專利名稱：一種外源基因在球蟲類原蟲——隱孢子蟲體內(nèi)表達的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種外源基因在球蟲類原蟲——隱孢子蟲體內(nèi)表達的 轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
球蟲類原蟲——隱孢子蟲是一種重要的人獸共患原蟲，該蟲宿主范圍 廣，感染率高，且危害嚴(yán)重，雖經(jīng)多年研究，但迄今尚無理想的防治辦法， 究其原因就是缺乏研究隱孢子蟲細(xì)胞和分子生物學(xué)的適宜的基因轉(zhuǎn)染載 體系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種以球蟲類原蟲——隱孢子蟲病毒為轉(zhuǎn)染載體和以 DNA為轉(zhuǎn)染載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，為研究球蟲類原蟲的分子生物學(xué)和細(xì)胞生 物學(xué)提供了轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。該轉(zhuǎn)染系統(tǒng)含有多克隆酶切位點，使用方便，可將多種外源基因轉(zhuǎn)入 隱孢子蟲體內(nèi)，進行隱孢子蟲的基因表達調(diào)控及生化代謝等研究。本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下利用隱孢子蟲病毒RNA或含隱孢子蟲的基因啟動子的DNA作轉(zhuǎn)染 載體，在隱孢子蟲體內(nèi)進行外源基因的表達。包括用以隱孢子蟲病毒RNA 為載體和以DNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。1、以隱孢子蟲病毒RNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)分別將含外源基因和多克隆酶切位點的基因替換隱孢子蟲L-dsRNA 或S-dsRNA的部分編碼區(qū)，并分別在5'外編碼區(qū)前端加入T7啟動子，后 用RNA聚合酶進行體外轉(zhuǎn)錄，后將其轉(zhuǎn)錄體電穿孔至隱孢子蟲子孢子或卵囊體內(nèi)進行外源基因的表達。2、以DNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)分別將裝在質(zhì)粒載體上的隱孢子蟲L,dsRNA或S-dsRNA病毒全長 cDNA(附圖l-l， 2: L,dsRNA1783bp或S-dsRNA 1375bp)的5'外編碼 區(qū)前連接隱孢子蟲基因的啟動子和信號肽基因，將含外源基因和多克隆酶 切位點的基因替換L,dsRNA或S-dsRNA的部分編碼區(qū)，構(gòu)建含外源基因 的重組質(zhì)粒，然后分別將該質(zhì)粒電穿孔至隱孢子蟲體內(nèi)表達外源基因。 微小隱孢子蟲病毒基因組L-dsRNA全長cDNA序列表。 微小隱孢子蟲病毒基因組S-dsRNA全長cDNA序列表。 本發(fā)明的積極效果在于球蟲類原蟲——隱孢子蟲病毒基因組小、穩(wěn) 定、感染率高，每個細(xì)胞可達5xl03，而且隱孢子蟲為真核生物，外源基 因在隱孢子蟲體內(nèi)表達出的蛋白具有活性。該轉(zhuǎn)染系統(tǒng)含有多克隆位點， 為通用型轉(zhuǎn)染載體，多種外源基因可在隱孢子蟲體內(nèi)表達，為研究球蟲類 原蟲的分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)提供了轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。


圖l、以微小隱孢子蟲病毒RNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)； a: L-dsRNA全長1783bp b:S-dsRNA全長1375bpc:微小隱孢子蟲病毒L-dsRNA轉(zhuǎn)染載體構(gòu)建方式d:微小隱孢子蟲病毒S-dsRNA轉(zhuǎn)染載體構(gòu)建方式 圖2、 ppoly2/sfinotcpvGFP重組質(zhì)粒構(gòu)建圖。 圖3、隱孢子蟲病毒體外轉(zhuǎn)錄體轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡檢測結(jié)果。
具體實施例方式為了便于理解本發(fā)明，特例舉以下實施例。其作用被理解為是對本 發(fā)明的闡釋而非對本發(fā)明的任何形式的限制。實施例l以隱孢子蟲病毒RNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)如圖l-a,b,c,d所示，根據(jù)CPV基因組L-dsRNA與S-dsRNA的序列特征， 將綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因替換L-dsRNA與 S-dsRNA的部分編碼區(qū)，構(gòu)建CPV與GFP的嵌合體。對CPVL-dsRNA與 S-dsRNA運用PCR反應(yīng)將T7啟動子分別弓|入到CPV L-dsRNA與S-dsRNA cDNA的5'端前，運用PCR方法擴增出CPVL的5'端489bp (包括5'端UTRs 與部分編碼區(qū))、3'端548bp， GFP編碼區(qū)702bp， CPVS的5'端459bp (包 括5'端UTRs與部分編碼區(qū))、3'端293bp五個片段，分別構(gòu)建CPVL與GFP 和CPVS與GFP的嵌合體，并分別克隆入載體pPoylI/sfinot，得重組質(zhì)粒酶切線性化后，用凝膠回收試劑盒回收、定量。取約1.5嗎線性化質(zhì)粒作為模板，應(yīng)用T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System進行體外轉(zhuǎn)錄。將線性化質(zhì)粒pCPVL489/GFP/pCPVL548體外轉(zhuǎn)錄體RNA(200嗎)、線性化質(zhì)粒pCPVS459/GFP/pCPVS293體外轉(zhuǎn)錄體RNA(200嗎)、pCPVL489/GFP/pCPVL548與pCPVS459/GFP/pCPVS293體外轉(zhuǎn)錄體混合物RNA (各200嗎)。分別加入微小隱孢子蟲卵囊液中，以電壓(3000V/cm)、脈沖時間(8ms)進行電擊反應(yīng)。之后分別冰浴15min，離心沉淀后，力Plml脫囊液，于37"C溫箱中作用90min。之后洗去脫囊液，用PBS懸浮沉淀，置5MC02 37"C溫箱中孵育18h后，在藍熒光激發(fā)條件下，三種情況都有卵囊及子孢子發(fā)出綠色熒光。說明可以利用微小隱孢子蟲病毒作為一種轉(zhuǎn)染載體，攜帶外源基因在其體內(nèi)表達。 實施例2以DNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)如圖2所示，首先克隆球蟲類原蟲——隱孢子蟲a -tubulin promotor(a-微管啟動子)基因并進行全序列分析；在應(yīng)用PCR技術(shù)擴增并克隆 球蟲類原蟲——隱孢子蟲a -微管基因啟動子序列和多聚poly(A)信號與 GFP，引入多克隆酶切位點(MCS)，并利用MCS分別將綠色熒光蛋白(GFP)插入a-微管基因啟動子與信號肽之間，克隆入載體，構(gòu)建GFP 表達盒pa-微管/GFP/信號肽，電穿孔法(以電壓(3000V/cm)、脈沖時 間(8ms))導(dǎo)入球蟲類原蟲——隱孢子蟲，后熒光顯微鏡檢測到了GFP的 表達，確定其轉(zhuǎn)錄活性；線性化后轉(zhuǎn)染球蟲類原蟲——隱孢子蟲，通過篩 選及核酸鑒定，在球蟲類原蟲——隱孢子蟲體內(nèi)穩(wěn)定表達了綠色熒光蛋 白，構(gòu)建球蟲類原蟲——隱孢子蟲穩(wěn)定DNA轉(zhuǎn)染載體，建立了球蟲類原 蟲——隱孢子蟲DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法。微小隱孢子蟲病毒基因組L-dsRNA全長cDNA序列表1 61121' 181421 481 541781 8411141 1201 '1321 1381 1441' 1501' 15611681 '1741 CGGCCACATGTTACCCAAGACCGGCAGGGTCCGAGGGAAGCCT微小隱孢子蟲病毒基因組S-dsRNA全長cDNA序列表
權(quán)利要求
1、一種外源基因在球蟲類原蟲——隱孢子蟲體內(nèi)表達的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，其特征在于利用隱孢子蟲病毒RNA或含隱孢子蟲的基因啟動子的DNA作轉(zhuǎn)染載體，在隱孢子蟲體內(nèi)進行外源基因的表達，包括用以隱孢子蟲病毒RNA為載體和以DNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。
2、 一種以隱孢子蟲病毒RNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，其特征在于分 別將含外源基因和多克隆酶切位點的基因替換隱孢子蟲L-dsRNA或 S-dsRNA的部分編碼區(qū)，并分別在5'外編碼區(qū)前端加入T7啟動子，后用 RNA聚合酶進行體外轉(zhuǎn)錄，后將其轉(zhuǎn)錄體電穿孔至隱孢子蟲子孢子或卵 囊體內(nèi)進行外源基因的表達。
3、 一種以DNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，其特征在于分別將裝在質(zhì)粒 載體上的隱孢子蟲L,dsRNA或S-dsRNA病毒全長cDNA的5'外編碼區(qū) 前連接隱孢子蟲基因的啟動子和信號肽基因，將含外源基因和多克隆酶切 位點的基因替換L,dsRNA或S-dsRNA的部分編碼區(qū)，構(gòu)建含外源基因的 重組質(zhì)粒，然后分別將該質(zhì)粒電穿孔至隱孢子蟲體內(nèi)表達外源基因。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種以球蟲類原蟲——隱孢子蟲病毒為轉(zhuǎn)染載體和以DNA為轉(zhuǎn)染載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。利用隱孢子蟲病毒RNA或含隱孢子蟲的基因啟動子的DNA作轉(zhuǎn)染載體，在隱孢子蟲體內(nèi)進行外源基因的表達。包括用以隱孢子蟲病毒RNA為載體和以DNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。球蟲類原蟲——隱孢子蟲病毒基因組小、穩(wěn)定、感染率高，每個細(xì)胞可達5×10³，而且隱孢子蟲為真核生物，外源基因在隱孢子蟲體內(nèi)表達出的蛋白具有活性。該轉(zhuǎn)染系統(tǒng)含有多克隆位點，為通用型轉(zhuǎn)染載體，多種外源基因可在隱孢子蟲體內(nèi)表達，為研究球蟲類原蟲的分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)提供了轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。
文檔編號C12N15/09GK101235371SQ20071005637
公開日2008年8月6日 申請日期2007年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日
發(fā)明者于新友, 宮鵬濤, 張西臣, 李建華, 舉 楊 申請人:吉林大學(xué)