專利名稱：：一種熒光標記探針的pcr-ldr基因多態(tài)性檢測測序方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物技術，具體涉及一種熒光標記探針的PCR-LDR基因多態(tài)性檢測測序方法。
背景技術：
：隨著人類藥物基因組學的發(fā)展，越來越多的研究成果將運用于臨床診斷中，這就要求有大規(guī)模的基因多態(tài)性位點檢測方法。近年來，將連接反應用于檢測基因多態(tài)性位點越來越引起人們的重視，學者們已經(jīng)做了大量的研究(FranceBaranyetal.，Proc.Nat，lAcad.Sci.USA,88:189-93(1991)，TheLigaseChainReaction(LCR)inaPCR^World,PCRMethodsandApplications,1:5-16(1991))。連接酶鏈式反應(ligasechainreaction,LCR)是指在反應中設計兩對探針，使連接反應可以指數(shù)擴增模板。連接酶檢測反應(ligasedetectionreaction,LDR)是在反應中僅加入一對探針，模板被線性擴增。目前，出現(xiàn)了將LDR技術和PCR技術關聯(lián)使用，以及LDR技術、PCR技術和基因芯片技術、測序技術關聯(lián)用于基因多態(tài)性位點檢測(NormanP.Gerry1etal.，J.Mol.Biol.(1999)292,251-262，U.S.Pat-Pub.No.2003/0032016A1),這些技術的出現(xiàn)大大方便了基因位點的檢測，但在這些技術中，需要大量的熒光標記的探針，而這些標記的探針成本昂貴，為開發(fā)和應用造成不便，因而，限制了它們的應用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術問題在于克服上述不足之處，研究設計簡便的PCR-LDR基因多態(tài)性測序檢測方法。本發(fā)明提供了一種熒光標記探針的PCR-LDR基因多態(tài)性測序檢測方法。由于基因多態(tài)性包括單位點基因突變、基因缺失、插入以及微衛(wèi)星等多種情況，本發(fā)明所述的基因多態(tài)性位點檢測主要是針對基因單位點突變，即單堿基突變、插入和缺失，并且在突變位點周圍大約20個堿基內(nèi)沒有其他單位點突變。利用本發(fā)明提供的一種熒光標記探針，在PCR和LDR關聯(lián)利用測序儀進行基因多態(tài)性位點檢測時，針對每一個突變位點，涉及到二種探針第一種探針是標記探針，包含三個部分，其中一部分為和模板配對部分，另一部分為和連接模板配對部分，同時在兩部分序列中引入隨機探針來調整探針的長度；第二種探針為檢測探針，包含兩個部分，其中一部分為和模板配對部分，另一部分則引入隨機序列來調整LDR產(chǎn)物的長度。其中第二種探針，可以是兩根也可以是三根或者四根，探針中3'端為檢測位點。每組針對核酸單堿基變化的檢測探針，通過設定檢測探針的長度，實現(xiàn)不同的核酸堿基對應不同的LDR產(chǎn)物長度。本發(fā)明主要是針對第一種標記探針進行改造，首先弓1入一個通用熒光標記探針和一個通用模板，通用模板部分的5'序列和通用熒光標記探針序列互補，而在上述第一種標記探針中也有部分序列是和通用模板互補的序列，在LDR過程中，通過通用模板的互補配對，實現(xiàn)通用熒光標記探針和標記探針的連接，實現(xiàn)對標記探針的標記。LDR反應結束后，將LDR產(chǎn)物放入測序儀，利用測序儀的genescan功能，通過結果中已知分子量的一系列內(nèi)參來確認不同LDR產(chǎn)物的長度，從而判讀位點的多態(tài)性。本發(fā)明PCR-LDR關聯(lián)的單位點多態(tài)性測序檢測，經(jīng)過適當調整，也可以用于HPLC和微流芯片等高分辨率的核酸分離檢測系統(tǒng)。具體的說，本發(fā)明方法包括以下步驟1.探針設計(1)針對檢測的位點，設計一系列LDR產(chǎn)物的分子量系列，LDR產(chǎn)物的差異可從一個堿基到幾百個堿基；(2)設計一個專有熒光標記探針，該探針具有極高的特異性，與已知生物的序列無同源性；(3)設計一個專有模板，該模板具有極高的特異性，與已知生物的序列無同源性；(4)在要檢測的突變位點的前后各設計10-25堿基長度的檢測探針和標記探針，檢測探針的檢測位點設計在3'端；(5)在標記探針的3'端引入模板配對序列和隨機序列，以及檢測探針5'端引入隨機序列(與PCR產(chǎn)物的序列沒有同源性的任何序列)，一般標記探針和檢測探針具有相近的分子量。2.PCR取待檢測的DNAlpl(5ng/|il)以上，PCR引物各10-30pmol，高溫聚合酶，高溫聚合酶的相應混合液，相互混合。PCR反應條件為94°C30秒，40-68°C30秒-2分鐘，60-72°C45秒國2分鐘，循環(huán)25-40次。3.LDR取PCR產(chǎn)物lpl，探針各40fmol-10pmo1，連接酶，相應的連接酶緩沖液，相互混合。LDR反應條件為94°C30秒，40-70°C1-10分鐘(以45-60。C為最好)，循環(huán)l-40次。4.結果檢測取LDR產(chǎn)物l-5pl，混合測序系統(tǒng)的loadingbuffer,測序儀上樣，進行LDR產(chǎn)物分離鑒定。步驟(一)(3)在標記探針的3'端引入模板配對序列和隨機序列以及檢測探針5'端引入隨機序列，所述隨機序列為與PCR產(chǎn)物的序列沒有同源性的任何序列。步驟(一)(4)在要檢測的突變位點的前后各設計10-25堿基長度的檢測探針和標記探針，標記探針檢測位點設計在3，端，檢測探針的檢測位點設計在5'端。標記探針和檢測探針具有相近的分子量。(一)(4)所述一般標記探針包含三個部分，第一部分為和目的模板配對部分，第二部分為和連接模板配對部分，第三部分為同時在第一和第二部分序列中引入的隨機序列，用來調整探針的長度，長度為40-80bp;所述檢測探針包含兩個部分，第一部分為和目的模板配對部分，第二部分為引入的隨機序列，用來調整LDR產(chǎn)物的長度，長度為40-80bp;檢測探針可以是兩根、三根或四根，探針中3'端為檢測位點，每組針對核酸單堿基變化的檢測探針，通過設定檢測探針的長度，實現(xiàn)不同的核酸堿基對應不同的LDR產(chǎn)物長度。本發(fā)明有以下效果1.由于測序結果的直接性，解決了結果的假陽性和假陰性問題。2.測序平臺的樣本高通量性，可同時進行上百例樣本的檢測，而芯片技術則無法同時進行多樣本的檢測。3.位點的高通量，利用測序儀的5色熒光檢測系統(tǒng)，同時利用4種熒光，測序儀系統(tǒng)也可同時進行一百多個位點的檢測。大大加速檢測的速度。4.與現(xiàn)有基因多態(tài)性位點檢測及測序技術相比，大幅降低了應用成本，并且檢測結果正確。圖l-2是HBV1896突變檢測結果圖。圖1的結果表示只有82bp的連接產(chǎn)物，即只有HBV1896的野生型。圖2的結果表示有82bp和87bp的連接產(chǎn)物，既有HBV1896野生型也有HBV1896突變型。圖3-4表示HBV1896和HBV的YIDD/YVDD的聯(lián)合檢測結果。圖3有82bp和92bp兩個連接產(chǎn)物，表示HBV1896檢測結果是只有野生型產(chǎn)物，HBV的YIDD/YVDD檢測結果是只有YIDD產(chǎn)物。圖4有82bp、92bp和97bp的連接產(chǎn)物，表示HBV1896檢測結果只有野生型產(chǎn)物，HBV的YIDD/YVDD的檢測結果是既有YIDD產(chǎn)物也有YVDD突變產(chǎn)物。圖5-7表示對5個SNP位點rs4652678、rsl99930、rs7043268、rs6424820和rs4133072進行聯(lián)合檢測的結果。圖5的結果表示rs4652678有82bp和87bp兩個連接產(chǎn)物，是雜合子C/T;rsl99930有92bp的連接產(chǎn)物，是純合子C;rs7043268有102bp和107bp兩個連接產(chǎn)物，是雜合子G/A;rs6424820有112bp和117bp兩個連接產(chǎn)物，是雜合子C/G;rs4133072有122bp的連接產(chǎn)物，是純合子A。圖6的結果表示rs4652678有82bp連接產(chǎn)物，是純合子C;rsl99930有92bp的連接產(chǎn)物，是純合子C;rs7043268有107bp連接產(chǎn)物，是純合子A;rs6424820有117bp連接產(chǎn)物，是純合子G;rs4133072有122bp的連接產(chǎn)物，是純合子A。圖7的結果表示rs4652678有82bp和87bp兩個連接產(chǎn)物，是雜合子C/T;rsl99930有92bp的連接產(chǎn)物，是純合子C;rs7043268有102bp連接產(chǎn)物，是純合子G;rs6424820有112bp連接產(chǎn)物，是純合子C;rs4133072有122bp的連接產(chǎn)物，是純合子A。圖8-10表示6個SNP位點rs348475、rs499776、rs2161811、rs561712、rs4646580和rs4646642聯(lián)合檢測的結果。圖8的結果表示rs348475有82bp和85bp兩個連接產(chǎn)物，是雜合子A/G;rs499776有91bp的連接產(chǎn)物，是純合子G;rs2161811有94bp連接產(chǎn)物，是純合子A;rs561712有100bp連接產(chǎn)物，是純合子A;rs4646580有106bp和109bp兩個連接產(chǎn)物，是雜合子C/T;rs4646642有112bp和115bp兩個連接產(chǎn)物，是雜合子C/T。圖9的結果表示rs348475有82bp和85bp兩個連接產(chǎn)物，是雜合子A/G;rs499776有88bp和91bp的連接產(chǎn)物，是雜合子A/G;rs2161811有94bp連接產(chǎn)物，是純合子A;rs561712有100bp和103bp兩個連接產(chǎn)物，是雜合子A/G;rs4646580有106bp和109bp兩個連接產(chǎn)物，是雜合子C/T;rs4646642有112bp和115bp兩個連接產(chǎn)物，是雜合子C/T。圖10的結果表示rs348475有85bp連接產(chǎn)物，是純合子A/G;rs499776有91bp連接產(chǎn)物，是純合子G;rs2161811有94bp連接產(chǎn)物，是純合子A;rs561712有100bp連接產(chǎn)物，是純合子A;rs4646580有109bp連接產(chǎn)物，是純合子T;rs4646642有115bp的連接產(chǎn)物，是純合子T。具體實施方式下面結合本專利實施例及其附圖對本發(fā)明做進一步的說明。實施例一對單位點突變的DNA多態(tài)性進行檢測以乙型肝炎病毒(HBV)DNA1896位點突變舉例，突變位點間隔是5個堿基。HBV1896位點附近序列為<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>反應混合液為200pMdATP，200|liMdTTP，200|aMdCTP，200pMdGTP，2mMMgCl2，2UTaqDNA聚合酶，各lpM的上下游引物，lpl基因組模板(濃度大于5ng^1)。反應條件為94"30秒，60°C30秒，72"45秒，循環(huán)30次。3.LDR反應反應混合液為20mMTris-HCl，pH8.3(at25。C)，50mMKCl，10mMMgCl2，lmMEDTA，lmMNAD+，10mMDTT，0.1%(v/v)TritonX-IOO，探針各0.01pM，Taq連接酶15U，l^ilPCR模板DNA。反應條件為94°C30秒，60°C2分鐘，循環(huán)30次。4.上測序儀器進行檢測結果見圖，圖1顯示只有1896G野生型病毒株，圖2顯示不僅有1896G野生型病毒株，還有1896A突變型病毒株。實施例二對兩個點突變的DNA多態(tài)性進行檢測以HBV1896位點和YIDD/YMDD突變?yōu)槔龑挝稽cDNA多態(tài)性進行檢測，每個突變位點間隔是5個堿基。HBV1896突變5，GCTGTGCCTTGGGTGGCTTTG/AGGGCATGGACATTGACCCG3，HBV的YIDD/YMDD突變5，CTGTCTGGCTTTCAGTTATATG/TGATGATGTGGTATTGGGGG3'1.引物和探針設計(1)普通PCR引物設計<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>下游引物ACACAGAATAGCTTGCCTGAGTGCTGTATG30HBVYIDD/YMDD弓1物序列(5'—3')長度(nt)上游引物CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC30下游引物GG(CT)A(AT)AAAGGGACTCA(AC)GATG30(2)熒光標記探針GCATCACTCAGAGGG模板CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG熒光標記探針要進行5，磷酸化和3'探針標記(本例用FAM)。(3)標記探針探針名稱HBV1896(G/A)標記探針序列(5'—3')長度(nt)和模板配對部分AAAGCCACCCAAGGCACA18和通用模板配對部分CGCAAACCTGTACTC15隨機序列ACCTACCT8探針總序列*AAAGCCACCCAAGGCACAACCTACCTCGCAAACCTGTACTC41探針名稱HBVYIDD/YMDD(G/T)標記探針序列(5'^3')長度(nt)和模板配對部分ATATAACTGAAAGCCAAACAG22和通用模板配對部分CGCAAACCTGTACTC15隨機序列ACCTACCTA9探針總序列*ATATAACTGAAAGCCAAACAGACCTACCTACGCAAACCTGTACTC46注*表示探針要進行5'磷酸化(4)檢測探針一探針名稱HBV1896—G探針序列(5，~3')長度(nt)和模板配對部分GGTCAATGTCCATGCCCC19隨機序列ACCTACCTACCTACCTACCTA22探針總序列GGTCAATGTCCATGCCCCACCTACCTACCTACCTACCTAC41探針名稱HBVYIDD/YMDD—G探針序列(5'—3')長度(nt)和模板配對部分GCCCCCAATACCACATCATCC22隨機序列ACCTACCTACCTACCTACCTACC24探針總序列ACCTACCTACCTACCTACCTACCGCCCCCAATACCACATCATCC4613(5)檢測探針二<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.PCR反應反應混合液為200|iMdATP，200pMdTTP，200|aMdCTP，200|iMdGTP，2mMMgCl2，2UTaqDNA聚合酶，各lpM的上下游引物，基因組模板(濃度大于5ng/nl)。反應條件為94°C30秒，60°C30秒，72°C45秒，循環(huán)30次。3.LDR反應反應混合液為20mMTris-HCl，pH8.3(at25。C)，50mMKCl，10mMMgCl2，lmMEDTA，lmMNAD+，10mMDTT，0.1%(v/v)TritonX-IOO，探針各0.01iiM，Taq連接酶15U，PCR模板DNA。反應條件為94"C30秒，6(TC2分鐘，循環(huán)30次。4.上測序儀器進行檢測結果見圖3-4。實施例三對人基因組多個位點(SNP)同時進行多態(tài)性檢測同時對5個SNP位點(rs4652678、rsl99930、rs7043268、rs6424820和rs4133072)進行SNP分型，每個SNP突變位點間隔是5個堿基。1.引物和探針設計(1)普通PCR引物設計rs4652678引物序列(5，43，)長度(nt)上游引物CTTCTGTAGAATGAGGTATAGTGAGGAGGC30下游引物GTCAGCAGAGCCCAGATAATGTTGTCGTAG30rsl99930引物序列(5，~>3，)長度(nt)上游引物GAGGGCTGGCAGGAGATTATGCTGTCATGC30下游引物GGTAAAAGCACAATGTTGCTCACCAAGAAG30rs7043268引物序列(5'—3')長度(nt)上游引物CTCTGGATTTGACATTGCTTTTCAGGAGTG30下游引物TTAGTGAGAGGGATCAGGAAACCAAGGAAG30rs6424820引物序列(5'卄3，)長度(nt)上游引物AGGACGGGACCTGATGTAGTGTGAACAGTC30下游引物ACCTCCTCCCACACTGGCACCAACACACCA30rs4133072引物序列(5，—3，)長度(nt)上游引物AAGAACTGTAACAACAAAGCAGCAATATGA30下游引物CGATGGAAAATGTTTTACAAAATGGAAGAC30(2)熒光標記探針GCATCACTCAGAGGG模板CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG熒光標記探針要進行5'磷酸化和3'探針標記(本例用FAM)。(3)標記探針探針名稱rs4652678(C/T)標記探針序列(5，~>3，)長度(nt)和模板配對部分CTACATAGTTGCCTCTAAAAC20和通用模板配對部分CGCAAACCTGTACTC15隨機序列GTACGT6探針總序列*CTACATAGTTGCCTCTAAAACGTACGTCGCAAACCTGTACTC41探針名稱rsl99930(C/T)標記探針序列(5'—3')長度(nt)和模板配對部分TTCTCGTTCTGCCCTGATGGTGCGG25和通用模板配對部分CGCAAACCTGTACTC15隨機序列GTACGT6探針總序列*TTCTCGTTCTGCCCTGATGGTGCGGGTACGTCGCAAACCTGTAC46<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注*表示探針要進行5'磷酸化(4)檢測探針一<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage159</column></row><table>TCAATATGTACTTC探針名稱rs4133072—G探針序列(5，—3，)長度(nt)和模板配對部分TCAACTACAGTATCTAGAACAGTGAC25隨機序列GTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACG41探針總序列GTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTCAACTACAGTATCTAGAACAGTGAC662.PCR反應反應混合液為200^iMdATP，200jiMdTTP，200|liMdCTP，200|iMdGTP，2mMMgCl2，2UTaqDNA聚合酶，各lpM的上下游引物，基因組模板(濃度大于5ng/pl)。反應條件為94°C30秒，56°C30秒，72'C45秒，循環(huán)30次。3.LDR反應反應混合液為20mMTris-HCl，pH8.3(at25。C)，50mMKCl，10mMMgCl2，lmMEDTA，lmMNAD+，10mMDTT，0.1%(v/v)TritonX-IOO，探針各0.01fxM，Taq連接酶15U，PCR模板DNA。反應條件為9fC30秒，60'C2分鐘，循環(huán)30次。4.上測序儀器進行檢測結果如下表:rs4652678(C/T)rsl99930(C/T)rs7043268(G/A)rs6424820(C/G)rs4133072(A/G)圖5C/TcG/AC/GA圖6CcAGA圖7C/TcGCA實施例四對人基因組多個位點(SNP)同時進行多態(tài)性檢測同時對6個SNP位點(rs348475、rs499776、rs4646642、rs2161811、18rs561712和rs4646580)進行SNP分型，每個SNP突變位點間隔調整為3個堿基。1.引物和探針設計(1)普通PCR引物設計<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>(2)熒光標記探針GCATCACTCAGAGGG模板CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG熒光標記探針要進行5'磷酸化和3'探針標記(本例用FAM)。(3)標記探針<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>探針名稱rs348475—G探針序列(5'—3')長度(nt)和模板配對部分GTGTTCCTATAATATATTAATATAC25隨機序列TTCGTTCGTTCGTTCGTTC19探針總序列TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTGTTCCTATAATATATTAATATAC44探針名稱rs499776_G探針序列(5，—3，)長度(nt)和模板配對部分CATGCCTTTGACCCCCACACAGC25隨機序列TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT22探針總序列TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCATGCCTTTGACCCCCACACAGC47探針名稱rs21618U—G探針序列(5，—3，)長度(nt)和模板配對部分CAGACAGGAAGCCAAACACAAAGGC25隨機序列TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGT25探針總序列TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTCAGACAGGAAGCCAAACACAAAGGC50探針名稱rs561712—G探針序列(5'~>3')長度(nt)和模板配對部分GATTACAGGCATTTCCCAAGTCAAC25隨機序列TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCG28探針總序列TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGGATTACAGGCATTTCCCAAGTCAAC53探針名稱rs4646580—T探針序列(5，~>3，)和模板配對部分CTCAGAAGATTATCTGATACCCCGA25隨機序列TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTC31探針總序列TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCCTCAGAAGATTATCTGATACCCCGA56探針名稱rs4646642—T探針序列(5，~3，)長度(nt)和模板配對部分GATAATTTGGCTTTACAACCTTGA25隨機序列TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT34探針總序列TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTGATAATTTGGCTTTACAACCTTGA592.PCR反應反應混合液為200(iMdATP，200pMdTTP，200|iMdCTP，200pMdGTP，2mMMgCl2，2UTaqDNA聚合酶，各lpM的上下游引物，221^1基因組模板(濃度大于5ng/|nl)。反應條件為94°C30秒，62°C30秒，72'C45秒，循環(huán)30次。3.LDR反應反應混合液為20mMTris-HCl，pH8.3(at25。C)，50mMKCl，10mMMgCl2，lmMEDTA，lmMNAD+，10mMDTT，0.1%(v/v)TritonX-IOO，探針各0.01iliM，Taq連接酶15U，l|ulPCR模板DNA。反應條件為94'C30秒，6(TC2分鐘，循環(huán)30次。4.上測序儀器進行檢測結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>權利要求1、一種熒光標記探針的PCR-LDR基因多態(tài)性檢測測序方法，其特征在于該方法包括以下步驟(一)探針設計(1)針對檢測的位點，設計一系列LDR產(chǎn)物的分子量系列；(2)設計一個專有熒光標記探針，該探針具有極高的特異性，與已知生物的序列無同源性；(3)設計一個專有模板，該模板具有極高的特異性，與已知生物的序列無同源性；(4)在標記探針的3’端和檢測探針的5’端引入隨機序列來調整探針長度；(二)PCR檢測取待檢測DNA1μl，PCR引物各10-30pmol，高溫聚合酶，高溫聚合酶混合液，相互混合，PCR反應條件為94℃30秒，40-68℃30秒-2分鐘，60-72℃45秒-2分鐘，循環(huán)25-40次；(三)LDR檢測取PCR產(chǎn)物1μl，探針各40fmol-10pmol，連接酶，連接酶緩沖液，相互混合，LDR反應條件為94℃30秒，40-70℃(優(yōu)選45-60℃)1-10分鐘，循環(huán)1-40次；(四)結果檢測取LDR產(chǎn)物1-5μl，混合測序系統(tǒng)的loadingbuffer，測序儀上樣，進行LDR產(chǎn)物分離鑒定。2、根椐權利要求1所述的一種熒光標記探針的PCR-LDR基因多態(tài)性檢測測序方法，其特征在于其中步驟(一)(3)在標記探針的3'端引入模板配對序列和隨機序列，以及檢測探針的5'端引入隨機序列，所述隨機序列為與PCR產(chǎn)物的序列沒有同源性的任何序列。3、根椐權利要求1所述的一種熒光標記探針的PCR-LDR基因多態(tài)性檢測測序方法，其特征在于其中步驟(一)(4)在要檢測的突變位點的前后各設計10-25堿基長度的檢測探針和標記探針，標記探針檢測位點設計在3'端，檢測探針的檢測位點設計在5'端。4、根椐權利要求1所述的一種熒光標記探針的PCR-LDR基因多態(tài)性檢測測序方法，其特征在于其中步驟(一)(4)標記探針和檢測探針具有相近的分子量。5、根椐權利要求1所述的一種通用熒光標記探針的PCR-LDR基因多態(tài)性檢測測序方法，其特征在于其中步驟(一)(4)所述一般標記探針包含三個部分，第一部分為和目的模板配對部分，第二部分為和連接模板配對部分，第三部分為同時在第一和第二部分序列中引入的隨機序列，用來調整探針的長度，長度為40-80bp;所述檢測探針包含兩個部分，第一部分為和目的模板配對部分，第二部分為引入的隨機序列，用來調整LDR產(chǎn)物的長度，長度為40-80bp;檢測探針可以是兩根、三根或四根，探針中3，端為檢測位點，每組針對核酸單堿基變化的檢測探針，通過設定檢測探針的長度，實現(xiàn)不同的核酸堿基對應不同的LDR產(chǎn)物長度。6、一種如權利要求1所述的PCR-LDR基因多態(tài)性檢測測序方法在HPLC或微流芯片高分辨率的核酸分離檢測系統(tǒng)中的應用。全文摘要本發(fā)明提供一種熒光標記探針的PCR-LDR基因多態(tài)性檢測測序方法。本發(fā)明利用熒光標記探針進行PCR關聯(lián)LDR和測序技術來進行基因多態(tài)性位點檢測。本發(fā)明方法包括以下步驟引物和探針設計、PCR檢測、LDR檢測、測序儀結果檢測。本發(fā)明的方法由于測序結果的直接性，解決了結果的假陽性和假陰性；測序平臺的樣本高通量性，可同時進行上百例樣本的檢測；位點的高通量，利用測序儀的5色熒光檢測系統(tǒng)，同時能利用4種熒光，使測序儀系統(tǒng)也可同時進行一百多個位點的檢測，加速檢測的速度，降低了實驗成本。文檔編號C12Q1/68GK101329250SQ20071004225公開日2008年12月24日申請日期2007年6月20日優(yōu)先權日2007年6月20日發(fā)明者肖君華,炯陸,陳軼群申請人:上海翼和應用生物技術有限公司