專利名稱：：冠心病檢測方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及分子生物學和醫(yī)學領域。更具體地涉及整聯(lián)蛋白a2(Integrinalpha2，ITGA2)的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)及其與動脈粥樣硬化和/或冠心病的相關性。本發(fā)明還涉及檢測這些SNP的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
：動脈粥樣硬化是一種常見的進行性動脈疾病，病變主要累及中等大小的肌層動脈，動脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積，平滑肌細胞增生，形成局限性斑塊，可使動脈壁變硬，嚴重時斑塊破裂導致血栓、栓塞、出血，受累管腔部分或完全閉塞，臨床表現(xiàn)為動脈粥樣硬化血管并發(fā)癥的發(fā)生，老年患者中最常見和最嚴重的血管并發(fā)癥是動脈粥樣硬化和/或冠心病(不穩(wěn)定性心絞痛和心肌梗塞)和腦卒中。動脈粥樣硬化病變的發(fā)生和發(fā)展主要經(jīng)歷了四個循序漸進的病理過程1.脂質(zhì)浸潤前期內(nèi)膜改變內(nèi)皮損傷2.脂質(zhì)條紋泡沫細胞、T淋巴細胞聚集，平滑肌細胞增生。3.纖維斑塊平滑肌纖維化，形成纖維帽。4.復合病變斑塊鈣化、破裂、潰瘍，中膜病變。動脈粥樣硬化的病因及發(fā)病機制十分復雜，是動脈壁的細胞、細胞外基質(zhì)、血液成分(特別是單核細胞、血小板和LDL)、局部血流動力學、環(huán)境及遺傳因素之間一系列復雜作用的結(jié)果，因而病因并非是單一因素的。動脈粥樣硬化作為多基因疾病，發(fā)病原因不僅涉及到多個作用不同的基因，而且還涉及到基因-基因、基因-環(huán)境的相互作用?，F(xiàn)在關于動脈粥樣硬化發(fā)病機理的學說有很多，如滲入脂質(zhì)學說、血管內(nèi)膜損傷學說、炎癥反應學說、氧化-抗氧化學說及血栓形成學說。所有這些學說都涉及到不同的生物通路，但是現(xiàn)在還沒有一種學說能夠在遺傳學和分子生物學上得到完整的解釋。多年來，基于對動脈粥樣硬化致病危險因素的長期研究，科學家們針對這些危險因素開展了大量的工作。目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了血管緊張素I轉(zhuǎn)化酶(ACE)和MTHFR的某些插入、缺失和突變可能使動脈粥樣硬化和/或冠心病致病的潛在危險因素。前者使血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要功能的酶類之一，后者是一種與半胱氨酸代謝有關的酶。另外，德國科學家最近證實，ATI受體的表達水平與血管受損過程緊密聯(lián)系ACE抑制劑會減少ATI受體的激活，從而改善血管功能不良、有效的抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。但長期以來，國內(nèi)外研究較多地集中于脂質(zhì)代謝通路中相關基因的突變及表達，如副氧酶、脂蛋白脂肪酶、肝脂肪酶等。在對內(nèi)源性一氧化氮合成酶(eNOS)的研究中，現(xiàn)在已有一些研究工作表明eNOS與動脈粥樣硬化的緊密關聯(lián)。另有美國科學家提出了炎癥機制在動脈粥樣硬化的形成中的作用，并在小鼠試驗中得到了一定的證實。近年來，單核苷酸多態(tài)性(SNP)和單倍型(haplotype)概念在多基因疾病研究中的廣泛運用，為在分子水平上研究動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展的機制開辟了全新的思路。同時，高通量、低成本的SNP檢測手段的不斷出現(xiàn)也為SNP大規(guī)模快速分型提供了可能。日本科學家利用大規(guī)模的病例-對照研究對9萬多個相關基因SNPs進行了關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了一個50KB的單倍型區(qū)域與心肌梗死密切相關，其中包括LTA(lymphotoxin-oc)，NFKBIL1和BAT1等的多個SNP位點。在另一研究中，雖然P-選擇素(P-seectin)中S290N和N562D各自與心肌梗塞都沒有獨立相關性，但它們構(gòu)成的單倍型卻與心肌梗塞顯著相關。此外，SNP的存在與否以及等位基因頻率存在人種及地域的差異，這就提示多基因疾病遺傳異質(zhì)性的存在，即同一疾病或性狀在不同的人群中可能是不同的遺傳因素造成的。在對凝血因子V基因的研究中，中國人群中未能發(fā)現(xiàn)國外報道的與白人女性心肌梗塞發(fā)病具有相關性的VLeiden突變，卻發(fā)現(xiàn)了一個新的SNP-G/A1628(Arg485Lys)突變與APCR及動脈粥樣硬化和/或冠心病相關，凝血因子V基因可能是中國人群動脈粥樣硬化的一個易感基因。另外，不同人群中SNP及其單倍型的類型和頻率存在的這種差異可能與不同人群對藥物及環(huán)境因素的反應性不同密切相關。在過去的50多年來，大規(guī)模的流行病學調(diào)査和遺傳研究已經(jīng)對冠狀動脈粥樣硬化這一復雜疾病做了一系列的研究，發(fā)現(xiàn)了一些易感基因與動脈粥樣硬化相關，例如ABCA1、CYBA、ApoE、LDLR等。更多的與動脈粥樣硬化相關繼續(xù)在發(fā)現(xiàn)和驗證中。動脈粥樣硬化和/或冠心病作為一種由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用而發(fā)病的多基因病，尋找其相關基因進而闡明動脈粥樣硬化和/或冠心病發(fā)病的遺傳機制已經(jīng)成為目前研究的熱點。雖然已有許多關于各種基因多態(tài)性與動脈粥樣硬化和/或冠心病的研究，但沒有證實ITGA2基因與動脈粥樣硬化和/或冠心病相關性的報道，更沒有證實ITGA2基因的SNP與動脈粥樣硬化和/或冠心病相關性的報道。綜上所述，為了盡早診斷動脈粥樣硬化和/或冠心病，本領域迫切需要尋找動脈粥樣硬化和/或冠心病易感基因，并開發(fā)檢測動脈粥樣硬化和/或冠心病的方法和試劑盒。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供一種輔助診斷(尤其是早期診斷)動脈粥樣硬化和/或冠心病的方法及檢測試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供一種新的治療動脈粥樣硬化和/或冠心病的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種對個體的動脈粥樣硬化和/或冠心病易感性進行診斷的方法，它包括步驟檢測該個體的ITGA2基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的ITGA2基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個體患動脈粥樣硬化和/或冠心病的可能性高于正常人群。在另一優(yōu)選例中，所述的方法中檢測的是HGA2的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常ITGA2核苷酸序列比較差異。在另一優(yōu)選例中，所述的差異是以下的單核苷酸多態(tài)性-301位T—C;其中，核苷酸位置編號基于SEQIDN0:1。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測樣品是否存在整聯(lián)蛋白a2(ITGA2)的單核苷酸多態(tài)性的方法，包括步驟(a)用ITGA2基因特異性引物擴增樣品的ITGA2基因，得到擴增產(chǎn)物；和(b)檢測擴增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性301位T—C;其中，核苷酸位置編號基于SEQIDN0:1。在另一優(yōu)選例中，所述的基因特異性引物具有SEQIDN0:2和3的序列。在另一優(yōu)選例中，所述的擴增產(chǎn)物的長度為100-2000bp，且含有SEQIDN0:1中第301位。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種檢測動脈粥樣硬化和/或冠心病的試劑盒，它包括特異性擴增ITGA2基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，更佳地，所述的引物擴增出長度為100-2000bp，且含有SEQIDN0:1中第301位的擴增產(chǎn)物。在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還含有選自下組的試劑(a)與SEQIDN0:1中第301位的突變結(jié)合的探針；(b)識別SEQIDN0:1中第301位的突變限制性內(nèi)切酶。在另一優(yōu)選例中，所述的突變選自以下單核苷酸多態(tài)性-301位T—C;其中，核苷酸位置編號基于SEQIDN0:1。具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，對大量候選基因的SNP進行了測定和分析。首次發(fā)現(xiàn)和證明了ITGA2的基因組序列與動脈粥樣硬化和/或冠心病密切相關，其中關聯(lián)研究結(jié)果顯示，在ITGA2的SEQIDN0:1中第301位的SNP(301位T—C)在病例和對照組中的分布存在顯著性差異(代O.05)，因此可作為輔助性檢測動脈粥樣硬化和/或冠心病(或其易感性)的特異性SNP。在此基礎上完成了本發(fā)明。ITGA2基因整聯(lián)蛋白a2(Integrinalpha2，ITGA2)的序列是已知，其詳細序列和一些相關信息可參見網(wǎng)址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genebank/;hUp:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP。為了方便起見，在SEQIDN0:1給出ITGA2中與本發(fā)明SNP相關的核苷酸序列。ITGA2整聯(lián)蛋白ci2，也稱為CD49B或VLA-2受體a2亞基(CD49B，alpha2subunitofVLA-2rec印tor)。ITGA2基因?qū)儆贗ntegrins基因家族，i亥家族的基因是一些與細胞粘附相關的表面受體蛋白，并被認為參與了細胞表面的信號傳導。血小板表面的ITGA2和ITGB1的共同作用體(alpha-2/beta-1)調(diào)節(jié)了血小板最初的在膠原質(zhì)上的沉積，并影響到下一步血栓的形成(SiljanderPRetal.Blood.2004;103(4):1333-41)。ITGA2基因的一些多態(tài)性，可以影響到血小板表面的alpha-2/beta-1的密度(KritzikMetal.Blood.1998:92(7):2382-8)。進而，這種影響可以關系到年青個體的心肌梗塞的發(fā)生(SantosoSetal.Blood.1999;93(8):2449-53;CarlssonLEetal.Blood.1999:93(11):3583—6)。并且，ITGA2基因也被認為在心臟血管血栓形成中具有作用(CharakidaMetal.ItalHeartJ.2003;4(1):17-22)。本發(fā)明人對ITGA2基因中的幾乎整個區(qū)域進行了測序，發(fā)現(xiàn)了許多SNP，其中大部分SNP與動脈粥樣硬化和/或冠心病易感性并不相關，然而關聯(lián)研究表明SEQIDN0:1中301位T—C卻是與動脈粥樣硬化和/或冠心病易感性關聯(lián)性非常高的SNP。具體而言，本發(fā)明揭示了ITGA2基因第6號內(nèi)含子的單核苷酸多態(tài)性(SNP)以及該多態(tài)性與冠狀動脈粥樣硬化的相關性。本發(fā)明的SNP是SEQIDN0:1所示序列的第301位的C/T多態(tài)，它位于人ITGA2基因的第6號內(nèi)含子，TC型和CC型在冠狀動脈粥樣硬化病人群中的頻率要明顯高于在正常對照人群中的頻率；而純合子TT在正常對照人群中的頻率，要明顯低于在冠狀動脈粥樣硬化病人群中的頻率?；诒景l(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，HGA2蛋白或多肽有多方面的新用途。這些用途包括(但不限于)用于輔助性診斷動脈粥樣硬化和/或冠心病，或用于篩選促進ITGA2蛋白功能的物質(zhì)，如抗體、多肽或其它配體。另一方面，本發(fā)明還包括對人ITGA2DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，"特異性"是指抗體能結(jié)合于人ITGA2基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人ITGA2基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人ITGA2蛋白的分子，也包括那些并不影響人ITGA2蛋白功能的抗體。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備。例如，純化的人ITGA2基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達人ITGA2蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人ITGA2蛋白功能的抗體以及不影響人ITGA2蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人ITGA2基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人ITGA2基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。抗人ITGA2蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術(shù)中，檢測活檢標本中的人ITGA2蛋白的多少和/或突變與否。一種優(yōu)選的抗ITGA2抗體是不識別正常ITGA2但識別突變ITGA2的抗體，或者識別正常ITGA2但不識別突變ITGA2的抗體。利用這些抗體，可以方便地進行蛋白質(zhì)水平的動脈粥樣硬化和/或冠心病易感性檢利用本發(fā)明ITGA2蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與ITGA2蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如抑制劑、激動劑或拮抗劑等。本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人ITGA2蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括ELISA等。一種檢測檢測樣品中是否存在ITGA2蛋白的方法是利用ITGA2蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與ITGA2蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在HGA2蛋白。ITGA2蛋白的多聚核苷酸可用于ITGA2蛋白相關疾病的輔助診斷。在診斷方面，ITGA2蛋白的多聚核苷酸可用于檢測ITGA2蛋白的表達與否或在疾病狀態(tài)下ITGA2蛋白的異常表達。如ITGA2DNA序列可用于對活檢標本的雜交以判斷ITGA2蛋白的表達異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為"基因芯片")上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用ITGA2蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測ITGA2蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。檢測可以針對cDNA，也可針對基因組DNA。ITGA2蛋白突變的形式包括與正常野生型ITGA2DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。最方便的檢測本發(fā)明SNP的方法，是通過用ITGA2基因特異性引物擴增樣品的ITGA2基因，得到擴增產(chǎn)物；然后檢測擴增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性301位T—C，其中，核苷酸位置編號基于SEQIDN0:1。應理解，在本發(fā)明首次揭示了ITGA2基因的SNP與動脈粥樣硬化和/或冠心病的相關性之后，本領域技術(shù)人員可以方便地設計出可特異性擴增出含該SNP位置的擴增產(chǎn)物，然后通過測序等方法確定是否存在301位T—C。通常，引物的長度為15-50bp，較佳地為20-30bp。雖然引物與模板序列完全互補是優(yōu)選的，但是本領域技術(shù)人員知道，在引物與模板存在一定的不互補(尤其是引物的5'端)的情況下，也能夠特異性地擴增(即僅擴增出所需的片段)。含有這些引物的試劑盒和使用這些引物的方法都在本發(fā)明范圍之內(nèi)，只要該引物擴增出的擴增產(chǎn)物含有本發(fā)明SNP的對應位置。一種優(yōu)選的引物對具有SEQIDN0:2和3的序列。雖然擴增產(chǎn)物的長度沒有特別限制，但是通常擴增產(chǎn)物的長度為ioo-2000bp，較佳地為150-1500bp，更佳地為200-1000bp。這些擴增產(chǎn)物都應含有SEQIDN0:1中第301位。由于本發(fā)明的SNP與動脈粥樣硬化和/或冠心病具有非常高的關聯(lián)性，因此不僅可用于早期輔助性診斷動脈粥樣硬化和/或冠心病，而且可以未雨綢繆地使一些攜帶者在未發(fā)病前就采取合理的預防措施(如在飲食上采取相應控制)，從而提高攜帶者的生存期和生存質(zhì)量，因此具有極其重大的應用價值和社會效益。當然，最終宜用常規(guī)檢測方法進行確診。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議10的條件。實施例11.1研究對象在經(jīng)冠狀動脈造影確診為動脈粥樣硬化的病人中，挑選病變支數(shù)在2條或2條以上，且病變狹窄程度在50%以上的病人作為病例。另取經(jīng)冠狀動脈造影確診為沒有動脈粥樣硬化的正常人作為對照，盡量選取年齡、性別和籍貫與病例組相匹配。在知情同意的基礎上隨機收集了188個病人和183個正常對照個體的外周血樣本。1.2實驗方法和結(jié)果1.2.1DNA提取用常規(guī)酚氯仿法從人的外周血樣本中提取DNA，濃度校正至20ng/ul后，用于常規(guī)PCR擴增。1.2.2PCR及測序引物的設計根據(jù)GenBank中ITGA2的基因組序列，設計和合成以下引物。具體引物如下表1所示。表1引物序列表_<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>1.2.3ITGA2基因的PCR擴增以提取的DNA為模板，用Taq酶，在GeneA卿9700PCR儀上以Touchdown程序進行PCR擴增。反應條件為94。C預變性2分鐘，94。C變性30秒，63。C退火40秒，72。C延伸40秒，共10個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度遞減0.5°C;以后94°C變性30秒，58。C退火40秒，72。C延伸40秒，共30個循環(huán)；最后72。C延伸7分鐘。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證。結(jié)果，獲得ITGA2的擴增產(chǎn)物。1.2.4SNP的發(fā)現(xiàn)和檢測PCR產(chǎn)物經(jīng)Resin樹脂純化后，用ABI-PRISM377DNA測序儀(美國應用生物系統(tǒng)公司appliedbiosystems(ABI))進行熒光標記末端終止法雙向測序，用Polyphred軟件(美國華盛頓大學http://droog.mbt.washington.edu/Polyphred.html)進行序列的判讀和SNP確認。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)存在數(shù)個SNP，其中包括以下SNP:SEQIDN0:1中301位T—C。1.2.5SNP基因分型和關聯(lián)分析用直接單向測序法進行SNP基因分型。即在動脈粥樣硬化和/或冠心病病人和正常對照組中進行分型和關聯(lián)分析。對基因分型結(jié)果進行描述性統(tǒng)計分析，列聯(lián)表進行卡方檢驗。觀察基因型在病人和對照之間是否具有差異。分析結(jié)果顯示，在總共188個病人和183個正常對照中，ITGA2的301位的SNP(RS1421933)在病人組和對照組之間存在顯著差異其中TC和CC型在病人群中的頻率明顯高于在正常人群中的頻率；而純合子TT的頻率在病人群中的比例低于正常人群，TT型在病人群中為20.2%,在對照中為27.9%，兩者具有顯著性差異(p:0.077)。上述結(jié)果證實了SEQIDNO:1中301位的SNP與動脈粥樣硬化和/或冠心病的發(fā)生存在著相關性。實施例2動脈粥樣硬化和/或冠心病易感性檢測試劑盒如實施例1所述，SEQIDNO:1中301位T—C的突變與動脈粥樣硬化和/或冠心病疾病密切相關。因此，可基于這個突變設計ITGA2基因特異性引物在以病人的DNA為模板進行擴增進行檢測。制備一試劑盒(100人次)，它含有:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>隨機挑選100個人構(gòu)成的測試組，其中包括未知是否患動脈粥樣硬化的對象、已知患動脈粥樣硬化和/或冠心病病人和經(jīng)檢測無動脈粥樣硬化的正常人。抽取測試組中待檢測對象的外周血3ml,使用常規(guī)方法(或使用特定的試劑盒)從血液中提取DNA。將動脈粥樣硬化和/或冠心病檢測試劑盒中的PCR引物稀釋到limol/il，以所提取的DNA為模板與所提供的引物進行PCR反應。PCR產(chǎn)物純化后，用ABI-PRISMTM377DNA測序儀進行熒光標記末端終止法雙向測序，用Polyphred軟件進行序列的判讀和SNP確認。或者，將擴增產(chǎn)物與正常對照用變性高效液相色譜儀(DHPLC)進行色譜分析，也可檢測出301位T—C。檢測結(jié)果對于ITGA2存在301位T—C的對象，進一步通過常規(guī)方法檢測以確認是否患有動脈粥樣硬化情況。檢測結(jié)果表明，含301位T—C的檢測對象(尤其是CC純化子)的動脈粥樣硬化和/或冠心病易感性比例明顯高于CC型正常人群(高出至少40%)。因此，這表明通過檢測ITGA2的301位T—C，可進行動脈粥樣硬化的輔助性檢測和/或早期診斷。實施例3動脈粥樣硬化和/或冠心病易感性輔助性檢測重復實施例2的檢測，不同點在于隨機選取了70個人(檢測前不知道是否有動脈粥樣硬化癥狀)進行檢測。制備一試劑盒(100人次)，它含有:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>抽取待檢測對象的外周血3ml，使用常規(guī)方法(或使用特定的試劑盒)從血液中提取DNA。將動脈粥樣硬化和/或冠心病檢測試劑盒中的PCR引物稀釋到limol/il,以所提取的DNA為模板與所提供的引物進行PCR反應。PCR產(chǎn)物純化后，用ABI-PRISMTM377DNA測序儀進行熒光標記末端終止法雙向測序，用Polyphred軟件進行序列的判讀和SNP確認。結(jié)果同樣表明，TT型檢測對象患動脈粥樣硬化的概率低于其他CT型或CC型。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110〉上海人類基因組研究中心<120〉冠心病檢測方法和試劑盒<130>072053<160>3<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211〉601<212>DNA<213〉智人(Homosapiens)<400>1taaatcgtgccattgcactccagcctaggtgacaagagcaagacttggtcttaaaaaaaa60aaaaaaaagttatgtcccatacctttaatgcttgtgtcagaaatagaactctaaggtcaa120aagaccagcactgggcaaagccataggtagaataacccaatgtagtaaaagtttcaatta180actttaaaaactaccatcaaatgcatttaaaatggggatttggcaaatacaaaaattaag240acttcatagctaacaatatttttttcagaaagaaagccataagttagttatgcatttctg300tatccaggccttgtacaaatttttccaaaa360tatttgattcatcacacacaaccacaacat420ctatgagggaagggcaggctacacaggaaaagaggaa卿agcagatttccacaggtaag柳tcatatttcacagccatataaaaatgagacttaaggagggtttgggtgccactagttgat540aaccttttccccctcctttaactgtaaggcattgctcagaccatctgcacattaataact600t601ttagccatacctgtgtctttgtggggcctaaattctttactgcatcccaaggataaatac<210〉2<211>25<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400>2taaatcgtgccattgcactccagcc25<210>3<211〉25<212〉畫<213〉人工序列<220〉<221>misc一feature<223>引物<400>3aagttattaatgtgcagatggtctg權(quán)利要求1.一種體外檢測樣品是否存在整聯(lián)蛋白α2(ITGA2)的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，包括步驟(a)用ITGA2基因特異性引物擴增樣品的ITGA2基因，得到擴增產(chǎn)物；和(b)檢測擴增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性301位T→C；其中，核苷酸位置編號基于SEQIDNO1。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因特異性引物具有SEQIDN0:2和3的序列。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的擴增產(chǎn)物的長度為100-2000bp且含有SEQIDN0:1中第301位。4.一種檢測動脈粥樣硬化和/或冠心病的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴增ITGA2基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，所述的引物擴增出長度為100-2000bp且含有SEQIDN0:1中第301位的擴增產(chǎn)物。5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，它還含有選自下組的試劑(a)與SEQIDN0:1中第301位的突變結(jié)合的探針；(b)識別SEQIDN0:1中第301位的突變限制性內(nèi)切酶。6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的突變是以下的單核苷酸多態(tài)性301位T—C;其中，核苷酸位置編號基于SEQIDN0:1。7.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的引物具有SEQIDN0:2和3的序列。8.—種對個體的動脈粥樣硬化和/或冠心病易感性進行診斷的方法，其特征在于，它包括步驟檢測該個體的ITGA2基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的ITGA2基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，其中，存在差異就表明該個體患動脈粥樣硬化和/或冠心病的可能性高于正常人群。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，檢測的是ITGA2的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常ITGA2核苷酸序列比較差異。IO.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的差異是以下的單核苷酸多態(tài)性301位T—C;其中，核苷酸位置編號基于SEQIDN0:1。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測動脈粥樣硬化和/或冠心病易感性的方法，它包括檢測個體的整聯(lián)蛋白α2(ITGA2)、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白與正常相比是否存在變異，存在變異就表明該個體患動脈粥樣硬化和/或冠心病的可能性大于正常人群。本發(fā)明還公開了相應的檢測試劑盒。文檔編號C12Q1/68GK101294205SQ200710040109公開日2008年10月29日申請日期2007年4月27日優(yōu)先權(quán)日2007年4月27日發(fā)明者一王,穎王,王海豐,力金,薇黃申請人:上海人類基因組研究中心