專利名稱：魚類異源冷凍精子誘導(dǎo)雌核發(fā)育的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于魚類遺傳育種技術(shù)，是一種采用異源冷凍精子培育魚類雌核發(fā)育二倍體的方法，可應(yīng)用于魚類性別控制和全雌苗種的生產(chǎn)。

背景技術(shù)：
許多魚類在生長(zhǎng)速率上存在雌雄差異。例如，羅非魚雄性個(gè)體生長(zhǎng)比雌性個(gè)體快50％以上，而許多海水鲆鰈魚類的雌性個(gè)體生長(zhǎng)比雄性個(gè)體快許多，如星鰈和大西洋牙鲆等鲆鰈魚類雌性個(gè)體生長(zhǎng)比雄性個(gè)體快50-100％。由于雄性個(gè)體生長(zhǎng)過慢，降低了這些鲆鰈魚類的養(yǎng)殖產(chǎn)量和養(yǎng)殖效益，增加了養(yǎng)殖成本，嚴(yán)重影響了這些魚類苗種的推廣和養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的形成，因此，對(duì)這些魚類開展雌核發(fā)育技術(shù)的研究、研制全雌群體，在漁業(yè)生產(chǎn)中推廣應(yīng)用全雌苗種，對(duì)于提高這些魚類的養(yǎng)殖產(chǎn)量和商品價(jià)值，非常重要，同時(shí)，全雌苗種的推廣必將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
雌核發(fā)育是單性生殖的一種，指卵子依靠自身的遺傳物質(zhì)發(fā)育成個(gè)體的生殖行為。雌核發(fā)育現(xiàn)象最早發(fā)現(xiàn)于天然魚類阿馬遜花鳉(Poeciliaformosa)，分布于我國(guó)的方正銀鯽、彭澤鯽等也屬于天然雌核發(fā)育魚類。
目前國(guó)內(nèi)，對(duì)銀鯽天然雌核發(fā)育機(jī)理進(jìn)行了大量的研究(中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，桂建芳等，1996)，最早在鯉魚上建立了雌核發(fā)育技術(shù)(中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，吳清江，1981)；迄今，在淡水魚類雌核發(fā)育的研究中，通常采用同源新鮮精液進(jìn)行刺激，誘導(dǎo)雌核發(fā)育二倍體的產(chǎn)生(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，潘光碧等，1995)。但由于同源精子來源于同一種魚類，其染色體數(shù)量相同，因而同源精子誘導(dǎo)存在精子失活不完全、雌核發(fā)育苗與正常受精來源的魚苗難以鑒別等問題，因而影響了雌核發(fā)育技術(shù)的應(yīng)用效果，影響了全雌魚類苗種的培育。因此，探索采用染色體數(shù)量不相同的異源魚類精子進(jìn)行魚類雌核發(fā)育的誘導(dǎo)，將具有更大的實(shí)用性和應(yīng)用價(jià)值。
由于不同魚類的繁殖期不同，所以很難采用異源魚類的新鮮精液進(jìn)行雌核發(fā)育的誘導(dǎo)，因此，我們采用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，對(duì)異源魚類精子進(jìn)行冷凍保存，待需要時(shí)進(jìn)行解凍，用于魚類卵子雌核發(fā)育的誘導(dǎo)，則可以克服上述諸多問題，使魚類雌核發(fā)育變得簡(jiǎn)便易行，有利于進(jìn)行推廣應(yīng)用，因而成為國(guó)際上的發(fā)展趨勢(shì)。有關(guān)魚類異源冷凍精子誘導(dǎo)的雌核發(fā)育研究，目前國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是采用遺傳失活的異源冷凍精子誘導(dǎo)魚類卵子進(jìn)行雌核發(fā)育，并在適宜的時(shí)期對(duì)授精卵進(jìn)行染色體加倍處理，以阻止卵的第二極體排出，使雌核發(fā)育卵的染色體加倍，發(fā)育成具有活力的雌核發(fā)育二倍體魚苗。
本發(fā)明其技術(shù)內(nèi)容如下 包括三個(gè)方面一、異源魚類冷凍精子的遺傳失活；二、雌核發(fā)育二倍體魚苗的誘導(dǎo)；三、雌核發(fā)育魚苗的鑒定。
一、異源魚類冷凍精子的遺傳失活它的技術(shù)內(nèi)容包括1、適宜的異源精子的選擇；2、異源精子的冷凍保存和解凍；3、異源冷凍精子的遺傳失活 1、適宜的異源魚類精子的選擇 首先，通過染色體分析比較，盡量選取染色體數(shù)量不同的魚類精子作為雌核發(fā)育用精子；其次，采用多種魚類精子分別同擬誘導(dǎo)雌核發(fā)育的魚類卵子進(jìn)行雜交授精，觀察受精卵的發(fā)育情況，尋找可以與鲆鰈魚類(條斑星鰈、大菱鲆等)卵受精后胚胎可以發(fā)育至原腸胚、并且受精率較高的魚類精子。通過這種篩選方法，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)花鱸(染色體數(shù)為48條)精子可以刺激多種鲆鰈魚類(條斑星鰈染色體為46條，大菱鲆染色體為44條)卵子進(jìn)行雌核發(fā)育。
2、異源精子的冷凍保存和解凍 在繁殖季節(jié)，選取發(fā)育成熟的花鱸雄魚，用手?jǐn)D壓腹部采集無尿污的精液，利用顯微鏡檢查精子的活力，選擇精子活力在80％以上的精液用于冷凍保存。將精液與4℃預(yù)冷的冷凍稀釋液(配方為KCl 0.39g/L，CaCl2·2H2O 0.17g/L，NaHCO3 0.25g/L，NaCl 3.59g/L，NaH2PO4 0.22g/L，MgCl2 0.23g/L，Glucose 1.0g/L，DMSO 20％)，以體積比1∶1的比例混合后，分裝到2.0ml的冷凍保存管，在4℃冰箱平衡20分鐘后，放入液氮罐口下平衡5分鐘，再在液氮面上平衡5分鐘，最后浸入液氮中冷凍保存。解凍時(shí)，將精液冷凍管從液氮中取出來，先在液氮面上平衡5分鐘，然后將凍精管拿出來在38℃水浴中解凍后備用。
3.異源冷凍精子遺傳物質(zhì)的失活 冷凍精子的遺傳失活采用紫外線照射完成。首先鏡檢解凍后精子的活力，精子活力達(dá)到70％以上者用于紫外線失活處理。吸取100μL冷凍解凍的花鱸精液，置于在6℃預(yù)冷過的直徑為10cm的培養(yǎng)皿中，加入900μL不含DMSO的上述精子冷凍稀釋液進(jìn)行稀釋，搖勻平輔在直徑10厘米的塑料培養(yǎng)皿底部，將裝有冷凍精液的培養(yǎng)皿置于紫外照射儀(UVC500，Pharmacia)中，利用10-80mJ/cm2紫外線照射0.1-0.9min，照射后的精子活力應(yīng)該保持在20-40％左右。
二、雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)它的技術(shù)內(nèi)容包括1、未受精卵的采集及與失活精子的“授精”；2、雌核發(fā)育魚卵冷休克起始時(shí)間的確定；3、雌核發(fā)育魚卵冷休克強(qiáng)度，即處理時(shí)間和溫度的確定。
1.未受精卵的采集及與失活精子的“授精” 選擇性成熟的條斑星鰈、大菱鲆或犬齒牙鲆雌魚，在自然產(chǎn)卵前1h采用人工擠壓腹部法采卵，將卵采入干燥的燒杯中，根據(jù)魚的種類不同，將采集的魚卵置于不同的溫度下，其中條斑星鰈卵放在8℃，大菱鲆卵放在14℃，犬齒牙鲆卵在18℃；將以上經(jīng)過遺傳滅活的花鱸精液加入不同魚的未受精卵中，輕輕搖動(dòng)混勻，加入2倍于卵量的海水完成“授精”過程，海水溫度根據(jù)魚的種類確定，其中條斑星鰈卵授精溫度為8℃，大菱鲆卵放在為14℃，犬齒牙鲆卵為18℃。精液和卵的授精最小體積比為100μL4-8ml，授精過程在250ml燒杯中進(jìn)行。通過遺傳失活的花鱸精子刺激魚卵進(jìn)行雌核發(fā)育。
2.雌核發(fā)育魚卵冷休克起始時(shí)間的確定 根據(jù)雌核發(fā)育魚種類的不同，在“授精”后不同時(shí)間(3，5，7，9，11和13分鐘)，將盛有雌核發(fā)育卵的燒杯浸入0-2℃的海水浴中進(jìn)行冷休克處理，冷休克處理時(shí)間為20-25min，冷休克處理完畢后將卵杯移入8-18℃海水中培養(yǎng)。在雌核發(fā)育魚苗孵化出膜后，計(jì)算雌核發(fā)育誘導(dǎo)率，從而確定適合于不同海水魚類雌核發(fā)育冷休克誘導(dǎo)的有效起始時(shí)間，其有效起始時(shí)間分別為條斑星鰈為7-9分鐘；大菱鲆為4-6分鐘；犬齒牙鲆為3-5分鐘。
3、雌核發(fā)育魚卵冷休克強(qiáng)度，即處理適宜時(shí)間和溫度的確定 雌核發(fā)育魚卵冷休克溫度和冷休克處理時(shí)間，根據(jù)確定的冷休克起始時(shí)間，設(shè)計(jì)試驗(yàn)，將紫外線(UV)處理過的花鱸精子與條斑星鰈、大菱鲆和犬齒牙鲆等魚類鮮卵授精，然后按冷休克溫度和冷休克持續(xù)時(shí)間兩因素進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)魚的種類不同，設(shè)計(jì)的參數(shù)不盡相同；冷休克溫度取-2℃、-1.5℃、-1℃、0℃、1℃、2℃、3℃、4℃等幾個(gè)水平，冷休克持續(xù)時(shí)間取20、30、40、50、60、90和100分鐘等7個(gè)水平，進(jìn)行冷休克處理。
計(jì)數(shù)后代中雌核發(fā)育二倍體產(chǎn)生情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 條斑星鰈雌核發(fā)育卵在-0.5℃到-1.5℃的冷休克下，均能成功誘導(dǎo)出雌核發(fā)育的二倍體條斑星鰈魚苗；而最佳的冷休克處理時(shí)間為60-90min，二倍體雌核發(fā)育魚苗的誘導(dǎo)率為7.8-40.7％。
犬齒牙鲆雌核發(fā)育卵適宜的冷休克溫度為1-2.0℃；冷休克處理的適宜時(shí)間為40-50min，其誘導(dǎo)率明顯高于其他處理組。二倍體雌核發(fā)育魚苗的誘導(dǎo)率為10-25％。
大菱鲆雌核發(fā)育卵的有效冷休克溫度為-1-2℃，冷休克的有效持續(xù)時(shí)間為20-30分鐘。在這些誘導(dǎo)條件下，孵化出雌核發(fā)育二倍體仔魚的比例最高，二倍體雌核發(fā)育魚苗的誘導(dǎo)率為26-34％； 三、雌核發(fā)育魚苗的鑒定它的技術(shù)內(nèi)容包括1.通過染色體數(shù)量和核型鑒定雌核發(fā)育魚苗；2.通過微衛(wèi)星分子標(biāo)記手段鑒定雌核發(fā)育魚苗。
1.染色體分析鑒定雌核發(fā)育魚苗由于花鱸染色體數(shù)目為2n＝48條，其核型為48t；條斑星鰈染色體數(shù)目為2n＝46，其核型為44t+2sm大菱鲆染色體數(shù)目為2n＝44，其核型為2n＝4m+12st+28t，因此花鱸的染色體數(shù)目與這些魚類不相同，通過染色體分析即可證明雌核發(fā)育魚苗是否為雌核發(fā)育而來。如果雌核發(fā)育魚苗的染色體數(shù)目及核型與母本(條斑星鰈、大菱鲆或犬齒牙鲆等)完全相同，則證明這些魚苗是雌核發(fā)育而來。本發(fā)明采用常規(guī)染色體制片方法，對(duì)條斑星鰈、大菱鲆等魚類雌核發(fā)育魚苗進(jìn)行了染色體分析，發(fā)現(xiàn)條斑星鰈雌核發(fā)育魚苗的染色體數(shù)為46條，大菱鲆雌核發(fā)育魚苗的染色體數(shù)為44條，與母本完全相同，從而證明這些魚苗為雌核發(fā)育二倍體個(gè)體。
2.用微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定雌核發(fā)育魚苗； 微衛(wèi)星標(biāo)記具有較高的多態(tài)性，能夠檢測(cè)出種群及個(gè)體間的異質(zhì)性，可以用于檢測(cè)雌核發(fā)育二倍體是否有父方基因表達(dá)及其與母本的遺傳同質(zhì)性；微衛(wèi)星共顯性遺傳的特點(diǎn)使其能夠應(yīng)用于雌核發(fā)育二倍體的純合性研究。因此，我們采用微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定雌核發(fā)育魚苗。
(1).基因組DNA的提取 采取高鹽法提取雌核發(fā)育魚和正常魚基因組DNA，首先將固定于純酒精中的魚苗或魚鰭條置于1.5ml離心管中，剪碎后加入400μlTENS裂解液(10mM Tris-HCl，pH 7.5，400μM NaCl，100mM EDTA，0.6％SDS10mMTris-HCl，PH 7.5，400μM NaCl，100mM EDTA，0.6％SDS)和10μl蛋白酶K(10mg/ml)，然后至于55℃消化。消化完全后，加入140μl飽和氯化鈉，混勻，12000 rpm/min 4℃離心30min。取上清加入兩倍體積預(yù)冷的無水乙醇沉淀，然后將絮狀沉淀挑出后用70％的酒精洗滌兩次，待酒精揮發(fā)干后，用TE(10mMTris-HCl，pH 8.0，10mM EDTA)溶解DNA。
(2)PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為10μl，包括1×PCR buffer[20mMTris-HCl，PH8.4，20mM KCl，10mM(NH4)2SO4]，10-50ng基因組DNA，0.2μM引物，120μMdNTPs，1.5mM MgCl2和0.5U Taq DNA聚合酶(TaKaRa)。PCR擴(kuò)增條件為94℃熱變性5min，然后進(jìn)行38個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30s，56-62℃退火30s，72℃延伸30s，最后在72℃延伸7min。用于雌核發(fā)育犬齒牙鲆檢測(cè)的PCR引物為Pade30，其序列為CGAGGAGGGGAAGAAAGAAC和CACAACCCAAGCGCAACTAT；用于雌核發(fā)育條斑星鰈檢測(cè)的PCR引物為Vmo4，其序列為CACTGTGCCCACTGTCTG和TTTTCCTCTTACTCCCTCTCTT；用于雌核發(fā)育大菱鲆檢測(cè)的微衛(wèi)星引物為SmaC03，其序列為TGGACTGGTTTACTGCTGGA和AGGGAACCGATCTGAGAACA。
(3)聚丙烯酰胺凝膠電泳 在PCR產(chǎn)物中加入1/2體積的甲酰胺上樣液(0.01M EDTA，1mg/ml溴芬藍(lán)，1mg/ml二甲苯青)于95℃變性5分鐘，然后立刻放在冰上。在6％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，以pBR322DNA/Msp I(TIANGEN)為標(biāo)記。采用銀染法染色。
(4)結(jié)果分析 首先通過微衛(wèi)星富集文庫(kù)法構(gòu)建了大西洋牙鲆和條斑星鰈富集文庫(kù)，從中篩選出多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記。然后用這些多態(tài)引物在正常群體和雌核發(fā)育群體中進(jìn)行擴(kuò)增，從中進(jìn)一步篩選出在正常群體里雜合率較高、在雌核發(fā)育群體里純合率較高的引物。經(jīng)過篩選，從犬齒牙鲆微衛(wèi)星富集文庫(kù)中篩選到的微衛(wèi)星引物CGAGGAGGGGAAGAAAGAAC和RCACAACCCAAGCGCAACTAT可以用來鑒定大西洋牙鲆雌核發(fā)育二倍體，該引物在犬齒牙鲆正常魚苗中擴(kuò)增出2條帶(即雜合率)的比例為86％，而在雌核發(fā)育魚苗(12尾)中，有9個(gè)個(gè)體只擴(kuò)增出1條DNA帶，僅有3個(gè)個(gè)體擴(kuò)增出2條DNA帶，雜合率僅為25％，并且在所有檢測(cè)的純合個(gè)體中未見異于正常群體的等位基因，由此可以證明這批魚苗是雌核發(fā)育而來。采用條斑星鰈微衛(wèi)星引物CACTGTGCCCACTGTCTG和TTTTCCTCTTACTCCCTCTCTT擴(kuò)增條斑星鰈正常魚苗(12尾)基因組DNA，其中9個(gè)個(gè)體擴(kuò)增出2條DNA帶，雜合率為75％，而在雌核發(fā)育魚苗(9尾)中，所有個(gè)體都只擴(kuò)增出1條DNA帶，均為純合型，雜合率為0，同樣在所有檢測(cè)的純合個(gè)體中未見異于正常群體的等位基因，由此表明這批魚苗是雌核發(fā)育魚苗。采用大菱鲆微衛(wèi)星引物TGGACTGGTTTACTGCTGGA和AGGGAACCGATCTGAGAACA進(jìn)行雌核發(fā)育大菱鲆檢測(cè)時(shí)，擴(kuò)增大菱鲆正常魚時(shí)，85％以上的魚苗產(chǎn)生2條DNA帶，表現(xiàn)為雜合型，而在雌核發(fā)育魚苗中，75％以上的個(gè)體只產(chǎn)生1條DNA帶，表現(xiàn)為純合型，而只有25％的個(gè)體表現(xiàn)為雜合型。因此可以用于鑒定大菱鲆雌核發(fā)育魚苗。
本發(fā)明與已有技術(shù)對(duì)比其特點(diǎn)是 本發(fā)明篩選到能有效誘導(dǎo)海水魚類進(jìn)行雌核發(fā)育的異源魚類-花鱸精子，建立了采用冷凍保存2年以上的花鱸精子誘導(dǎo)條斑星鰈、大菱鲆和犬齒牙鲆等多種海水魚類卵子進(jìn)行雌核發(fā)育的技術(shù)方法；首次篩選出有效的誘導(dǎo)各種魚類卵子進(jìn)行雌核發(fā)育的技術(shù)參數(shù)；因?yàn)?，花鱸精子與上述魚類卵子雜交后均難以成活，因此，和以往的同源精子誘導(dǎo)方法相比較，本發(fā)明建立的異源冷凍精子誘導(dǎo)魚類雌核發(fā)育的方法具有明顯的創(chuàng)新性，本方法誘導(dǎo)出的個(gè)體均為雌核發(fā)育個(gè)體，不存在雜交二倍體個(gè)體，也不存在同種精子誘導(dǎo)過程中可能出現(xiàn)的精子滅活不完全時(shí)在后代中會(huì)出現(xiàn)正常受精個(gè)體，因此，本方法非常有效和可靠。
本發(fā)明采用長(zhǎng)期冷凍保存的花鱸精子，解決了花鱸繁殖時(shí)間與其它海水魚類因繁殖時(shí)間不同而難以進(jìn)行交配的問題，可以不受時(shí)間限制地為各種魚類雌核發(fā)育研究提供精子材料。
本發(fā)明首次建立了用異源冷凍精子誘導(dǎo)魚類雌核發(fā)育的技術(shù)方法，其特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、實(shí)用性強(qiáng)、易行、安全、可靠等優(yōu)點(diǎn)，為魚類性別控制和單性育種開辟了新的技術(shù)途徑，可推廣應(yīng)用于幾乎所有魚類，可應(yīng)用于魚類性別控制及全雌苗種的生產(chǎn)。

具體實(shí)施例方式 采用遺傳失活的異源冷凍精子刺激卵子，同時(shí)對(duì)雌核發(fā)育卵進(jìn)行冷休克處理，抑制第二極體排出使染色體進(jìn)行加倍，可以成功誘導(dǎo)條斑星鰈、大西洋牙鲆和大菱鲆等鲆鰈魚類的雌核發(fā)育，建立在海水魚類上通用的異源冷凍精子誘導(dǎo)的雌核發(fā)育誘導(dǎo)技術(shù)，對(duì)于這些鲆鰈魚類的性別控制、培育全雌單性苗種，進(jìn)行全雌苗種養(yǎng)殖，提高這些魚類的養(yǎng)殖產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和巨大的推廣應(yīng)用潛力。
下面以條斑星鰈和大菱鲆為例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說明 本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容包括三個(gè)方面一、異源魚類冷凍精子的遺傳失活；二、雌核發(fā)育二倍體魚苗的誘導(dǎo)；三、雌核發(fā)育魚苗的鑒定。
一、異源魚類精子的冷凍保存及遺傳失活；它的技術(shù)內(nèi)容包括1、適宜的異源魚類精子的選擇；2、異源魚類精子的冷凍保存和解凍；3、異源魚類冷凍精子的遺傳失活 1、適宜的異源魚類精子的選擇 首先，通過染色體分析比較，盡量選取染色體數(shù)量不同的魚類精子作為雌核發(fā)育用精子；其次，采用多種魚類精子分別同條斑星鰈卵子進(jìn)行雜交授精，觀察受精卵的發(fā)育情況，尋找可以與條斑星鰈卵受精后胚胎可以發(fā)育至原腸胚以后，并且受精率較高的魚類的精子。通過這種篩選方法，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)花鱸(染色體數(shù)為48條)精子可以刺激條斑星鰈(染色體為46條)卵子進(jìn)行雌核發(fā)育。從表1可見，當(dāng)用未經(jīng)紫外線照射的花鱸精子與條斑星鰈卵子授精后，不進(jìn)行任何處理，這種雜交授精的胚胎只能存活1天(雜交組)；當(dāng)用未經(jīng)紫外線照射的花鱸精子與條斑星鰈卵子授精后，再進(jìn)行冷休克處理時(shí)，這種胚胎也只能存活1天(雜交休克組)；當(dāng)用紫外線(劑量為10-80mJ/cm2，照射時(shí)間為0.1-0.9min)照射過的花鱸精子與條斑星鰈卵進(jìn)行授精時(shí)，授精卵不進(jìn)行冷休克處理，這種胚胎為單倍體，只能存活9天，孵化出的魚苗不能繼續(xù)發(fā)育而死亡(滅活不休克組)；當(dāng)用紫外線照射過的花鱸精子與條斑星鰈卵授精后，再進(jìn)行冷休克處理，胚胎可以正常發(fā)育，孵化出的魚苗可以存活下來(滅活休克組)。
由此表明花鱸精子與條斑星鰈卵子雜交是不育的，而經(jīng)過紫外線遺傳失活的精子是可以誘導(dǎo)條斑星鰈卵雌核發(fā)育的。
表1四種不同滅活和冷休克組合處理?xiàng)l斑星鰈胚胎存活率(％) 注條斑星鰈的胚胎需要孵化7-8天才能孵化出魚苗。
2、花鱸精子的冷凍保存和解凍 在繁殖季節(jié)，選取發(fā)育成熟的花鱸雄魚，注射催產(chǎn)素(1-2μg LRH-A3/kg，20-40UI HCG/kg)后15-20小時(shí)，用手?jǐn)D壓雄魚腹部采集無尿污的精液，利用顯微鏡檢查精子的活力，選擇精子活力在80％以上的精液用于冷凍保存。將精液與在4℃預(yù)冷的抗凍稀釋液-二甲亞砜(DMSO)混合液(配方為KCl 0.39g/L，CaCl2·2H2O 0.17g/L，NaHCO3 0.25g/L，NaCl 3.59g/L，NaH2PO4 0.22g/L，MgCl2 0.23g/L，Glucose 1.0g/L，DMSO 20％)以體積比1∶1的比例混合后，分裝到2.0ml的冷凍保存管，在4℃冰箱平衡20分鐘后，放入液氮罐口下平衡5分鐘，再在液氮面上平衡5分鐘，最后浸入液氮中冷凍保存。解凍時(shí)，將精液冷凍管從液氮中取出來，先在液氮面上平衡5分鐘，然后將凍精管拿出來在38℃水浴中解凍后備用。
3.花鱸冷凍精子遺傳物質(zhì)的失活 冷凍精子的遺傳失活采用紫外線照射完成。首先鏡檢解凍后精子的活力，精子活力達(dá)到70％以上者用于紫外線滅活處理。吸取100μL冷凍解凍的花鱸精液置于在6℃預(yù)冷過的直徑為10cm的培養(yǎng)皿中，加入900μL不含DMSO的上述精子冷凍稀釋液進(jìn)行稀釋，搖勻平輔在直徑10厘米的塑料培養(yǎng)皿底部，將裝有冷凍精液的培養(yǎng)皿置于紫外照射儀(UVC500，Pharmacia)中，利用10mJ/cm2紫外線分別照射0.1-0.9min，每0.1min為1個(gè)梯度，照射后在鏡下檢查其活力，如表1。從表中可以看出，經(jīng)紫外線照射0.3min后精子活力會(huì)大幅度降低，因此選擇照射0.1-0.3min較好，精子活力保持在40-43％較好。
表2冷凍/解凍鱸魚精子經(jīng)紫外線照射后活力(％)(n＝3) 二、雌核發(fā)育二倍體魚苗的誘導(dǎo)；它的技術(shù)內(nèi)容包括1、未受精卵的采集及與失活精子的“授精”；2、雌核發(fā)育魚卵冷休克起始時(shí)間的確定；3、雌核發(fā)育魚卵冷休克強(qiáng)度，即處理時(shí)間和溫度的確定；4、雌核發(fā)育結(jié)果。
(一)、條斑星鰈雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo) 1.未受精卵的采集及與失活精子的“授精”； 在條斑星鰈繁殖季節(jié)(每年1-3月份)，選擇腹部開始膨大的雌性親魚，按照常規(guī)方法，采用溫度刺激方法，誘導(dǎo)親魚成熟時(shí)，將親魚池水溫從18℃逐漸下降，在1.5-2個(gè)月內(nèi)將水溫降到7-8℃，即可誘導(dǎo)雌魚成熟，然后維持在7-8℃，通過注射激素誘導(dǎo)雌魚排卵。在自然產(chǎn)卵前1h采用人工擠壓腹部法采卵，將卵采入干燥的燒杯中，條斑星鰈卵須放在8℃左右存放。然后，將以上經(jīng)過遺傳滅活的花鱸精液加入條斑星鰈的未受精卵中，輕輕搖動(dòng)混勻，加入2倍于卵量的海水完成“授精”過程，海水溫度為8℃。精液和卵的授精最小體積比為100μL4ml，授精過程在250ml燒杯中進(jìn)行。通過遺傳滅活的花鱸冷凍精子刺激魚卵進(jìn)行雌核發(fā)育。在“授精”后1天(原腸期，1dpf)、3天(眼囊期，3dpf)、9天(孵化期，9dpf)和12天(孵化后第3d，12dpf)分別計(jì)數(shù)胚胎或魚.苗的成活率。
2.雌核發(fā)育魚卵冷休克起始時(shí)間的確定； 在“授精”后以不同時(shí)間(3，5，7，9，11和13分鐘)將盛有雌核發(fā)育卵的燒杯浸入0-2℃的海水浴中進(jìn)行冷休克處理，冷休克處理時(shí)間為20-25min，冷休克處理完畢后將卵杯移入8-18℃海水中培養(yǎng)。在雌核發(fā)育魚苗孵化出膜后，計(jì)算雌核發(fā)育誘導(dǎo)率，從而確定適宜條斑星鰈卵冷休克誘導(dǎo)的起始時(shí)間為“授精”后7-9分鐘。
表3不同冷休克起始時(shí)間下條斑星鰈雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)率(％) 3、雌核發(fā)育魚卵冷休克處理適宜時(shí)間和溫度的確定 冷休克強(qiáng)度分為兩個(gè)方面，一是冷休克溫度，二是冷休克處理時(shí)間。根據(jù)確定的冷休克起始時(shí)間，設(shè)計(jì)試驗(yàn)，將UV處理過的花鱸精子與條斑星鰈鮮卵授精，然后按冷休克溫度和冷休克持續(xù)時(shí)間兩因素進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)；冷休克溫度取-2℃、-1.5℃、-1℃、0.5℃、0℃、1℃等幾個(gè)水平，冷休克持續(xù)時(shí)間取30、60、90分鐘等3個(gè)水平，進(jìn)行冷休克處理。
計(jì)數(shù)后代中雌核發(fā)育二倍體產(chǎn)生情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明條斑星鰈雌核發(fā)育卵在0℃到-1.5℃的冷休克下，均能成功誘導(dǎo)出雌核發(fā)育的二倍體條斑星鰈魚苗；而最佳的冷休克處理時(shí)間為60-90min。
表4不同冷休克處理強(qiáng)度下條斑星鰈雌發(fā)育二倍體誘導(dǎo)率(％) 4、條斑星鰈雌核發(fā)育結(jié)果； 最終的試驗(yàn)結(jié)果見附圖
，從圖中可見不滅活的精子和滅活精子均可以同條斑星鰈的卵授精，授精率沒有明顯的差異，但未滅活精子和條斑星鰈的雜交胚胎，在眼囊期以前全倍死亡，而滅活精子和條斑星鰈的授精后胚胎可以發(fā)育至魚苗孵化。這說明，花鱸精子和條斑星鰈卵可以雜交，但是雜交胚不能成活到眼囊期以后。由于雜交不成活，所以在用花鱸精子進(jìn)行條斑星鰈雌核發(fā)育的誘導(dǎo)時(shí)，可以不用考慮精子滅活不完全產(chǎn)生的雜交問題。滅活精液授精的胚胎，如不進(jìn)行冷休克處理大部分胚胎可以發(fā)育至眼囊期以后，但只有小部發(fā)魚苗可以孵化，表現(xiàn)為明顯的體短，彎曲，卵黃囊變粗大等特征，為典型的單倍體綜合癥。這些魚苗在孵化后的數(shù)天內(nèi)全部死亡。而經(jīng)過冷休克處理的滅活精子組，孵出的魚苗一部分表現(xiàn)為單倍體綜合癥，但也有一少部分魚苗在形態(tài)上表現(xiàn)正常，并存活到孵化后的7天以上，這部分魚苗即為雌核發(fā)育二倍體魚苗。
根據(jù)前面的試驗(yàn)結(jié)果，最終確定了條斑星鰈雌核發(fā)育的有效誘導(dǎo)條件為授精后7-9min，在溫度為-1- -1.5℃的海水中冷休克處理60-90min。
根據(jù)以上條件，處理?xiàng)l斑星鰈卵共進(jìn)行4批，總卵量為5000ml左右(約130萬粒)，按以上確定的最佳條件進(jìn)行誘導(dǎo)。共獲得雌核發(fā)育二倍體魚苗16000余尾，總誘導(dǎo)率約為0.5％。
(二)、大菱鲆雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo) 1.大菱鲆魚卵和花鱸精子； 利用萊州市明波水產(chǎn)有限公司人工培育的大菱鲆親魚20尾，雌魚體重1-2kg/尾，經(jīng)過生殖調(diào)控達(dá)到性成熟并開始自然產(chǎn)卵，人工擠壓腹部獲得大菱鲆未受精卵。實(shí)驗(yàn)用異種魚精子為2002年10月-2003年11月冷凍保存的花鱸精子，保存期限為3-4年，利用37℃水浴解凍后在顯微鏡下檢查，精子活力保持在80-90％。
2.減數(shù)分裂雌核發(fā)育冷休克起始時(shí)間篩選 每一次實(shí)驗(yàn)吸取100μL冷凍精子置于經(jīng)6℃預(yù)冷的培養(yǎng)皿中，加入900μL的精子稀釋液稀釋，平輔底部，利用強(qiáng)度為10-30mj/cm2紫外線照射0.1-0.3min，取大菱鲆卵4mL于燒杯中，加入照射后的精子充分混合，再加入4mL溫度為14℃的海水，輕輕搖動(dòng)授精。分別在授精3、4、5、6、7、8min后將盛卵的燒杯放入0℃水浴中進(jìn)行冷休克25min，之后將卵放入14℃海水中復(fù)溫，利用相同溫度的海水沖洗受精卵，最后將卵放入14℃海水中培養(yǎng)。胚胎發(fā)育到囊胚期或原腸前期統(tǒng)計(jì)胚胎發(fā)育率，孵化后統(tǒng)計(jì)成活率。結(jié)果如表5。
表5受精后不同時(shí)間休克后雌核發(fā)育胚胎的發(fā)育率和孵化率(％)(n＝3-6) 受精后3～5min休克胚胎發(fā)育至原腸期的發(fā)育率都較高，能到60％以上，受精后4-6min休克組的雌核二倍體成活率要較其它時(shí)間高，為26.55-33.69％，因此選擇受精后4-6min作為大菱鲆卵冷休克的適宜起始時(shí)間。另外，對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明，未經(jīng)紫外線照射的花鱸精子與大菱鲆卵的雜交受精率和發(fā)育至尾芽期成活率較紫外線照射精子的受精率明顯高，但胚胎發(fā)育不能形成正常肌節(jié)，視泡較小、胚體周圍組織散亂，尾部畸形短小，是明顯的單倍體綜合癥，不能成活。
3.冷休克持續(xù)時(shí)間的篩選 將紫外線失活后的花鱸冷凍精子100μL與4ml大菱鲆卵授精，授精后將卵放在14℃海水中進(jìn)行培養(yǎng)；在授精后5min將卵杯置于0℃水浴中分別休克15、20、25、30、35min。同時(shí)，取1組受精卵在授精后不經(jīng)過冷休克，直接在14℃海水中培養(yǎng)做為對(duì)照組。胚胎發(fā)育到原腸期統(tǒng)計(jì)發(fā)育率，孵化后統(tǒng)計(jì)正常育苗比率，結(jié)果如表6。
從表6可以看出，各實(shí)驗(yàn)組胚胎都會(huì)孵出正常仔魚，但是休克20-30min實(shí)驗(yàn)組正常魚苗數(shù)量較其它組多。不經(jīng)休克的大菱鲆卵發(fā)育至原腸早期的發(fā)育率可達(dá)75.24±6.79％，與其它實(shí)驗(yàn)組有顯著性差異(p＜0.05)，但不休克組發(fā)育至原腸后期不能形成完整的胚體，無肌節(jié)、視泡和神經(jīng)管等組織，孵化仔魚畸形。因此，冷休克時(shí)間選擇20-30min較為合適。
表6休克時(shí)間對(duì)大菱鲆雌核發(fā)育魚苗百分率的影響(％)(n＝3-9) 4.冷休克溫度的篩選； 利用紫外線照射的鱸魚冷凍精子與大菱鲆卵受精，每個(gè)實(shí)驗(yàn)的精子和卵量及精子處理方法與實(shí)驗(yàn)2相同，在受精后5min分別將卵置于-1、0、1、2、3、4、5、6℃的水浴中冷休克25min，其中1組卵受精后不休克做為對(duì)照，然后進(jìn)行復(fù)溫和培養(yǎng)，培養(yǎng)方法與實(shí)驗(yàn)2相同。分別在胚胎發(fā)育到囊胚期統(tǒng)計(jì)胚胎發(fā)育率，孵化后統(tǒng)計(jì)正常仔魚比率。結(jié)果如表7。
從表7可以看出，在各溫度處理組，原腸發(fā)育率無顯著性差異(p＞0.05)。但是，在-1、0和2℃冷休克胚胎孵化出正常的仔魚所占比例最高，在26％-35％之間；在3-4℃休克胚胎有部分可繼續(xù)發(fā)育至尾芽期并能孵化出正常的魚苗，但是大部分仔魚都畸形，有單倍體綜合癥的特征。5、6℃組幾乎沒有正常形態(tài)的仔魚。不休克胚胎的原腸發(fā)育率達(dá)75.24±12.72％(p＜0.05)，但胚胎在原腸中期后發(fā)育不正常，頭部小，尾部畸形，不能出膜。因此，選擇-1-2℃水浴進(jìn)行冷休克較為適宜。
表7不同休克溫度下大菱鲆胚胎發(fā)育率和孵化率(％)(n＝3) 5.大菱鲆雌核發(fā)育誘導(dǎo)結(jié)果 依據(jù)以上實(shí)驗(yàn)將鱸魚冷凍精子誘導(dǎo)大菱鲆雌核發(fā)育的技術(shù)參數(shù)確定為利用10mJ/cm2紫外線照射鱸魚冷凍精子0.1-0.3min滅活，與大菱鲆卵進(jìn)行人工授精，授精后5min用-1℃到2℃的水浴冷休克處理受精卵20-30min，然后將胚胎置于14℃海水中培育，這樣就可以獲得雌核發(fā)育大菱鲆魚苗。二倍體雌核發(fā)育魚苗的誘導(dǎo)率為26-34％。利用以上技術(shù)方案培育出大菱鲆雌核發(fā)育魚苗約1500多尾。
(三)、雌核發(fā)育魚苗的鑒定它的技術(shù)內(nèi)容包括1.通過染色體數(shù)量和核型鑒定雌核發(fā)育魚苗；2.通過微衛(wèi)星分子標(biāo)記手段鑒定雌核發(fā)育魚苗。
1.染色體分析鑒定雌核發(fā)育魚苗 由于花鱸染色體數(shù)目為2n＝48條，其核型為48t.而條斑星鰈染色體數(shù)目為2n＝46，其核型為44t+2sm；因此花鱸的染色體數(shù)目與條斑星鰈的染色體數(shù)目不相同，通過染色體分析即可證明雌核發(fā)育魚苗是否為雌核發(fā)育而來。如果雌核發(fā)育魚苗的染色體數(shù)目及核型與條斑星鰈完全相同，則證明這些魚苗是雌核發(fā)育而來。本發(fā)明采用常規(guī)的染色體制片方法，對(duì)條斑星鰈雌核發(fā)育魚苗進(jìn)行了染色體分析，發(fā)現(xiàn)條斑星鰈雌核發(fā)育魚苗的染色體數(shù)為46條，染色體核型也與條斑星鰈相同，從而證明這些魚苗為條斑星鰈雌核發(fā)育二倍體個(gè)體。
2.用微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定雌核發(fā)育魚苗 (1).基因組DNA的提取 采取高鹽法提取條斑星鰈雌核發(fā)育魚和正常魚基因組DNA，首先將固定于酒精中的魚苗或魚鰭條置于1.5ml離心管中，剪碎后加入400μlTENS裂解液(10mM Tris-HCl，PH 7.5，400μM NaCl，100mM EDTA，0.6％SDS)和10μl蛋白酶K(10mg/ml)，然后置于55℃消化。消化完全后，加入140μl飽和氯化鈉，混勻，12000rpm/min 4℃離心30min。取上清加入兩倍體積預(yù)冷的無水乙醇沉淀，然后將絮狀沉淀挑出后用70％的酒精洗滌兩次，待酒精揮發(fā)干后，用TE緩沖液溶解DNA。
(2)PCR擴(kuò)增； PCR反應(yīng)體系為10μl，包括1×PCR buffer(20mMTris-HCl，PH8.4，20mM KCl，10mM(NH4)2SO4)，10-50ng基因組DNA，0.2μM微衛(wèi)星引物，120μMdNTPs，1.5mM MgCl2和0.5U Taq DNA聚合酶(TaKaRa)。PCR擴(kuò)增條件為94℃熱變性5min，然后進(jìn)行38個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30s，56-62℃退火30s，72℃延伸30s，最后在72℃延伸7min。用于雌核發(fā)育條斑星鰈檢測(cè)的PCR引物為Vmo4，其序列為L(zhǎng)CACTGTGCCCACTGTCTG，RTTTTCCTCTTACTCCCTCTCTT。
(3)聚丙烯酰胺凝膠電泳； 在PCR產(chǎn)物中加入1/2體積的甲酰胺上樣液(0.01M EDTA，1mg/ml溴芬藍(lán)，1mg/ml二甲苯青)于95℃變性5分鐘，然后立刻放在冰上。在6％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，以pBR322DNA/Msp I(TIANGEN)為標(biāo)記。采用銀染法染色。
(4)微衛(wèi)星分析結(jié)果； 首先通過微衛(wèi)星富集文庫(kù)法構(gòu)建了條斑星鰈富集文庫(kù)，從中篩選出多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記。然后用這些多態(tài)引物在正常群體和雌核發(fā)育群體中進(jìn)行擴(kuò)增，從中進(jìn)一步篩選出在正常群體里雜合率較高，在雌核發(fā)育群體里純合率較高的引物。采用條斑星鰈Vmo4微衛(wèi)星標(biāo)記在條斑星鰈正常魚苗(12尾)中有9個(gè)個(gè)體為雜合，雜合率為75％，而在雌核發(fā)育魚苗(9尾)中，所有個(gè)體都為純合型，雜合率為0，同樣在所有檢測(cè)的純合個(gè)體中未見異于正常群體的等位基因，由此表明這批魚苗是雌核發(fā)育魚苗。
權(quán)利要求
1.一種異源冷凍精子誘導(dǎo)魚類雌核發(fā)育的方法，其特征在于它的操作方法包括1)、異源魚類冷凍精子的遺傳失活；2)、雌核發(fā)育二倍體魚苗的誘導(dǎo)；3)、雌核發(fā)育魚苗的鑒定
1)、異源魚類冷凍精子的遺傳失活通過染色體分析比較和雜交授精實(shí)驗(yàn)確定花鱸精子可以有效刺激多種鲆鰈魚類卵子進(jìn)行雌核發(fā)育，為誘導(dǎo)鲆鰈魚類卵子進(jìn)行雌核發(fā)育的有效異源魚類精子；采用配方為KCl0.39g/L，CaCl2·2H2O 0.17g/L，NaHCO3 0.25g/L，NaCl 3.59g/L，NaH2PO4 0.22g/L，MgCl2 0.23g/L，Glucose 1.0g/L，DMSO 20％的冷凍稀釋液對(duì)花鱸精子進(jìn)行冷凍保存；花鱸精液在液氮中可以進(jìn)行長(zhǎng)期冷凍保存；解凍時(shí)，將在液氮中保存的冷凍精液管從液氮中取出來，先在液氮面上平衡5分鐘，然后將凍精管拿出來在38℃水浴中解凍后備用；冷凍精子的遺傳失活采用紫外線照射完成；選取解凍后精子活力在60-70％以上者用于紫外線失活處理；吸取100μL冷凍解凍的花鱸精液置于在6℃預(yù)冷過的直徑為10cm的培養(yǎng)皿中，加入900μL不合DMSO的上述精子冷凍稀釋液進(jìn)行稀釋，搖勻平輔在直徑10厘米的塑料培養(yǎng)皿底部，將裝有冷凍精液的培養(yǎng)皿置于10-80mJ/cm2紫外線下照射0.1-0.9min，照射后的精子活力應(yīng)該保持在20-40％，經(jīng)這樣處理過的精子可以用來誘導(dǎo)魚卵雌核發(fā)育；
2)、雌核發(fā)育二倍體魚苗的誘導(dǎo)選擇性成熟的條斑星鰈、大菱鲆或犬齒牙鲆等鲆鰈魚類雌魚，在自然產(chǎn)卵前1h采用人工擠壓腹部法采卵，將卵采入干燥的燒杯中，根據(jù)魚的種類不同，將采集的魚卵置于不同的溫度下，其中條斑星鰈卵放在8℃，大菱鲆卵放在14℃，犬齒牙鲆卵放在18℃；將以上經(jīng)過紫外線照射失活的花鱸精液分別加入到條斑星鰈、大菱鲆、犬齒牙鲆魚的未受精卵中，輕輕搖動(dòng)混勻，加入2倍于卵量的海水完成“授精”過程，海水溫度根據(jù)魚的種類確定，其中條斑星鰈卵授精溫度為8℃，大菱鲆卵放在為14℃，犬齒牙鲆卵放在18℃；精液和卵的“授精”最小體積比100μL精液4-8ml卵，授精過程在250ml燒杯中進(jìn)行；在授精后不同時(shí)間，對(duì)受精卵進(jìn)行冷休克處理；通過大量實(shí)驗(yàn)確定適合于我國(guó)幾種重要海水魚類雌核發(fā)育卵染色體加倍的誘導(dǎo)條件分別為
條斑星鰈在用紫外線失活的花鱸精子與條斑星鰈卵子“授精”后7-9分鐘，將授精卵放在-0.5℃到-1.5℃的水浴中進(jìn)行冷休克處理，處理時(shí)間為60-90min，然后將授精卵置于8℃左右的海水中進(jìn)行孵化，能夠獲得雌核發(fā)育的二倍體條斑星鰈魚苗，二倍體雌核發(fā)育魚苗的誘導(dǎo)率為7.8-40.7％；
大菱鲆在用紫外線失活的花鱸精子與大菱鲆卵子“授精”后4-6分鐘，將授精卵放在溫度為-1-2℃的水浴中進(jìn)行冷休克處理，冷休克的持續(xù)時(shí)間為20-30分鐘。然后將授精卵置于14℃左右的海水中進(jìn)行孵化，能夠獲得雌核發(fā)育的二倍體大菱鲆魚苗；二倍體雌核發(fā)育魚苗的誘導(dǎo)率為26-34％；
犬齒牙鲆在用紫外線滅活的花鱸精子與犬齒牙鲆卵子“授精”后3-5分鐘，將授精卵放在溫度為1-2.0℃的水浴中進(jìn)行冷休克處理，冷休克的持續(xù)時(shí)間為40-50分鐘；然后將授精卵置于18℃左右的海水中進(jìn)行孵化，能夠獲得雌核發(fā)育的二倍體犬齒牙鲆魚苗；二倍體雌核發(fā)育魚苗的誘導(dǎo)率為10-25％；
3)、雌核發(fā)育魚苗的鑒定
染色體分析鑒定雌核發(fā)育魚苗
由于花鱸染色體數(shù)目為2n＝48條，其核型為48t，而條斑星鰈染色體數(shù)目為2n＝46，其核型為44t+2sm；而大菱鲆染色體數(shù)目為2n＝44，其核型為2n＝4m+12st+28t，因此花鱸的染色體數(shù)目與這些魚類不相同，通過染色體分析即可證明雌核發(fā)育魚苗是否為雌核發(fā)育而來；如果雌核發(fā)育魚苗的染色體數(shù)目及核型與條斑星鰈、大菱鲆或犬齒牙鲆等母本相同，則證明這些魚苗是雌核發(fā)育而來；本發(fā)明采用染色體制片技術(shù)，對(duì)條斑星鰈和大菱鲆等魚類雌核發(fā)育魚苗進(jìn)行了染色體分析，發(fā)現(xiàn)條斑星鰈雌核發(fā)育魚苗的染色體數(shù)為46條，大菱鲆雌核發(fā)育魚苗的染色體數(shù)為44條，與母本完全相同，從而證明這些魚苗為雌核發(fā)育二倍體個(gè)體；
用微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定雌核發(fā)育魚苗
基因組DNA的提取將固定于純酒精中的魚苗或魚鰭條剪碎后加入400μl配方為10mM Tris-HCl，pH7.5，400μM NaCl，100mM EDTA，0.6％SDS10mM Tris-HCl，PH7.5，400μM NaCl，100mM EDTA，0.6％SDS的TENS裂解液和10μl濃度為10mg/ml的蛋白酶K，55℃消化完全后，加入140μl飽和氯化鈉，混勻，12000rpm/min 4℃離心30min；取上清加入兩倍體積預(yù)冷的無水乙醇沉淀DNA，然后將絮狀沉淀挑出后用70％的酒精洗滌兩次，待酒精揮發(fā)干后，用TE緩沖液溶解DNA；
PCR擴(kuò)增及結(jié)果分析PCR反應(yīng)體系為10μl，包括配方為20mM Tris-HCl，pH8.4，20mM KCl，10mM硫酸銨，10-50ng基因組DNA，0.2μM微衛(wèi)星引物，120μMdNTPs，1.5mM MgCl2和0.5U Taq DNA聚合酶；PCR擴(kuò)增條件為94℃熱變性5min，然后進(jìn)行38個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30s，56-62℃退火30s，72℃延伸30s，最后在72℃延伸7min；采用序列為CGAGGAGGGGAAGAAAGAAC和CACAACCCAAGCGCAACTAT的Pade 30微衛(wèi)星引物，擴(kuò)增普通犬齒牙鲆基因組DNA時(shí)，85％以上的個(gè)體擴(kuò)增出2條DNA帶，而當(dāng)擴(kuò)增犬齒牙鲆雌核發(fā)育魚苗時(shí)，75％以上個(gè)體只擴(kuò)增出1條帶；當(dāng)用序列為CACTGTGCCCACTGTCTG和TTTTCCTCTT ACTCCCTCTCTT的Vmo4微衛(wèi)星引物擴(kuò)增普通條斑星鰈基因組DNA時(shí)，75％以上的個(gè)體擴(kuò)增出2條DNA片段，而當(dāng)擴(kuò)增條斑星鰈雌核發(fā)育魚苗基因組DNA時(shí)，90％以上的個(gè)體只擴(kuò)增出1條DNA片段；采用序列為TGGACTGGTTTACTGCTGGA和AGGGAACCGATCTGAGAACA的SmaC03微衛(wèi)星引物擴(kuò)增正常大菱鲆魚苗時(shí)，85％以上的個(gè)體產(chǎn)生2條DNA帶，而當(dāng)擴(kuò)增雌核發(fā)育大菱鲆魚苗時(shí)，75％以上的個(gè)體只產(chǎn)生1條DNA帶；因此，這些微衛(wèi)星標(biāo)記可以用于鑒定這些魚類雌核發(fā)育魚苗。
全文摘要
一種魚類異源冷凍精子誘導(dǎo)雌核發(fā)育的方法，包括異源魚類精子的冷凍保存和遺傳失活、雌核發(fā)育二倍體魚苗的誘導(dǎo)和雌核發(fā)育魚苗的鑒定方法。本發(fā)明首次建立了采用花鱸冷凍精子誘導(dǎo)多種海水魚類卵子雌核發(fā)育的方法，篩選到分別適合條斑星鰈、大菱鲆和犬齒牙鲆魚卵的冷休克起始時(shí)間、冷休克溫度和冷休克持續(xù)時(shí)間，建立了雌核發(fā)育魚苗的微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定方法。采用本發(fā)明方法獲得條斑星鰈、大菱鲆和犬齒牙鲆雌核發(fā)育魚苗的百分率分別為7.8-40.7％，26-34％和10-25％。本發(fā)明建立的方法具有先進(jìn)、高效、準(zhǔn)確、可靠的特點(diǎn)，在魚類性別控制和全雌苗種生產(chǎn)中具有重要應(yīng)用價(jià)值，在魚類養(yǎng)殖和育種上具有廣闊的推廣應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N5/06GK101120660SQ200710016988
公開日2008年2月13日 申請(qǐng)日期2007年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月28日
發(fā)明者陳松林, 楊景峰, 蘇鵬志, 翟介明, 田永勝, 廖小林, 邵長(zhǎng)偉 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所