專利名稱：腺苷脫氨酶診斷試劑盒及腺苷脫氨酶活性濃度測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種腺苷脫氨酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定腺苷脫 氨酶活性濃度的方法，屬于醫(yī)學檢驗測定技術領域。
技術背景醫(yī)學研究表明，腺苷脫氨酶是一種與機體細胞免疫活性有重要關系的核 酸代謝酶。因此，腺苷脫氨酶活性的測定被作為良惡性胸腹水，腦脊液鑒別診斷，重癥聯合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病 鑒別的重要診斷標志。腺苷脫氨酶的活性測定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。據 申請人:了解，目前國際上普遍采用紫外光法，其測定原理是腺苷(白色結 晶粉末)+水(H20 )腺苷脫氨酶肌苷(Inosine ) +氨離子(NH/)，此反 映過程生成的肌苷會在波長為265nm處顯現，因此可以通過測定此波長處吸 光度的大小直接反映腺苷脫氨酶活性的大小。然而，此方法無法用一般醫(yī)院 的可見光分析儀測定，而需要使用專門的紫外光分析儀，因此難以切實推廣 應用。發(fā)明內容本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，連續(xù)監(jiān)測還 原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定腺 苷脫氨酶活性濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現該方法的腺苷脫 氨酶診斷試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行腺苷脫氨酶活性濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因 而可以得到切實的推廣應用。本發(fā)明腺苷脫氨酶活性濃度測定方法原理如下 腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子 氨離子+丙酮酸+吲哚色氨酸酶色氨酸+水 色氨酸多巴脫羧酶色胺+ 二氧化碳 二氧化碳+乙酰輔酶八+還原型輔酶丙酮酸脫氫酶丙酮酸+輔酶A+輔酶這種方法應用腺苷脫氨酶(Adenosine deaminase; EC 3.5.4.4)酶(偶)聯色 氨酸酶(tryptophanase; EC 4.1.99.1)、多巴脫羧酶(DOPAdecarboxylase; EC 4.1.1.28)、丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase ; EC 1.2.1.51)酶促反應連 續(xù)監(jiān)測法。腺苷脫氨酶酶解腺苷反應產生P1，再通過(偶)聯合色氨酸酶、 多巴脫羧酶、丙酮酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收 峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在 340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測 算腺苷脫氨酶的活性濃度大小。實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無 論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發(fā)明腺苷脫氨酶診斷試劑較為 理想緩沖液 lOOmmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/L丙酮酸 15mmol/L 口引哚 10 mmol/L乙酰輔酶A 20 mmol/L色氨酸酶 10000 U/L多巴脫羧酶 10000 U/L丙酮酸脫氫酶 12000 U/L本發(fā)明的腺苷脫氨酶診斷試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸酶、多巴脫羧酶、丙酮酸脫氫 酶、腺苷、丙酮酸、吲哚、乙酰輔酶A。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試 劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷、丙酮酸、吲哚、乙酰輔酶A。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸酶、多巴脫羧酶、丙酮酸脫氫酶。 還原型輔酶、色氨酸酶、多巴脫羧酶、丙酮酸脫氫酶、腺苷、丙酮酸、吲 哚、乙酰輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀 態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑-試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷、丙酮酸、吲哚、乙酰輔酶A。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、多巴脫羧酶、丙酮酸脫氫酶。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸酶。還原型輔酶、色氨酸酶、多巴脫羧酶、丙酮酸脫氫酶、腺苷、丙酮酸、吲 哚、乙酰輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以 是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定腺苷脫氨酶活性濃度的方法，其 還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 500 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/L腺苷 5 mmol/L丙酮酸 15mmol/LB引哚 10mmol/L乙酰輔酶A 20 mmol/L色氨酸酶 10000 U/L多巴脫羧酶 10000 U/L
丙酮酸脫氫酶 12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前， 加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光度 1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測腺苷脫氨酶樣品與試 劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約1分鐘 左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值一4180。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性濃 度大小。 實施例二
本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為雙試劑，包括-
試劑l
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
腺苷 5 mmol/L
丙酮酸 15mmol/L
剛哚 10mmol/L
乙酰輔酶A 20 mmol/L 試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
訓mmol/L
穩(wěn)定劑 500 mmol/L
色氨酸酶 10000U/L 多巴脫羧酶 10000 U/L
丙酮酸脫氫酶 12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光度 1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測腺苷脫氨酶樣品與試 劑1、試劑2的體積比例為2/20/5,反應方向為負反應(下降反應)，延遲時 間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值一2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性濃 度大小。 實施例三
本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為三試劑，包括
試劑l
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
腺苷
丙酮酸 U引哚
100 mmol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 5 mmol/L 15 mmol/L 10 mmol/L
10乙酰輔酶A
20 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
多巴脫羧酶
100mmol/L
500 mmol/L
10000U/L
丙酮酸脫氫酶
12000U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
畫mmol/L 500 mmol/L 畫00U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定腺苷脫氨酶活性濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反 應時間IO分鐘，起始吸光度1.8士0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測腺苷脫氨酶樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應 方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右， 理論K值一2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性濃 度大小。
申請人經過實驗驗證，采用以上發(fā)明內容中記載的其他各種還原型色原 體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不
另一一例舉?？傊瑢嶒炞C明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器 得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應用。
權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯法技術的腺苷脫氨酶活性濃度測定方法，其方法原理如下腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子氨離子+丙酮酸+吲哚色氨酸酶色氨酸+水色氨酸多巴脫羧酶色胺+二氧化碳二氧化碳+乙酰輔酶A+還原型輔酶丙酮酸脫氫酶 丙酮酸+輔酶A+輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小結果。
2. —種腺苷脫氨酶診斷試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——4000 mmol/L還原型輔酶 0.1——0.35 mmol/L腺苷 1- 50mmol/L丙酮酸 1——50mmol/LH引哚 1——50mmol/L乙酰輔酶A 1——50mmol/L色氨酸酶 1000——80000 U/L多巴脫羧酶 1000——80000 U/L丙酮酸脫氫酶 1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以 配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸酶、多巴脫羧酶、丙酮酸脫氫酶、 腺苷、丙酮酸、吲哚、乙酰輔酶A組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸酶、多巴脫羧酶、丙酮酸脫氫酶、 腺苷、丙酮酸、吲哚、乙酰輔酶A組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn) 定劑、還原型輔酶、腺苷、丙酮酸、吲哚、乙酰輔酶A組成；試劑2，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸酶、多巴脫羧酶、丙酮酸脫氫酶組成。還原型輔 酶、色氨酸酶、多巴脫羧酶、丙酮酸脫氫酶、腺苷、丙酮酸、。引哚、乙酰 輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸酶、多巴脫羧酶、丙酮酸脫氫酶、腺苷、丙酮酸、吲哚、乙酰輔酶A組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn) 定劑、還原型輔酶、腺苷、丙酮酸、吲哚、乙酰輔酶A組成；試劑2，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、多巴脫羧酶、丙酮酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、 穩(wěn)定劑、色氨酸酶組成。還原型輔酶、色氨酸酶、多巴脫羧酶、丙酮酸脫 氫酶、腺苷、丙酮酸、吲哚、乙酰輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的 位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 l"4000mmol/L或0.1。/()-100。/()體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的腺苷脫氨酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定腺苷脫氨酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、腺苷、丙酮酸、吲哚、乙酰輔酶A、色氨酸酶、多巴脫羧酶、丙酮酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小。
文檔編號C12Q1/26GK101324563SQ20071002323
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優(yōu)先權日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請人:沈麗華