專(zhuān)利名稱(chēng)：一種生產(chǎn)5’－呈味核苷酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用高活性基因工程菌生產(chǎn)5’-呈味核苷酸的方法。
背景技術(shù)：
5’-核苷酸常被用作食品添加劑和藥物合成中間體，其中5’-肌苷酸(Inosine-5’-monophosphate，簡(jiǎn)稱(chēng)5’-IMP)和鳥(niǎo)苷酸(Guanosine-5’-monophosphate，簡(jiǎn)稱(chēng)5’-GMP)作為一種呈味劑可與味精(谷氨酸鈉MSG)混合產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，使鮮度提高數(shù)倍至數(shù)十倍；此外它們對(duì)甜味、肉味有增效作用，對(duì)咸、酸、苦味及腥、焦味有抑制作用，因此在食品工業(yè)生產(chǎn)中越來(lái)越受到重視和歡迎。
工業(yè)化生產(chǎn)5’-核苷酸的方法主要有核糖核酸(RNA)酶解法，利用谷氨酸產(chǎn)生菌、產(chǎn)氨短桿菌、谷氨酸桿菌等微生物直接發(fā)酵法以及利用枯草桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)氨短桿菌等發(fā)酵肌苷后以化學(xué)法或者微生物酶法轉(zhuǎn)化為5’-肌苷酸。這些方法或者反應(yīng)物對(duì)人體有毒性或者反應(yīng)底物昂貴或者副產(chǎn)物多，所以不能用來(lái)高效而廉價(jià)的生產(chǎn)5’-核苷酸。
三原康博等報(bào)道了一種利用酸性磷酸酶(acid phosphatase，EC3.1.3.2)以焦磷酸鈉鹽為磷酸供體生產(chǎn)5’-核苷酸的方法，以突變后的基因工程菌為酶源，反應(yīng)12小時(shí)IMP累積量達(dá)到120.5g/l，肌苷轉(zhuǎn)化率約76.5％。然而此方法仍然存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化率不高等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種酶，一個(gè)編碼該酶的基因，含有該基因的重組DNA，可用于生產(chǎn)5’-呈味核苷酸的微生物；本發(fā)明的另一目的是提供一種高效廉價(jià)生產(chǎn)5’-呈味核苷酸的方法。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下1.利用重組DNA技術(shù)，構(gòu)建酸性磷酸酶表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)，得到高效表達(dá)酸性磷酸酶的基因工程菌。
酸性磷酸酶的來(lái)源不做限制，只要能催化相應(yīng)的核苷與磷酸基供體在酸性緩沖液中生成相應(yīng)5’-核苷酸即可，例如產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)等，在特別推薦的方案中，本發(fā)明使用產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes W8401)的酸性磷酸酶。
構(gòu)建重組質(zhì)粒的載體也不做限制，只要能高效表達(dá)外源的酸性磷酸酶即可，在特別推薦的方案中，本發(fā)明使用溫度誘導(dǎo)型的表達(dá)載體pBV220，此載體不需使用化學(xué)誘導(dǎo)劑，只須提高溫度到42℃誘導(dǎo)4h即可誘導(dǎo)外源蛋白的大量表達(dá)，相對(duì)于通常所用的由化學(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)的表達(dá)質(zhì)粒(如攜帶由IPTG誘導(dǎo)的lac啟動(dòng)子的質(zhì)粒)而言，可以節(jié)約大量成本。
培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基不受特別限制，為可以獲得含有一般碳源，氮源，無(wú)機(jī)離子和可選的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的普通培養(yǎng)基，在特別推薦的方案中，本發(fā)明使用的是LB培養(yǎng)基，配方如下蛋白胨10g、酵母抽提物5g和NaCl10g，使用10mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為7.2，定容至1L。固體培養(yǎng)基只需在液體培養(yǎng)基內(nèi)加入2％瓊脂即可。
培養(yǎng)微生物的條件也不特別限制，例如可以在需氧條件下培養(yǎng)12-48小時(shí)，同時(shí)將pH值控制在5-8，溫度控制在25-40℃的范圍。對(duì)于需要誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白質(zhì)的微生物的培養(yǎng)，可以在上述的培養(yǎng)之后再根據(jù)相應(yīng)表達(dá)載體選擇相應(yīng)的誘導(dǎo)表達(dá)條件，例如使用pBV220表達(dá)載體時(shí)，可在30℃培養(yǎng)16小時(shí)后，將溫度提高到42℃的方法誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白質(zhì)。
2.酸性磷酸酶基因的突變與篩選對(duì)核苷具有較高親和性的酸性磷酸酶。
酸性磷酸酶基因的突變的方法不受限制，只要能使酸性磷酸酶產(chǎn)生突變即可。比如可以用紫外光輻射或者用人工誘變劑處理含有該酶基因的微生物，也可以用定點(diǎn)突變的方法直接突變，或者DNA改組(DNA shuffling)的方法定向突變。
篩選對(duì)核苷具有較高親和性的酸性磷酸酶的方法不做限制，只要能快速而高效的篩選到表達(dá)對(duì)核苷具有較高親和性的酸性磷酸酶的微生物即可。
3.以酸性磷酸酶催化核苷與磷酸基團(tuán)供體合成5’-核苷酸。
使用的酸性磷酸酶的來(lái)源不做限制，只要能催化核苷與磷酸基團(tuán)供體合成相應(yīng)的5’-核苷酸即可。比如可以是經(jīng)過(guò)初步抽提的粗酶，也可以是源自細(xì)菌的非增殖的完整細(xì)胞作為酶源。在特別推薦的方案中，本發(fā)明使用表達(dá)外源酸性磷酸酶的基因工程菌作為酶源。
使用的核苷不做限制，包括嘌呤核苷(比如肌苷、鳥(niǎo)苷、腺苷、黃苷、6-甲基嘌呤核苷、6-甲氧基嘌呤核苷、2，6-二氨基嘌呤核苷、6-氟嘌呤核苷、6-硫代嘌呤核苷、巰基鳥(niǎo)苷、2-氨基6-硫代嘌呤核苷、阿拉伯糖腺苷等)，嘧啶核苷(比如尿苷、胞苷、5-氨基尿苷、5-羥基尿苷、5溴尿苷、6-氮雜尿苷、阿拉伯糖胞苷等)。
使用的磷酸基團(tuán)供體也不做限制，包括多磷酸及其鹽(如焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸、它們的混合物、其鈉鹽、鉀鹽及其混合物)，苯磷酸及其鹽(如苯磷酸二鈉、苯磷酸二鉀、鄰，鄰-二苯磷酸酐及其混合物)，氨甲酰磷酸及其鹽(如氨甲酰磷酸二鈉、氨甲酰磷酸二鉀、氨甲酰磷酸二銨、氨甲酰磷酸二鋰及其混合物)，乙酰磷酸及其鹽(如乙酰磷酸鋰鉀等)。
反應(yīng)的緩沖液的pH值為2.5-6之間。
反應(yīng)的溫度為20-50℃。
反應(yīng)底物中核苷濃度為10-200mM，磷酸基團(tuán)供體濃度為其1-10倍。
反應(yīng)可以在靜止的條件下進(jìn)行，也可以在適當(dāng)?shù)臄嚢柘逻M(jìn)行。
反應(yīng)時(shí)間在1-20小時(shí)之間。
反應(yīng)完成后，可以使用合成樹(shù)脂吸附的方法，使用沉淀劑的方法或其他常規(guī)收集和分離方法，從混合物中收集和分離由此生成的5’-核苷酸。
利用本發(fā)明的方法催化合成5’-核苷酸，具有簡(jiǎn)單，高效，周期短，低成本，符合環(huán)保要求等特點(diǎn)，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的特點(diǎn)是1.引入突變S89N，A90F，G92D，I171T后的酸性磷酸酶其核苷磷酸轉(zhuǎn)移酶活性大大提高，突變后的酸性磷酸酶在以50g/l的肌苷與300g/l的焦磷酸鈉為底物時(shí)，反應(yīng)2小時(shí)5’-IMP累積量達(dá)到90.6g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到92％；以100g/l的肌苷與300g/l的焦磷酸鈉為底物時(shí)，反應(yīng)7小時(shí)后5’-IMP累積量達(dá)到153.7g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到78％，與三原康博等的工藝相比，反應(yīng)時(shí)間縮短了，5’-肌苷酸累積量也得到提高。
2.選用溫度誘導(dǎo)型的表達(dá)載體表達(dá)外源蛋白，節(jié)約大量成本。
3.直接以基因工程菌菌體催化轉(zhuǎn)核苷反應(yīng)，無(wú)需破細(xì)胞提純酶。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但本發(fā)明不僅限于這些例子。
實(shí)施例11.基因工程菌的構(gòu)建根據(jù)GeneBank中提供的Enterobacter aerogenes的phoc基因序列設(shè)計(jì)引物如下Primer15’-cgggatcccatgaaaaagcgcgttctcgccctctg-3’(BamHI)(記為SEQ.ID.NO.5)，Primer25’-ccgctcgagcgatgacgttacttctgcgttttggcg-3’(XholI)(記為SEQ.ID.NO.6)，以Enterobacter aerogenes的染色體DNA為模板做PCR95℃5min，30×(95℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min。得到長(zhǎng)度約760bp的PCR產(chǎn)物，與pBV220載體分別經(jīng)限制性酶切后用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。用pBV220載體通用引物PCR及限制性酶切鑒定轉(zhuǎn)化子得到基因工程菌pBV220-phoc。DNA測(cè)序結(jié)果為SEQ.ID.NO.1atgaaaaagcgcgttctcgccctctgcctggccagtttcttctccgttaacgcctttgctctggttccccccgggaacgatgtcaccaccaagcccgatctctactatctgaccaatgcccaggccatcgacagcctggcgctgttgccaccaccgccggcggtgggcagtatcgcatttttaaacgatcaggcgatgtatgagcaaggacgtctgctgcgcaataccgagcgcgggaagctggcggcagaggatgctaacctcagcgcgggcggcgtggccaacgccttctccagcgcctttggttcgccgattaccgagaaagacgcgccgcagcttcacaaactgctgaccaatatgattgaagacgccggcgacctggcgacccgcagcgcgaaagagaaatacatgcgcattcgcccgtttgcgttctatggcgtctccacctgcaacaccaccgaacaggacaagctggcgaaaaacggctcttacccgtccgggcatacctctatcggctgggccaccgccctggtgctggcggagatcaacccgcagcggcaaaacgaaattttgaagcgcggctatgagctcggcgagagccgggtgatctgcggctatcactggcagagcgatgtcgatgcggcgcgcatcgtcggctccgcggtggtcgctacgctgcacaccaacccggccttccagcagcagttgcagaaagccaaagatgaattcgccaaaacgcagaagtaa其氨基酸序列為SEQ.ID.NO.2mkkrvlalclasffsvnafalvppgndvttkpdlyyltnaqaidslallppppavgsiaflndqamyeqgrllrntergklaaedanlsaggvanafssafgspitekdapqlhklltnmiedagdlatrsakekymrirpfafygvstcntteqdklakngsypsghtsigwatalvlaeinpqrqneilkrgyelgesrvicgyhwqsdvdaarivgsavvatlhtnpafqqqlqkakdefaktqk與GeneBank提供的氨基酸序列同源性為97.2％，存在以下改變L13F，A24P，A28V，K38T，E54A，K69Q，S159A。
2.濕菌體的制備。
重組菌活化后接種于含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)到OD6000.6時(shí)立即升溫至42℃培養(yǎng)4h，離心后的菌體用10mmol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液洗滌，再離心得濕菌體。
3.酶催化合成5’-IMP。
反應(yīng)體系如下緩沖液100mmol/L pH3.5的醋酸鹽緩沖液底物10mg/ml肌苷和250mg/ml Na4P2O7·10H2O菌體量2％(濕重)于30℃水浴搖床上反應(yīng)，搖速150r/min，反應(yīng)結(jié)束后100℃煮沸5min，12000r/min離心5min得上清液。
取2.5μl樣品TLC檢測(cè)其5’-IMP濃度，方法如下以硅膠GF254鋪板，TLC流動(dòng)相為正丙醇/氨水/水(20/15/4)，層析后晾干，紫外下刮下5’-IMP所對(duì)應(yīng)的點(diǎn)，加入2ml水溶解1小時(shí)，離心后紫外分光光度計(jì)測(cè)定其OD249，以不同濃度的5’-IMP OD249所做的標(biāo) 準(zhǔn)曲線來(lái)定量。根據(jù)以下公式計(jì)算轉(zhuǎn)化率。
反應(yīng)5小時(shí)5’-IMP濃度達(dá)到8.29g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到42.1％。
實(shí)施例21.phoc的突變?cè)O(shè)計(jì)如下引物Primer35’-ctaacctcagcttcggcgacgtggc-3’(記為SEQ.ID.NO.7)，Primer45’-gccacgtcgccgaagctgaggttag-3’(記為SEQ.ID.NO.8)，Primer55’-gcatacctctaccggctgggccac-3’(記為SEQ.ID.NO.9)，Primer65’-gtggcccagccggtagaggtatgc-3’(記為SEQ.ID.NO.10)，分別以primer1/primer4，primer3/primer6，primer5/primer2作為引物，以pBV220-phoc重組質(zhì)粒為模板，PCR，條件如下95℃5min，30×(95℃30s，50℃30s，72℃60s)，72℃10min。分別得到長(zhǎng)度約200bp，200bp，300bp的PCR產(chǎn)物，回收后以其為模板，以primer1/primer2為引物進(jìn)行第二輪PCR，條件為95℃5min，30×(95℃30s，50℃30s，72℃60s)，72℃10min。得到長(zhǎng)度約760bp的PCR產(chǎn)物，與pBV220載體分別經(jīng)限制性酶切后用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。用pBV220載體通用引物PCR篩選陽(yáng)性克隆。
2.高酶活性菌的篩選反應(yīng)體系如下緩沖液100mmol/L pH3.5的醋酸鹽緩沖液底物10mg/mlIr和250mg/ml Na4P2O7·10H2O菌體量2％(濕重)于30℃水浴搖床上反應(yīng)，搖速150r/min，反應(yīng)30分鐘后100℃煮沸5min，12000r/min離心5min得上清液，TLC檢測(cè)5’-IMP濃度。最終得到一株高活性菌a8265，測(cè)序結(jié)果為SEQ.ID.NO.3atgaaaaagcgcgttctcgccctctgcctggccagtttcttctccgttaacgcctttgctctggttccccccgggaacgatgtcaccaccaagcccgatctctactatctgaccaatgcccaggccatcgatagcctggcgctgttgccaccaccgccggcggtgggcagtatcgcatttttaaacgatcaggcgatgtatgagcaaggacgtctgctgcgcaataccgagcgcgggaagctggcggcagaggatgctaacctcaacttcggcgacgtggccaacgccttctccagcgcctttggttcgccgattaccgagaaagacgcgccgcagcttcacaaactgctgaccaatatgattgaagacgccggcgacctggcgacccgcagcgcgaaagagaaatacatgcgcattcgcccgtttgcgttctatggcgtctccacctgcaacaccaccgaacaggacaagctggcgaaaaacggctcttacccgtccgggcatacctctaccggctgggccaccgccctggtgctggcggagatcaacccgcagcggcaaaacgaaattttgaagcgcggctatgagctcggcgagagccgggtgatctgcggctatcactggcagagcgatgtgatgcggcgcgcatcgtcggctccgcggtggtcgctacgctgcacaccaacccggccttccagcagcagttgcagaaagccaaagatgaattcgccaaaacgcagaagtaa其氨基酸序列為SEQ.ID.NO.4
mkkrvlalclasffsvnafalvppgndvttkpdlyyltnaqaidslallppppavgsiaflndqamyeqgrllrntergklaaedanlnfgdvanafssafgspitekdapqlhklltnmiedagdlatrsakekymrirpfafygvstcntteqdklakngsypsghtstgwatalvlaeinpqrqneilkrgyelgesrvicgyhwqsdvdaarivgsavvatlhtnpafqqqlqkakdefaktqk存在如下突變S89N，A90F，G92D，I171T。
3.酶催化合成5’-IMP。
3.1同實(shí)施例一步驟2，制備a8265濕菌體后以以下體系酶催化合成5’-IMP緩沖液100mmol/L pH3.5的醋酸鹽緩沖液底物50mg/ml Ir和300mg/ml Na4P2O7·10H2O菌體量2％(濕重)反應(yīng)2小時(shí)5’-IMP濃度達(dá)到90.6g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到92％。
3.2同實(shí)施例一步驟2，制備a8265濕菌體后以以下體系酶催化合成5’-IMP緩沖液100mmol/L pH3.5的醋酸鹽緩沖液底物100mg/ml Ir和300mg/ml Na4P2O7·10H2O菌體量2％(濕重)反應(yīng)7小時(shí)后5’-IMP濃度達(dá)到153.7g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到78％。
3.3同實(shí)施例一步驟2，制備a8265濕菌體后以以下體系酶催化合成5’-IMP緩沖液100mmol/LpH3.5的醋酸鹽緩沖液底物100mg/ml Ir和300mg/ml Na4P2O7·10H2O菌體量1％(濕重)反應(yīng)16小時(shí)后5’-IMP濃度達(dá)到151.7g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到77％。
序列表<110>復(fù)旦大學(xué)<120>一種高效生產(chǎn)5’-呈味核苷酸的方法<160>10<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>747<212>DNA<213>產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)<220>
<221>CDS<222>(1)...(747)<400>1atg aaa aag cgc gtt ctc gcc ctc tgc ctg gcc agt ttc ttc tcc gtt 48Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Phe Phe Ser Val1 5 10 15aac gcc ttt gct ctg gtt ccc ccc ggg aac gat gtc acc acc aag ccc 96Asn Ala Phc Ala Leu Val Pro Pro Gly Asn Asp Val Thr Thr Lys Pro20 25 30gat ctc tac tat ctg acc aat gcc cag gcc atc gac agc ctg gcg ctg 144Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Asn Ala Gln Ala Ile Asp Set Leu Ala Leu35 40 45ttg cca cca ccg ccg gcg gtg ggc agt atc gca ttt tta aac gat cag 192Leu Pro Pro Pro Pro Ala Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln50 55 60gcg atg tat gag caa gga cgt ctg ctg cgc aat acc gag cgc ggg aag 240Ala Met Tyr Glu Gln Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys65 70 75 80
ctg gcg gca gag gat gct aac ctc agc gcg ggc ggc gtg gcc aac gcc 288Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala85 90 95ttc tcc agc gcc ttt ggt tcg ccg att acc gag aaa gac gcg ccg cag 336Phe Ser Ser Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Gln100 105 110ctt cac aaa ctg ctg acc aat atg att gaa gac gcc ggc gac ctg gcg 384Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala115 120 125acc cgc agc gcg aaa gag aaa tac atg cgc att cgc ccg ttt gcg ttc 432Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe130 135 140tat ggc gtc tcc acc tgc aac acc acc gaa cag gac aag ctg gcg aaa 480Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ala Lys145 150 155 160aac ggc tct tac ccg tcc ggg cat acc tct atc ggc tgg gcc acc gcc 528Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser lle Gly Trp Ala Thr Ala165 170 175ctg gtg ctg gcg gag atc aac ccg cag cgg caa aac gaa att ttg aag 576Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys180 185 190cgc ggc tat gag ctc ggc gag agc cgg gtg atc tgc ggc tat cac tgg 624Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp195 200 205cag agc gat gtc gat gcg gcg cgc atc gtc ggc tcc gcg gtg gtc gct 672Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val Val Ala210 215 220acg ctg cac acc aac ccg gcc ttc cag cag cag ttg cag aaa gcc aaa 720
Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys225 230 235 240gat gaa ttc gcc aaa acg cag aag taa 747Asp Glu Phe Ala Lys Thr Gln Lys245<210>2<211>248<212>PRT<213>產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)<400>2Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Phe Phe Ser Val1 5 10 15Asn Ala Phe Ala Leu Val Pro Pro Gly Asn Asp Val Thr Thr Lys Pro20 25 30Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Asn Ala Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu35 40 45Leu Pro Pro Pro Pro Ala Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln50 55 60Ala Met Tyr Glu Gln Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys65 70 75 80Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala85 90 95Phe Ser Ser Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Gln100 105 110Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala115 120 125Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe
130 135 140Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ala Lys145 150 155 160Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala165 170 175Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys180 185 190Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp195 200 205Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val Val Ala210 215 220Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys225 230 235 240Asp Glu Phe Ala Lys Thr Gln Lys245<210>3<211>747<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(747)<400>3atg aaa aag cgc gtt ctc gcc ctc tgc ctg gcc agt ttc ttc tcc gtt 48Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Phe Phe Ser Val1 5 10 15aac gcc ttt gct ctg gtt ccc ccc ggg aac gat gtc acc acc aag ccc 96
Asn Ala Phe Ala Leu Val Pro Pro Gly Asn Asp Va1 Thr Thr Lys Pro20 25 30gat ctc tac tat ctg acc aat gcc cag gcc atc gat agc ctg gcg ctg 144Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Asn Ala Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu35 40 45ttg cca cca ccg ccg gcg gtg ggc agt atc gca ttt tta aac gat cag 192Leu Pro Pro Pro Pro Ala Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln50 55 60gcg atg tat gag caa gga cgt ctg ctg cgc aat acc gag cgc ggg aag 240Ala Met Tyr Glu Gln Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys65 70 75 80ctg gcg gca gag gat gct aac ctc aac ttc ggc gac gtg gcc aac gcc 288Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Asn Phe Gly Asp Val Ala Asn Ala85 90 95ttc tcc agc gcc ttt ggt tcg ccg att acc gag aaa gac gcg ccg cag 336Phe Ser Ser Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Gln100 105 110ctt cac aaa ctg ctg acc aat atg att gaa gac gcc ggc gac ctg gcg 384Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met lle Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala115 120 125acc cgc agc gcg aaa gag aaa tac atg cgc att cgc ccg ttt gcg ttc 432Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe130 135 140tat ggc gtc tcc acc tgc aac acc acc gaa cag gac aag ctg gcg aaa 480Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ala Lys145 150 155 160aac ggc tct tac ccg tcc ggg cat acc tct acc ggc tgg gcc acc gcc 528Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Thr Gly Trp Ala Thr Ala
165 170 175ctg gtg ctg gcg gag atc aac ccg cag cgg caa aac gaa att ttg aag 576Leu Val Leu Ala Glu lle Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu lle Leu Lys180 185 190cgc ggc tat gag ctc ggc gag agc cgg gtg atc tgc ggc tat cac tgg 624Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp195 200 205cag agc gat gtc gat gcg gcg cgc atc gtc ggc tcc gcg gtg gtc gct 672Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val Val Ala210 215 220acg ctg cac acc aac ccg gcc ttc cag cag cag ttg cag aaa gcc aaa 720Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys225 230 235 240gat gaa ttc gcc aaa acg cag aag taa 747Asp Glu Phe Ala Lys Thr Gln Lys245<210>4<211>248<212>PRT<213>人工序列<400>4Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Phe Phe Ser Val1 5 10 15Asn Ala Phe Ala Leu Val Pro Pro Gly Asn Asp Val Thr Thr Lys Pro20 25 30Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Asn Ala Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu35 40 45
Leu Pro Pro Pro Pro Ala Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln50 55 60Ala Met Tyr Glu Gln Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys65 70 75 80Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Asn Phe Gly Asp Val Ala Asn Ala85 90 95Phe Ser Ser Ala Phe Gly Ser Pro lle Thr Glu Lys Asp Ala Pro Gln100 105 110Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala115 120 125Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe130 135 140Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ala Lys145 150 155 160Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Thr Gly Trp Ala Thr Ala165 170 175Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys180 185 190Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp195 200 205Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val Va1 Ala210 215 220Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys225 230 235 240Asp Glu Phe Ala Lys Thr Gln Lys245<210>5
<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>5cgggatccca tgaaaaagcg cgttctcgcc ctctg 35<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>7ctaacctcag cttcggcgac gtggc 25<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>8gccacgtcgc cgaagctgag gttag 25<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>9gcatacctct accggctggg ccac 24<210>10
<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>10gtggcccagc cggtagaggt atgc 2權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)5’-呈味核苷酸的方法，其特征在于包括如下步驟1.1利用重組DNA技術(shù)，構(gòu)建酸性磷酸酶表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到高效表達(dá)酸性磷酸酶的基因工程菌；1.2酸性磷酸酶基因的突變與篩選對(duì)核苷具有較高親和性的酸性磷酸酶；1.3以酸性磷酸酶催化核苷與磷酸基團(tuán)供體合成5’-核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1.1中所述的酸性磷酸酶來(lái)源于產(chǎn)氣腸桿菌，其核苷酸序列為SEQ.ID.NO.1，氨基酸序列為SEQ.ID.NO.2。
3.一種突變型的酸性磷酸酶，其特征在于其核苷酸序列為SEQ.ID.NO.3，氨基酸序列為SEQ.ID.NO.4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1.3所述的核苷為嘌呤核苷或嘧啶核苷之一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1.3所述的磷酸基團(tuán)供體為多磷酸或其鹽，苯磷酸或其鹽，氨甲酰磷酸或其鹽，乙酰磷酸或其鹽之一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1.3中反應(yīng)溫度為20-50℃，緩沖液的pH值為2.5-6，反應(yīng)底物中核苷濃度為10-200mM，磷酸基團(tuán)供體濃度為核苷濃度的1-10倍，反應(yīng)時(shí)間為1-20小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明屬于生化工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以DNA重組技術(shù)構(gòu)建基因工程菌，對(duì)該基因工程菌進(jìn)行突變篩選，并利用高活性基因工程菌生產(chǎn)5’－核苷酸的方法。包括如下步驟1.利用重組DNA技術(shù)，構(gòu)建酸性磷酸酶表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到高效表達(dá)酸性磷酸酶的基因工程菌。2.酸性磷酸酶基因的突變與對(duì)核苷具有較高親和性的酸性磷酸酶的篩選。3.以酸性磷酸酶催化核苷與磷酸基團(tuán)供體合成5’－核苷酸。利用本發(fā)明的方法催化合成5’－核苷酸，具有簡(jiǎn)單，高效，周期短，低成本，符合環(huán)保要求等特點(diǎn)，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P19/30GK101063126SQ20071003863
公開(kāi)日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2007年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月29日
發(fā)明者梁勝華 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)