專利名稱：由玉米漿發(fā)酵-酶催化法合成7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物酶工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及制備和提純7-氨基-3-脫乙酰氧基頭 孢垸酸(7-ADCA)的生物合成方法。
背景技術(shù)：
頭孢菌素類抗生素是P-內(nèi)酰胺抗生素的重要一種。起初，是由產(chǎn)黃支頂孢 (Acremonium chrysogenum)天然產(chǎn)生。近年來，主要通過人工合成法來獲取。 7_氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸(7-ADCA)是合成頭孢菌素類抗生素的關(guān)鍵母核， 通過人工合成方法來制取7-ADCA，再進(jìn)一步合成頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢克 羅、頭孢他美酯和頭孢羥氨芐等多種頭孢素類抗生素。7-ADCA的合成方法主要 有化學(xué)合成法、半合成法和生物合成法。
目前，化學(xué)合成和半合成法仍是合成7-ADCA主要方法EP0169144 (1986) 介紹，以青霉素G鉀為原料，經(jīng)過氧化、?；U(kuò)環(huán)、水解和裂解等反應(yīng)過程 而制得7-ADCA。 CN1201795A介紹，以青霉素鉀鹽為原料，經(jīng)氧化、硅酯化、環(huán) 裂、分子重排、環(huán)合、水解和再裂解等反應(yīng)合成7-ADCA。由于化學(xué)合成法的步 驟復(fù)雜、反應(yīng)條件要求高，特別是裂解等過程采用了較高的溫度，使得產(chǎn)品質(zhì) 量差和成本高，也帶來環(huán)保的問題，因此，人們又采用了化學(xué)與生物合成相結(jié) 合的半合成法。將化學(xué)合成的裂解等反應(yīng)過程改為酶催化法，這樣可以使化學(xué) 合成中的一些不利反應(yīng)得到一定程度的改進(jìn)。如張玉祥等，"7-氨基去乙酰氧基 頭孢烷酸的合成研究"(中國抗生素雜志，2000， 25巻，178-180);曲紅梅等， "從青霉素G生產(chǎn)7-氨基脫乙酰氧基頭孢烷酸"(中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2000， 8 巻)。
生物合成法是近年發(fā)展起來的制備7-ADCA的方法，又有兩重方法。其一， 是以青霉素G鉀為原料，使用擴(kuò)環(huán)酶和?；复呋ㄖ迫?-ADCA，如，CN1807581A 介紹，產(chǎn)黃青霉菌及其在生產(chǎn)7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸的應(yīng)用。另一種是 發(fā)酵法，以青霉素為原料，經(jīng)過發(fā)酵法實母A擴(kuò)環(huán)，經(jīng)?；D(zhuǎn)移酶裂解等過程制 備7-ADCA。如，CN1840687A介紹，將耷霉素、水、發(fā)酵酶、營養(yǎng)液等，放在一起發(fā)酵，用有機(jī)溶劑萃取，再經(jīng)裂解、脫色和結(jié)晶等過程制取7-ADCA。CN1840687A 介紹，7-氨基-3-去乙酰氧基頭孢烷酸的發(fā)酵直通生產(chǎn)方法，是以青霉素為原料， 與水、發(fā)酵消泡劑、發(fā)酵酶、營養(yǎng)液一起發(fā)酵，再經(jīng)萃取、裂解、脫色和結(jié)晶 等過程而制取7-ADCA。各種方法幾乎都是用青霉素G鉀為原料，采用各種方法 合成7-ADCA。
如今，化學(xué)法合成7-ADCA,已經(jīng)逐步被淘汰。半合成法、生物合成法已經(jīng)被 普遍采用，特別是發(fā)酵法是被普遍看好的新方法。國內(nèi)也已經(jīng)引進(jìn)了半合成法 和生物合成法，還都是以青霉素G鉀為原料，生產(chǎn)成本比較高，同時，關(guān)鍵的 固定化酶等還主要依賴進(jìn)口，而發(fā)酵法的工藝技術(shù)還沒有達(dá)到工業(yè)化的水平。
在現(xiàn)代化生物工程領(lǐng)域中，膜分離技術(shù)的應(yīng)用越來越受到關(guān)注，因為膜分離 設(shè)備，可以很好地將大分子和小分子物質(zhì)分離開，而且作為催化劑的大分子物 質(zhì)(酶分子)和細(xì)胞的活性損失較小，可以進(jìn)行反復(fù)使用。膜分離技術(shù)還可以 應(yīng)用到酶催化反應(yīng)后的廢水處理，可以用很低的成本，達(dá)到很好的處理效果。 膜分離技術(shù)操作簡單，成本低，容易實現(xiàn)連續(xù)化操作。這為發(fā)酵法制備7-ADCA 提供了強(qiáng)有力的援助，說明該技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用時機(jī)己經(jīng)成熟。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種發(fā)酵-酶催化法合成7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢 烷酸的方法以玉米漿為原料，用帶棒鏈霉菌(Str印tomyces clavuligerus) 的擴(kuò)環(huán)酶基因，對玉米漿進(jìn)行菌株轉(zhuǎn)化，使其在培養(yǎng)基中發(fā)酵，并在培養(yǎng)基中 加入苯乙酸，玉米漿經(jīng)擴(kuò)環(huán)和與苯乙酸作用后，生成苯乙?；?7-ADCA。用乙酸 丁酯萃取發(fā)酵液，得到苯乙?；?7-ADCA的萃取溶液。用水反萃取上述溶液，又 得到苯乙酰基-7-ADCA的水溶液。在該水溶液中加入?；D(zhuǎn)移酶和營養(yǎng)液構(gòu)成酶 反應(yīng)培養(yǎng)基，在適宜的工藝條件下，苯乙?；?7-ADCA經(jīng)脫苯乙?；鶄?cè)鏈，而得 到7-ADCA。
采用發(fā)酵-酶催化的生物合成法，包括種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)基的培 養(yǎng)、酶反應(yīng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)、有機(jī)溶劑萃取、水反萃取、酶催化脫?；?、萃取結(jié) 品和重結(jié)晶等過程。其中，種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)過程，就是擴(kuò)環(huán)菌的轉(zhuǎn)錄和發(fā)酵 過程。本發(fā)明通過下述方法實現(xiàn)的
1、 種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)將帶棒鏈霉菌(Str印tomyces clavuligerus)的 擴(kuò)環(huán)酶基因，接種于種子培養(yǎng)基中，經(jīng)調(diào)培養(yǎng)基的pH值，消毒后，放于旋轉(zhuǎn)搖 床，控制一定的溫度、轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)時間，即可收獲種子培養(yǎng)基。
種子培養(yǎng)基的組成(g/1)為葡萄糖15 25; (NH》2S0 20~30; KH.iU 0.2-1.0;乳糖30 60; CaCO:, 5~10;玉米漿10~30;棉子粉5~20。另外，加入 0.1~0.3的發(fā)酵粉，可以獲得更快的發(fā)酵速度。
帶棒鏈霉菌與培養(yǎng)基的用量比例為1: 150~300;接種表達(dá)量為106~101()分 生孢子/ml;在消毒前，要嚴(yán)格調(diào)培養(yǎng)基的pH，其范圍為5 6;培養(yǎng)溫度控制在 20~30°C，最適宜溫度為25 28'C;培養(yǎng)時間為48~72小時；旋轉(zhuǎn)搖床的轉(zhuǎn)速為 220轉(zhuǎn)/分。
2、 發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)將種子培養(yǎng)基，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，經(jīng)調(diào)培養(yǎng)基 的pH值，消毒后，控制轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間，即可收獲發(fā)酵培養(yǎng)基。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/1)為葡萄糖10 15; (NH4) 2S04 12~20; KH2P04 0.3-0.80;乳糖50-70; CaC03 6~10;玉米漿15-25;棉子粉10~20。以1: 10 在發(fā)酵液中加入15%的苯乙酸溶液。另外，加入O. 1~0.2的發(fā)酵粉，可以獲得更 快的發(fā)酵速度。
種子培養(yǎng)基的接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基的3% 8%;在消毒前，要嚴(yán)格調(diào)培養(yǎng)基 的pH，其范圍為5.5 6.5;培養(yǎng)溫度控制在22 3(TC，最適宜溫度為25~27°C; 培養(yǎng)時間為144-192小時；轉(zhuǎn)速為30轉(zhuǎn)/分。
3、有機(jī)溶劑萃取發(fā)酵液收獲后，調(diào)溶液pH2.3 4.6，使用有機(jī)溶劑萃取 發(fā)酵液，按照體積比有機(jī)溶劑發(fā)酵液=1: 10~20加入有機(jī)溶劑，得到含苯 乙酰基-7-ADCA的有機(jī)溶萃取溶液。萃取液可以使用活性炭脫色。所使用的 有機(jī)溶劑可以是乙酸丁酯、醋酸乙酯，或二甲垸。
4、 水反萃取以水為溶劑萃取上述有機(jī)萃取液，用水有機(jī)萃取液=5 10:
1，反萃取上述脫色后的有機(jī)萃取液。所得水相可以直接進(jìn)入下一工段一酶催
化脫苯乙?；?。萃取前需要調(diào)pH7.4 8.9。所使用的堿為氫氧化鉀水溶液，其 濃度為15 25%。
5、 酶反應(yīng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)和酶滟化脫苯乙?；鶎⑸鲜鏊摧腿∫海脕A5% 氨氣化評溶液，調(diào)pl16. 5 7.r〕，加入(g'/l):葡萄糖，10 20: (NH4) 2S04， 5 15; KH2P04， 0. 1 0. 7;乳糖，10 20; CaC0" 2 5;?；D(zhuǎn)移酶，0. 1 0. 3。 在消毒前，培養(yǎng)基pH為6.2 6.9。將該培養(yǎng)基密閉，在35"C 45'C、 30轉(zhuǎn)/ 分下生化反應(yīng)48 72小時。
6、萃取結(jié)晶和重結(jié)晶酶催化反應(yīng)液收獲后，調(diào)pH2.5 5.0，用有機(jī)溶 劑萃取反應(yīng)液。將有機(jī)萃取液冷卻結(jié)晶，得到7-ADCA粗品，再經(jīng)有機(jī)溶劑重 結(jié)晶得到7-ADCA產(chǎn)品。有機(jī)溶劑可以是乙酸丁酯、乙酸乙酯、二氯甲烷，其 使用量為酶催化液有機(jī)溶劑二l: 5 20。重結(jié)晶使用乙酸乙酯+石油醚，按體 積比l: 4混合使用。
具體實施例方式
實例1
種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)將lml帶棒鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)的 擴(kuò)環(huán)霉株以108分生孢子/ml，接種于下列組成的種子培養(yǎng)基中(g/1):葡萄糖 23; (NH4) 2S04 25; KH2P04 0.7;乳糖50; CaC03 6;玉米漿10;棉子粉10; 加水100ml。在消毒前，調(diào)培養(yǎng)基pH為5.3。將種子培養(yǎng)基密閉，在25。C、 220 轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)搖床振蕩培養(yǎng)48小時。
發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基，按5%的接種量轉(zhuǎn)種發(fā)酵培養(yǎng) 基中(g/1):葡萄糖10; (NH》2S04 16; KH2P(^ 0.5;乳糖60; CaC03 9;玉
米漿20;棉子粉15;其它為水。消毒前，調(diào)培養(yǎng)基pH為6.2。接種后，以l:
10在發(fā)酵液中加入15%的苯乙酸溶液，在25。C、 30轉(zhuǎn)/分下培養(yǎng)168小時，每 隔一天補(bǔ)充一次蒸發(fā)掉的水。
有機(jī)溶劑萃取發(fā)酵液收獲后，用過濾機(jī)除去絲菌狀體，在濾液中加入乙
酸丁酯(1: 15)萃取其中的苯乙酰基-7-ADCA。所得萃取液顏色比較深，可加
入藥用活性炭進(jìn)行脫色。
水反萃取用8: 1的水反萃取上述脫色后的有機(jī)萃取液。所得水相可以直 接進(jìn)入下一工段一酶催化脫苯乙?；?。
酶催化脫苯乙酰基將上述水反萃取液，用15%氫氧化鉀溶液，調(diào)pH6.5 7.5，加入酶反應(yīng)培養(yǎng)基中(g/1):葡萄糖16;(NH》2S〔、9; ,0+0.47; 乳糖30; CaCO, 5;?；D(zhuǎn)移酶O. 2。消毒前，調(diào)培養(yǎng)基pH為6.8。在35°C 45°C、 30轉(zhuǎn)/分下反應(yīng)48小時。萃取結(jié)晶和重結(jié)晶待生化反應(yīng)結(jié)束后，用過濾機(jī)除去?；D(zhuǎn)移酶，在濾
液中加入乙酸丁酯(1: 25)萃取其中的7-ADCA。所得萃取液顏色比較深，可加
入藥用活性炭進(jìn)行脫色。將萃取液冷卻結(jié)晶，得到粗品，再經(jīng)重結(jié)晶得到成品
(mp. 232. 3 233. 8°C;含量99.3%;表達(dá)量5. 38g/l)。 實例2
種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)將將帶棒鏈霉菌(Str印tomycesclavuligerus)的擴(kuò) 環(huán)霉株以109分生孢子/1111，接種于下列組成的種子培養(yǎng)基中(g/l):葡萄糖， 20; (NH4)2S04， 18; KH2P04， 0.5;乳糖，30; CaCO:,， 5;玉米漿，15; Pha歷media (棉子粉)，12;其它為水。在消毒前，培養(yǎng)基pH為5.3。將種子培養(yǎng)基密閉， 在27。C、 220轉(zhuǎn)/分下孵育42小時。
發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)將上述種子培養(yǎng)基，按l: 18的體積比，接種到下列 組成的生產(chǎn)培養(yǎng)基中(g/l):葡萄糖，15; (NH4)2S04， 11; KH2P04， 0.6;乳糖，
23; CaCO:,， 6;玉米漿，25; Pharmamedia (棉子粉)，10;其它為水。在消毒 前，培養(yǎng)基pH為6.5。用將種子培養(yǎng)基接種后，在發(fā)酵液中加入15°/。的苯乙酸 溶液l: 15。密閉，在25'C、 30轉(zhuǎn)/分下培育144小時，每隔一天補(bǔ)充一次蒸 發(fā)掉的水。
有機(jī)溶劑萃取發(fā)酵結(jié)束后，用過濾機(jī)除去絲菌狀體，在濾液中加入乙酸 丁酯(1: 22)萃取其中的苯乙酰基-7-ADCA。所得萃取液顏色比較深，可加入 藥用活性炭進(jìn)行脫色。
水反萃取用10: 1的水反萃取上述脫色后的有機(jī)萃取液。所得水相可以
直接進(jìn)入下一工段一酶催化脫苯乙酰基。
酶催化脫苯乙酰基將上述水反萃取液，用15%氫氧化鉀溶液，調(diào)pH6.9，
加入(g/l):葡萄糖，12; (MU m， 9; KH2P04， 0.35;乳糖，10; CaCO:,， 3;
Pharmamedia (棉子粉)，5;?；D(zhuǎn)移酶，0.3。在消毒前，培養(yǎng)基pH為6. 3。 將該培養(yǎng)基密閉，在35'C 45。C、 30轉(zhuǎn)/分下生化反應(yīng)528小時。
萃取結(jié)晶和重結(jié)晶待生化反應(yīng)結(jié)束后，用過濾機(jī)除去?；D(zhuǎn)移酶，在濾
液中加入乙酸丁酯(1: 20)萃取其中的7-ADCA。所得萃取液顏色比較深，可 加入藥用活性炭進(jìn)行脫色。將萃取液冷卻結(jié)晶，得到粗品，再經(jīng)重結(jié)晶得到成 品(mp. 232. 5 233.8。C;含量99.2%;表達(dá)量6. 26g/l)。
權(quán)利要求
1、一種由玉米漿發(fā)酵-酶催化法合成7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸(7-ADCA)的方法，包括(1)用帶有擴(kuò)環(huán)酶基因的棒狀鏈霉菌，對玉米漿進(jìn)行菌株轉(zhuǎn)化，在培養(yǎng)基中發(fā)酵實現(xiàn)擴(kuò)環(huán)，并與加入培養(yǎng)基中的苯乙酸作用，生成苯乙?；?7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸。(2)通過有機(jī)溶劑萃取和水反萃取，獲得苯乙酰基-7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸的水溶液。(3)在水反萃取的溶液中加入乙酰轉(zhuǎn)移酶，脫除側(cè)鏈制得7-氨基-3-乙酰氧基頭孢烷酸。(4)使用有機(jī)溶劑萃取酶催化脫酰后的水溶液，經(jīng)結(jié)晶和重結(jié)晶獲得7-ADCA。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中(1)擴(kuò)環(huán)酶來自帶棒鏈霉菌(Str印tomyces clavuligerus)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中(2)步的有機(jī)溶劑是'.乙酸丁酯，或乙酸 乙酯，或二氯甲垸。萃取為pH2.3 4.6的酸性溶液，有機(jī)溶劑與發(fā)酵液 的體積比為h 5 15。水反萃取為pH7. 4 8. 9的堿性溶液，水與生化反 應(yīng)液的體積比為10 5: 1。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中(3)中乙酰轉(zhuǎn)移酶為IPA-750，是通過培 養(yǎng)大腸桿菌基因工程菌和固定化菌。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中(4)步使用的有機(jī)溶劑是乙酸丁酯，或 乙酸乙酯，或二甲垸。重結(jié)晶使用的為組合有機(jī)溶劑乙酸乙酯+石油醚，配比為1: 3 5。
全文摘要
用帶有擴(kuò)環(huán)酶基因的棒狀鏈酶菌，對玉米漿進(jìn)行菌株轉(zhuǎn)化，使玉米漿在培養(yǎng)基中發(fā)酵擴(kuò)環(huán)，并與加入培養(yǎng)基中的苯乙酸作用，生成苯乙酰基-7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸。通過有機(jī)溶劑萃取和水反萃取，獲得苯乙?；?7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸的水溶液。在該水溶液中加入乙酰轉(zhuǎn)移酶和營養(yǎng)成分構(gòu)成酶反應(yīng)培養(yǎng)基，并在適宜的條件下完成生化反應(yīng)，脫除側(cè)鏈制得7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸。
文檔編號C12P33/00GK101285089SQ20071002134
公開日2008年10月15日 申請日期2007年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月9日
發(fā)明者周偉軍, 周平江, 李桂根, 李維泉, 健 王, 王友志, 王圣良, 王玉成, 王理想, 王靜康, 曉 胡, 紅 趙, 路一飛 申請人:徐州瑞賽科技實業(yè)有限公司