轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，在37。C下對三七進行培養(yǎng)轉(zhuǎn)化72小時。對轉(zhuǎn)化后的三七進行總皂苦提取和含量測定，結(jié)果見表1,表l不同菌種轉(zhuǎn)化對三七葉總皂苷含量、提取率的影響及其比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表l中的對照組為未經(jīng)轉(zhuǎn)化的三七葉，可見通過生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化可以明顯提高三七葉總皂苷的含量，其中以枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化能力最為顯著，總皂苷含量達到19毫克/毫升。與對照組相比，通過生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化后三七中總皂苷含量提高4~6倍，而總皂苷提取率也明顯高于對照組。實施例2不同菌種對三七^f艮的轉(zhuǎn)化效果試驗按照實施例l方法，以三七的根為轉(zhuǎn)化對象，進行轉(zhuǎn)化，對轉(zhuǎn)化后的三七葉進行總皂苷含量測定和提取，結(jié)果見表2，表2不同菌種轉(zhuǎn)化對三七根總皂苷含量、提取率的影響及其比較外A仏翁她干急總急芬含總急苦提取率％付率％里(mg/ml)(mg/1OOg二七葉)地衣芽孢桿菌356.97.8枯草芽孢桿菌324.55.9納豆芽孢桿菌295.16.2對照261.63.6表2中的對照組為未經(jīng)轉(zhuǎn)化的三七根，可見通過生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化可以明顯提高三七根總皂苷的含量，其中以地衣芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化能力最為顯著，總皂苷含量達到5.9毫克/毫升。與對照組相比，三種微生物72小時轉(zhuǎn)化后總皂苷含量提高3~4倍，而總皂苷提取率也明顯高于對照組，比較實施例1不難發(fā)現(xiàn)，無論是否轉(zhuǎn)化三七根中的總皂苷含量要顯著低于三七葉。實施例3不同轉(zhuǎn)化時間對三七葉的轉(zhuǎn)化效果試驗按照實施例l方法，只采用枯草芽孢桿菌為菌種，以三七的葉為轉(zhuǎn)化對象，進行轉(zhuǎn)化，對轉(zhuǎn)化不同時間后的三七葉進行總皂苷含量測定和提取，結(jié)果見表3，表3不同轉(zhuǎn)化時間對三七葉總皂普含量、提取率的影響轉(zhuǎn)化時間(小時)干急總急甘^^得率。/。量(mg/ml)總皂苷提取率％(mg/100g三七葉)482110.55.8724918.611.4965119.112.11204619.613.2的含量，其中以72小時轉(zhuǎn)化對總皂苷含量、總皂苷提取率的提高影響最為顯著，而72小時后變化不是^f艮大。實施例4不同接種比例對三七葉的轉(zhuǎn)化效果試驗按照實施例1的方法培養(yǎng)獲得細胞，采用枯草芽孢桿菌為催化的微生物，以三七葉為轉(zhuǎn)化對象，按照不同接種比例將培養(yǎng)液接入三七轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中進行轉(zhuǎn)化，對轉(zhuǎn)化后的三七葉進行總皂苷含量測定和提取，結(jié)果見表4,表4不同接種比例對三七葉總皂芬含量、提取率的影響培養(yǎng)液體積(毫升)-三干皂總皂苷含總皂苷提取率％七葉重量(克)得率％量(mg/ml)(mg/100g三七葉)1:242.116.19.21:449.617.610.41:554.221.413.11:85118.813.91:1045.718.113.2每毫升培養(yǎng)液中含有菌種細胞lxl08cfli表4中可以看出采用1:5的接種比例對于三七葉的轉(zhuǎn)化極為有效，其中總皂苷含量和干皂得率要顯著好于其它組，總皂苷提取率也是1:5的的接種比例時升高更快速，因此選取1:5接種比例進行轉(zhuǎn)化更有利于三七葉中總皂苷的提取和含量提高。權(quán)利要求1、一種發(fā)酵改善三七主要功效成份的方法，其特征在于，包括(1)將芽孢桿菌LB斜面種子培養(yǎng)24小時后轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基，在37℃、180r/min搖床中培養(yǎng)18～24小時得到培養(yǎng)液；(2)按每克三七添加0.2～5毫升蒸餾水，將三七與蒸餾水混合，于115℃下滅菌處理15分鐘，得到三七轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基；(3)將步驟(1)得到的培養(yǎng)液無菌接入三七轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，在37℃下對三七進行培養(yǎng)轉(zhuǎn)化48～72小時；(4)將轉(zhuǎn)化后的三七置入干燥箱，60℃干燥至恒重，得到經(jīng)過發(fā)酵改善的三七。2、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或納豆芽孢桿菌。3、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的三七為五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的才艮、葉或莖。4、如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的三七的根、葉或莖使用前經(jīng)過粉碎至40~60目。5、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于步驟(l)中，培養(yǎng)液內(nèi)菌種細胞的密度為lxl08~lxl09cfb/ml。6、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于步驟(3)中，培養(yǎng)液與三七轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的用量比為培養(yǎng)液的毫升數(shù)三七轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中三七的克數(shù)-l:2~10。7、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于步驟(3)中，培養(yǎng)液與三七轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的用量比為培養(yǎng)液的毫升數(shù)三七轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中三七的克數(shù)=1:5。8、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于步驟(3)中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的時間為72小時。全文摘要本發(fā)明公開了一種發(fā)酵改善三七主要功效成份的方法，包括(1)將芽孢桿菌LB斜面種子培養(yǎng)24小時后轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)得到培養(yǎng)液；(2)將三七與蒸餾水混合，滅菌處理得到三七轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基；(3)將步驟(1)得到的培養(yǎng)液無菌接入三七轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，對三七進行培養(yǎng)轉(zhuǎn)化(4)將轉(zhuǎn)化后的三七干燥至恒重，得到經(jīng)過發(fā)酵改善的三七。本發(fā)明采用微生物方法對三七進行生物轉(zhuǎn)化，比轉(zhuǎn)化前三七中主要功效成份含量提高了4～6倍，提取率液提高了將近兩倍。為傳統(tǒng)中藥材的深度開發(fā)和利用提供更好的方法和平臺。文檔編號C12R1/07GK101095710SQ200710069988公開日2008年1月2日申請日期2007年7月11日優(yōu)先權(quán)日2007年7月11日發(fā)明者何國慶,章海鋒,暉阮,陳啟和,云項申請人:浙江大學