專利名稱：：對hcv進行基因分型的方法和試劑的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明一般地涉及對測試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種進行基因分型的方法和材料。
背景技術：
：據(jù)估計，全世界有大約l億7千萬人感染丙型肝炎病毒(HCV),并且該病毒會引起慢性肝病，還提高了肝硬化和肝細胞癌的風險。HCV的治療主要局限于抗病毒療法，它的效力主要受到幾個生物學參數(shù)例如病毒基因型的影響。因而，HCV基因分型一皮廣泛地用于預測對于抗病毒治療的反應性，并用于優(yōu)化治療的持續(xù)時間。HCV基因分型也已經(jīng)成為流行病學研究和示蹤HCV污染源的重要工具。正鏈HCVRNA基因組長度是大約9600個核苦酸，編碼大約3010個氨基酸的至少一個開放閱讀框。在被感染的細胞中，這種多聚蛋白被細胞蛋白酶和病毒蛋白酶在多個位點裂解，從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白。HCV分離物的特征在于高度的遺傳變異性，原因在于HCVRNA依賴性RNA聚合酶缺乏保真性，該聚合酶由非結(jié)構(gòu)5B(NS5B)基因編碼。此外，由于內(nèi)源突變或被多個種感染，還在單一患者內(nèi)產(chǎn)生遺傳變異的HCV準種。已經(jīng)描述了六種主要的HCV基因型和一百多種亞型。HCV的遺傳變異性使得擴增、測序和基因分型的過程復雜化。這些過程一般依靠使用寡核苷酸引物和探針(例如，PCR擴增引物、測序引物和位點特異性探針)，所述寡核苷酸引物和探針與HCV基因組的相應核酸序列互補，并且能與之雜交。由于HCV基因組的高度變異性，與HCV的一個種互補的寡核苷酸引物和探針可能不與另一個種互補。因而這樣的引物和探針必須根據(jù)對高度保守區(qū)域的特異性來設計。作為選擇，分析必須使用對所有種互補的簡并引物和探針的混合物。某些基因分型方法著眼于于5'非編碼(5'NC)區(qū)。HCV的5'非編碼(NC)區(qū)高度保守，但卻含有可被利用來區(qū)分基因型的型特異性多態(tài)性。迄今為止，大多數(shù)商購5'NC區(qū)基因分型分析是通過RFLP或與寡核苷酸探針的雜交基于PCR擴增和片段分析的。這些分析類型是快速的，但是不像基于測序的分析那么精確。為此，已經(jīng)提出了可選擇的基因組區(qū)域用于對HCV進行基因分型，包括NS5B區(qū)域。對HCV進行基因分型的最精確和直接的方法是對某一區(qū)域的病毒基因組進行測序，所述區(qū)域在各個種之間不同到可區(qū)分病毒型和亞型。同樣重要地，系統(tǒng)發(fā)生分析的數(shù)據(jù)庫必須是可容易獲得的，以分析從這些區(qū)域產(chǎn)生的序列。商業(yè)上可獲得的基于測序的HCV基因分型分析包括，例如，TRUGENE//CK5'WC基因分型試劑盒(BayerHealthCare)，它是利用HCV的5'NC區(qū)的快速的基于測序的分析。這種分析產(chǎn)生的序列數(shù)據(jù)利用系統(tǒng)發(fā)生5'NC區(qū)數(shù)據(jù)庫(TRUGENE/ZCr5'7VC軟件模塊v3丄l)來直接分析。早先，5'NC數(shù)據(jù)庫已經(jīng)包括了來自從未被完全驗證的各種來源的序列，在某些情況下，當分析5'NC或NS5B序列時特定抹系的亞型分配是不一致的。存在著改進基于測序的HCV分析的持續(xù)的需求，以為了臨床分析和治療介入的目的改善HCV型和亞型的鑒定。發(fā)明概述本發(fā)明一般地涉及對測試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種進行基因分型的方法和試劑。更具體而言，本發(fā)明涉及擴增和測序樣品中HCV種的NS5B區(qū)域的一部分并確定它的基因型的改進的方法。本發(fā)明的一個方面涉及通過測序HCV的NS5B區(qū)域的至少一部分來測定測試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種的基因型的方法，對于多種HCV種中的每一種而言，所述NS5B區(qū)域指示該種的型和/或亞型。在一個實施方案中，所述方法包括(a)測定指示測試樣品中存在的HCV種的基因型的所述HCV的NS5b區(qū)域的至少一部分的核普酸序列，其中多種HCV種的相應核苷酸序列指示所述HCV種的特有基因型；并且(b)將(a)中測定的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與所述多種HCV種之一的基因型相關聯(lián)。在另一個實施方案中，所述方法包括(a)測定指示存在于所述測試樣品中的所述HCV種的基因型的HCV的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列，其中具有HCV基因型1、2、3、4、5和6的多種HCV種的每一種的相應核苷酸序列指示所述HCV種的特有基因型；以及(b)將(a)中測定的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與HCV基因型1、2、3、4、5和6之一相關聯(lián)。在又一個實施方案中，所述方法包括(a)測定指示存在于測試樣品的所述HCV種的基因型和亞型的HCV的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列，其中具有HCV基因型1、2、3、4、5和6以及表1中所列的每一種HCV亞型的相應核苦酸序列指示所述HCV種的特有基因型和亞型；以及(b)將(a)中測定的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與所述HCV基因型1、2、3、4、5和6之一以及表1中所列所述HCV亞型之一相關聯(lián)。在上述方法的一個特定實施方案中，HCV的NS5b區(qū)域的部分基本上由SEQIDNO:1的乂人核苷酸位置大約8344到大約8547的區(qū)域組成。在上述方法的另一個特定實施方案中，HCV的NS5b區(qū)域的部分基本上由SEQIDNO:1的/人核苷酸位置8344到8547的區(qū)域組成。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括(a)提供能夠產(chǎn)生多種HCV種的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苦酸序列的簡并寡核苷酸測序引物的混合物，其中所述多種HCV種的每一種的相應核苦酸序列指示所述HCV種的特有基因型；(b)測定指示存在于測試樣品中的所述種的基因型的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列；并(c)將(b)中測定的所述HCV種的NS5b區(qū)域的所述部分的核普酸序列與所述多種HCV種之一的基因型相關聯(lián)。在又一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括(a)提供能夠產(chǎn)生多種HCV種的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列的簡并寡核苷酸測序f1物的混合物，其中所述多種HCV種的每一種的相應核苦酸序列指示HCV基因型1、2、3、4、5和6之一；(b)測定指示存在于測試樣品中的所述HCV種的基因型的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列；并(c)將(b)中測定的所述HCV種的NS5b區(qū)域的所述部分的核苦酸序列與HCV基因型1、2、3、4、5和6之一相關聯(lián)。在又一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括(a)提供能夠產(chǎn)生多種HCV種的NS5b區(qū)域的至少一部分的核香酸序列的簡并寡核苷酸測序《1物的混合物，其中所述多種HCV種的每一種的相應核苷酸序列指示HCV基因型1、2、3、4、5和6之一和表1中所列亞型之一；(b)測定作為所述種的基因型的指示的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列；并(c)將(b)中測定的所述HCV種的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與HCV基因型和亞型[HCV基因型1、2、3、4、5和6之一以及表1所列亞型之一]相關聯(lián)。在一個具體實施方案中，所述簡并寡核苷酸測序引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域乂人大約核苦酸8256到大約8278互補的簡并核苷酸序列[CLIP測序引物M-NS5b-Cy5.5]或它的互補物，和與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的大約核苷酸8611到大約8633互補的簡并核苷酸序列[CLIP測序引物M-NS5b-Cy5]或它的互補物。在另一個具體實施方案中，所述簡并寡核苷酸測序引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域從核普酸8256到8278互補的簡并核苷酸序列[CLIP測序引物M-NS5b-Cy5.5]或它的互補物，和與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的核苦酸8611到8633互補的簡并核苷酸序列[例如，CLIP測序引物M-NS5b-Cy5]或它的互補物。在再另一個具體實施方案中，所述簡并寡核苷酸測序引物的混合物包含由一個或多個下式定義的簡并寡核苷酸序列，或其互補物SEQIDNO:1:5'-TATGAYACCCGCTGYTTYGAYTC國3';和SEQIDNO:2:5'-VGTCATRGCITCYGTRAAGGCTC-3'。本發(fā)明的另一個方面涉及通過擴增HCV的NS5B區(qū)域的至少一部分來測定測試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種的基因型的方法，對于多種HCV種中的每一種而言，所述NS5B區(qū)域指示該種的型和/或亞型。在一個實施方案中，所述方法包括(a)提供簡并寡核苷酸PCR引物的混合物，所述簡并寡核苷酸PCR引物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域/人大約核苷酸8245到大約8269互補的簡并核苷酸序列[例如，正向引物FF1和/或FF2]或其互補物；以及與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的大約核苷酸8616到大約8641互補[例如，反向引物RR1]的簡并核苷酸序列或其互補物；以及(b)擴增NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列。在具體實施方案中，所述簡并寡核苷酸PCR引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域/人核苷酸8256到8278互補的簡并核苷酸序列[例如，CLIP測序引物M-NS5b-Cy5.5]或其互補物；以及與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的核苦酸8611到8633互補的簡并核苷酸序列[例如，CLIP測序引物M-NS5b-Cy5]或其互補物。在另一個具體實施方案中，所述簡并寡核苷酸PCR引物的混合物包含由一個或多個下式定義的簡并寡核苷酸序列，或其互補物SEQIDNO:6:5'-TGGSBTTYKCNTAYGAYACYMGNTG-3'SEQIDNO:5:5'-GARTAYCTVGTCATRGCITCYGTRAA-3'在又一個具體實施方案中，所述簡并寡核苦酸PCR引物的混合物包含由一個或多個下式定義的簡并寡核苷酸序列，或其互補物SEQIDNO:3:5'-TGGGGTTCKCGTATGAYACCCGCTG-3'SEQIDNO:4:5'-TGGGGTTCKCITATGAYACYMGITG-3'SEQIDNO:5:5'-GARTAYCTVGTCATRGCITCYGTRAA-3'附圖的簡要說明附圖1是顯示本發(fā)明的特定實施方案中利用的HCVNS5b結(jié)構(gòu)域和相關區(qū)域的示意圖。附圖2顯示了在GenBankAccessionNo.M67463中所列的HCV的NS5b結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。引物區(qū)域是高亮的，并在邊緣指出。附圖2與SEQIDNO:12相對應。發(fā)明的詳細i兌明定義雖然在本申請中使用的術語是本領域中標準的，但還是提供了某些術語的以下定義來確保清楚。單位、前綴和符號可以按它們SI接受的形式來表示。除非另有陳述，核酸按照5'到3'方向從左到右書寫。在此敘述的數(shù)值范圍包括定義該范圍的數(shù)字，并且包括和支持所定義的范圍內(nèi)的每個整數(shù)。氨基酸在此可以通過它們公知的三字母符號或通過IUPAC-IUBMB命名委員會建議的單字母符號來指代。同樣地，核苷酸可以通過它們公認的單字母代碼來指代。除非另作說明，術語"一(a)"或"一(an)"被看作意味著"至少一個"。在此使用的小節(jié)標題僅是為了組織的目的，不能被認為是限制所描述的主題。在本申請中引用的所有文件或文件的部分(包括但不限于專利、專利申請、文章、書和論文)基于任一目的通過引用完整地將它們明確地合并在此。若本申請中的任何氨基酸或核酸序列不一致，則以附圖為準。如在此使用的術語"擴增"是指提高反應混合物中一種或多種特定基因或基因片段相對于其他基因的相對豐度的過程。提及具體的核苷酸序列使用時，術語"基本上由......組成"是指具體的序列和任何其他序列，所述其他序列并不會顯著影響所述序列的互補性和所述序列雜交多種HCV型或亞型的能力。如在此使用的，"樣品"是指含有或懷疑含有核酸例如RNA或DNA的任何物質(zhì)，包括從一個個體或多個個體分離的組織或液體的樣品，包括但不限于，例如，皮膚、血漿、血清、脊液、淋巴液、滑液、尿液、淚液、血細胞、器官、腫瘤以及體外細胞培養(yǎng)物成分的樣品(包括但不限于細胞在細胞培養(yǎng)基中生長所得到的條件培養(yǎng)基、重組細胞和細胞組分)。術語"核苷酸"是指核苷酸腺苷酸、胞嘧啶、鳥噤呤和胸腺嘧啶，分別由它們的單字母代碼A、C、G和T表示。在簡并引物的表述中，符號R是指G或A,符號Y是指T/U或C,符號M是指A或C，符號K是指G或T/U,符號S是指G或C,符號W是指A或T/U,符號B是指"非A",符號D是指"非C",符號H是指"非G",符號V是指"非T/U",符號N是指任何核苷酸。符號I代表肌苷，它是一般將與任何C、T或A配對的中性石咸基。在本申請的說明書和4又利要求中，簡并引物是指堿基選擇的任一或所有組合，并且指DNA或相應的RNA序列(即，T被U替代)。因而，簡并引物可以代表單個種、落入選擇內(nèi)的兩個種的混合物、或落入選擇內(nèi)的三種選擇的混合物，以及諸如此類直到含有所有可能組合的混合物。術語"核酸"、"多核苷酸"和"寡核苷酸"是指引物、探針、要檢測的寡聚物片段、寡聚物對照以及未標記的封閉寡聚體，并且應當屬于多聚脫氧核苷酸(含有2-脫氧-D-核糖)、屬于多聚核糖核苷酸(含有D-核糖)、屬于為嘌呤或嘧咬》咸基的N-糖苦或經(jīng)l奮飾的噤呤或嘧咬堿基的任何其他類型的多核普酸。在術語"核酸"、"多核苷酸"和"寡核苷酸"之間沒有預定的長度區(qū)別，這些術語將可互換使用。這些術語僅指分子的一級結(jié)構(gòu)。因而，這些術語包括雙鏈和單鏈DNA,以及雙鏈和單鏈RNA。寡核苷酸包含與指定核苷酸序列的區(qū)域相對應的大約至少6個核苷酸、優(yōu)選地至少約10-12個核普酸、更優(yōu)選地至少約15-25個核苷酸的序列。在此使用來定義參考核苷酸序列形式的核酸序列時，術語"相對應，，是指匹配所有或部分參考序列的核苷酸序列，以及作為所有或部分參考序列的互補物的核苷酸序列。寡核苦酸不必完全來自于任何現(xiàn)有的或天然的序列，而可以以任何方式產(chǎn)生，包括化學合成、DNA復制、逆轉(zhuǎn)錄或其組合。術語"寡核苷酸"或"核酸"意指基因組DNA或RNA、cDNA、半合成或合成來源的多核苷酸，就其來源或操作而言，所述多核苷酸(l)與其在自然中相關的所有或部分多核苷酸不相關；和/或(2)與不同于其在自然中連接的多核苷酸的多核苷酸連接；和(3)在自然中不存在。由于單核苷酸以某一形式反應來產(chǎn)生寡核苷酸，從而使得一個單核苷酸戊糖環(huán)的5'磷酸在一個方向上經(jīng)由磷酸二酯鍵連接到與之相鄰的3'氧上，若其5'磷酸沒有連接到單核苷酸戊糖環(huán)的3'氧，則寡核苷酸的末端被稱為"5'末端"，而若其3'氧沒有連接到隨后的單核苷酸戊糖環(huán)的5'磷酸，則寡核苷酸的末端稱為"3'末端"。即便處于較大寡核苷酸內(nèi)部，在此4吏用的核酸序列也可以纟皮i人為具有5'和3'末端。當兩個不同的、非重疊的寡核苦酸退火到同一線性互補核酸序列的不同區(qū)域，并且一個寡核苷酸的3'末端指向另一個的5'末端時，前者可以被稱為"上游"寡核苷酸，后者被稱為"下游"寡核苷酸。術語"引物，，可以指不止一個引物，并且可以指天然存在(經(jīng)純化的限制性酶切產(chǎn)物形式)或合成產(chǎn)生的寡核苷酸，使其處于與核酸鏈互補的引物延伸產(chǎn)物的合成被催化的條件下時，所述寡核苷酸能夠作為沿互補鏈的合成起點。這些條件包括存在四種不同的脫氧核糖核苷三磷酸鹽和聚合誘導試劑例如DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶，在適合的緩沖劑中("緩沖劑"包括作為輔助因子、或影響pH、離子強度等等的替代物)，以及在適合的溫度下。為使擴增效力最大，引物優(yōu)選地是單鏈的，但作為選擇可以是雙鏈的。如果是雙鏈的，在用于制備延伸產(chǎn)物之前，引物首先^t處理從而將其鏈分開。優(yōu)選地，引物是寡聚脫氧核糖核苷酸。引物必需足夠長以在存在聚合試劑的情況下啟動延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長度將取決于許多因素，包括溫度和引物的來源以及方法的使用。例如，根據(jù)目標序列的復雜度，寡核苷酸引物一般含有15-25個核苷酸，而它可以含有更多或更少的核苷酸。短的引物分子一般需要更低的溫度來與模板形成足夠穩(wěn)定的雜交復合物。術語"延伸引物，，是指與模板序列互補、并且能夠在聚合酶鏈式反應條件下雜交并延伸序列的多核苷酸序列。在提及兩個核酸序列時所使用的術語"互補"和它相關的形容詞形式"互補的"是指，當兩個核酸序列以反向平行連接方式排列時(一個序列的5'末端與另一個序列的3'末端配對)，序列相應的G和C核苷酸堿基是配對的，相應的A和T核苷酸堿基是配對的。通常在天然核酸中不存在的某些堿基可以被包括在本發(fā)明的核酸中，包括，例如，肌苷和7-去氮鳥噤呤。術語基因座中核普酸的"位置"或"位點"是指在基因中分配給核苷酸的編號，一般取自基因的基因組序列的cDNA序列。術語"寡核苷酸引物"是指包含三個以上脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。它的確切長度將取決于與寡核苷酸引物的最終功能和用途相關的許多因素，包括退火反應的溫度以及引物的來源和組成。擴增引于誘導與核酸鏈互補的引物延伸產(chǎn)物的合成的條件下時，寡核苷酸引物能夠作為合成起點。條件可以包括在適合的溫度和pH下核苷酸和誘導試劑例如DNA聚合酶的存在。在優(yōu)選的實施方案中，引物是足夠長度的單鏈寡聚脫氧核糖核苷酸，以在存在誘導試劑的情況下啟動延伸產(chǎn)物從特定序列的合成。在本發(fā)明的一個方面，寡核苷酸引物長度是約15到約30個核普酸，然而引物可以含有更多或更少的核普酸。寡核苦酸引物長度優(yōu)選地是至少15、16、17、18、19或20個核苷酸。更優(yōu)選地，引物將含有約20-25個核苷酸。寡核苷酸引物的敏感性和特異性由引物長度和給定的模板核酸樣品內(nèi)序列的獨特性來決定。例如，太短的引物可能表現(xiàn)出對多個序列的非特異性結(jié)合。除非另有陳述，否則本發(fā)明的實施將采用常規(guī)的分子生物學、微生物學、重組DNA技術、寡核苷酸合成技術，所有這些都處在本領域技術人員的能力范圍內(nèi)。這些技術在文獻中有完整說明。根據(jù)廠家的說明書或如本領域通常實現(xiàn)的或如在此描述的進行酶反應和純化技術。上述技術和方法通常根據(jù)本領域公知的常規(guī)方法以及如多篇一般性參考文獻和更具體的參考文獻的描述進行，這些參考文獻在整個本說明書中被引i正禾口i寸"i侖。參見,1"列Jt口Sambrooketal.MolecularCloning:ALaboratoryManual(2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989));OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait,ed.，1984);NucleicAddHybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.,1984);APracticalGuidetoMolecularCloning(B.Perbal,1984);以及MethodsinEnzymology(AcademicPress,Inc.)系列，所有這些文獻的內(nèi)容通過引用合并在此。術語"逆轉(zhuǎn)錄"是指產(chǎn)生與RNA分子互補的DNA的過程，一般借助于逆轉(zhuǎn)錄酶來實現(xiàn)。引物可以用于啟動聚合；這種引物可以是稍后用于PCR擴增的引物對之一。然后將RNA分子與拷貝的DNA("cDNA")相分離，或通過具有RNAseH活性的酶來降解，從而容許cDNA的第二鏈通過沖莫板依賴性DNA聚合酶產(chǎn)生。在CurrentProtocolsinMolecularBiology,Eds.Ausubel,F.M.etal,(JohnWiley&Sons;1995)的3.7和15.4單元中公開了這種方法，其內(nèi)容通過引用合并在此。術語"測序"是指確定至少部分基因中核苷酸的順序。除非另有陳述，否則本發(fā)明的實施將采用常規(guī)的分子生物學、微生物學、重組DNA技術、寡核苷酸合成技術，所有這些都處在本領域技術人員的能力范圍內(nèi)。這些技術在文獻中有完整說明。根據(jù)廠家的說明書或如本領域通常實現(xiàn)的或如在此描述的進行酶反應和純化沖支術。上述技術和方法通常根據(jù)本領域公知的常規(guī)方法以及如多篇一般性參考文獻和更具體的參考文獻的描述進行，這些參考文獻在整個本說明書中被引i正和"i寸論。參見，i^列i口Sambrooketal.MolecularCloning:ALaboratoryManual(2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989));OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait,ed.,1984);NucleicAcidHybridization(B.D.Hames&S.丄Higgins,eds.,1984);APracticalGuidetoMolecularCloning(B.Perbal,1984);和MethodsinEnzymology(AcademicPress,Inc.)系列，所有這些文獻的內(nèi)容通過引用合并在此。DNA的來源在本發(fā)明的一個方面，所述方法包括首先從患者樣品獲得包含所研究突變的雙鏈多核苷酸才莫板。雙鏈多核苷酸模板起初可以包含基因組DNA、基因組DNA的片段或者從RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA。這種模板將不僅包含所研究突變，還可能包含含有產(chǎn)生多種準種的長度多態(tài)性的區(qū)域。雙鏈多核苷酸^t板一般從患者樣品制備，這通過處理含有DNA的患者樣品從而使得樣本中全部或部分DNA能與寡核苦酸引物雜交，與寡核苷酸引物雜交的、所述樣品中的所有或部分DNA,例如通過裂解、離心來除去細胞碎屑以及蛋白水解消化來暴露DNA。因而DNA模板可以僅含有通過從組織樣品分離獲得的核DNA，僅含有線粒體DNA或核DNA或線粒體DNA的某些子片段。DNA沖莫板也可以通過將總mRNA制品或RNA病毒的基因組轉(zhuǎn)化為cDNA例如通過逆轉(zhuǎn)錄來制備，可為從在平板上生長的單個菌落或從富集的細菌培養(yǎng)物分離的DNA，并且可為其中分離了基本上整個病毒基因組的病毒DNA制品。DNA可以通過多種技術中的任何一種從液體樣品例如血液、尿液或組織樣品制備，這通過多種技術的任何一種，這些技術包括包括裂解、離心來除去細胞碎屑以及蛋白水解消化來暴露DNA;鹽沉淀反應或標準的SDS-蛋白酶K-苯酚提取。樣品也可以使用試劑盒例如PureGeneDNAIsolation試劑盒(Gentra)來制備。核酸的擴增本發(fā)明包括用于DNA擴增以提供用于隨后的測序的豐富DNA資源的方法禾口i式劑。一般地，在測序之前，通過首先擴增包含要測序的目標區(qū)域的DNA區(qū)域來制備測序模板。要擴增的序列不必首先以純的形式存在；它可以是復合混合物的較小的部分或一部分核酸序列。起始核酸可以含有一個以上相同或不同的期望的特定核酸序列。因而，本方法不僅可用于產(chǎn)生大量的一種特定核酸序列，而且如果在序列中存在超過一個的堿基對變異，該方法也可用于同時擴增位于相同或不同核酸分子上一種以上不同的特定核酸序列。本發(fā)明涉及用于對HCV進行基因分型的方法和試劑，包括擴增和測序引物。本發(fā)明利用了使用聚合酶鏈式反應(即PCR)技術或某些其他基于引物延伸的方法來擴增特定核酸序列的公知方法。聚合酶鏈式反應(PCR)方法是本領域廣泛已知的。例如，在美國專利NO.4,683,195、4,683,202和4,800,159;K.Mullis,ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.,51:263-273(1986);禾口C.R.Newton&A.Graham,IntroductiontoBiotechniques:PCR,2.sup.ndEd.,Springer-Verlag(NewYork:1997)中描述了這些方法，它們的公開內(nèi)容通過引用合并在此。PCR涉及使用引物對，每一引物針對雙鏈DNA的每一互補鏈(其中編碼鏈被稱為"有義鏈，，，它的互補鏈被稱為"反義鏈")，其將在位于基因中所研究區(qū)域任一側(cè)的位置上雜交。然后在重復的循環(huán)中進行鏈延伸聚合，從而以指數(shù)方式提高所研究區(qū)域的拷貝數(shù)量。簡言之，在PCR反應的第一步中，樣品的核酸分子一皮短暫地加熱，然后冷卻，以^吏雙鏈分子變性。正向和反向引物以相對于樣品目標過量的濃度存在于擴增反應混合物中。當樣品在有助于雜交和聚合的條件下孵育時，引物在希望擴增的區(qū)域的序列的3'位置處與核酸分子的互補鏈雜交，所述互補鏈是希望擴增的序列的互補物。一旦發(fā)生雜交，引物的3'末端被聚合酶延伸。引物的延伸引起DNA分子的合成，所述DNA分子具有希望的核酸樣品目標的互補物的確切序列。PCR反應能夠指數(shù)擴增期望的核酸序列，在每個循環(huán)中具有期望序列的分子的數(shù)量幾乎翻倍。因而，通過允許雜交、聚合和變性的循環(huán)，則可以實現(xiàn)期望的核酸分子其濃度呈指數(shù)增長。擴增得到的多核香酸可以用作測序反應的才莫板。Gdfand等人描述了來自有機體水生棲熱菌(Thermusaquaticus)的熱穩(wěn)定酶"Taq聚合酶"，該酶可用于這種擴增方法中(參見美國專利NO.4,889,818;5,352,600;和5,079,352，通過引用將它們合并在此)。可選擇的擴增:技術例如NASBA、3SR、QbReplicase和支鏈擴增是本領域技術人員已知的和可獲得的。術語"RT-PCR"—般指包括可擴增RNA序列的逆轉(zhuǎn)錄步驟在內(nèi)的擴增。多核苷酸擴增才莫板的制備本發(fā)明涉及HCV和它的變體形式的擴增和測序。例如，本發(fā)明的方法可以采用DNA或RNA(包括信^吏RNA),所述DNA或RNA可以是單鏈的或雙鏈的。此外，可以利用含有DNA和RNA各一條鏈的DNA-RNA雜合體。也可以采用任何這些核酸的混合物，或者也可以利用在此使用相同或不同的引物從早先的擴增反應產(chǎn)生的核酸。要擴增的特定核酸序列可以只是較大分子的一部分，或可以首先作為分立的分子存在，從而所述具體的序列構(gòu)成整個核酸。要擴增的序列不必首先以純的形式存在；它可以是復合混合物的較小的部分或一部分核酸序列。起始核酸可以含有一個以上相同或相異的期望的特定核酸序列。因而，本方法不僅可用于產(chǎn)生大量的一種特定核酸序列，而且如果在序列中存在超過一個的堿基對變異，該方法也可用于同時擴增位于相同或不同核酸分子上一種以上的不同的特定核酸序列。核酸才莫板可以,人任何來源獲得，例如，來自質(zhì)粒如pBR322,來自克隆的DNA或RNA,或來自來自任何來源的天然DNA或RNA。DNA或RNA可以通過多種4支術例如由Maniatisetal.,MolecularCloning(1982),280-281所描述的沖支術/人血液、組織材津牛或羊膜細胞提取。如果細胞懸浮在低滲緩沖液中，則細胞可以直接使用而不用純化核酸，并加熱到約90°C-100°C，直到出現(xiàn)細胞裂解且細胞內(nèi)組分分散出來，一般約1到15分鐘。在加熱步驟之后，可以直接向裂解的細胞添加擴胞。樣品中含有的目標核酸起初可為RNA的形式，優(yōu)選地;故逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后使用本領域技術人員已知的任何適合的變性方法，包括物理的、化學的或酶學的方法來變性。鏈分離的優(yōu)選的物理方法包括加熱核酸直到它完全地(〉99%)變性。典型的熱變性包括「/人約8(TC到約105。C的溫度范圍，幾秒到數(shù)分鐘的時間范圍。作為對變性的選擇，目標核酸可以在樣品中以單鏈形式存在，例如，單鏈RNA或DNA病毒。變性的核酸鏈然后在便于引物和探針與單一核酸鏈結(jié)合的條件下與預選的寡核苷酸引物孵育，任選地，與標記的寡核苷酸(在此稱為"探針")孵育，以檢測擴增的序列。如本領域已知的，選擇引物使得它們沿雙鏈體序列的相對位置是這樣的當延伸產(chǎn)物從它的模板(互補物)分離時，從一個引物合成的延伸產(chǎn)物充當了另一個引物的延伸的模板來產(chǎn)生預定長度的復制鏈。HCV的擴增本發(fā)明的一個方面涉及通過擴增HCV的NS5B區(qū)域的至少一部分來測定測試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種的基因型的方法，對于多種HCV種的每一種而言，所述NS5B區(qū)域指示該種的型和/或亞型。在一個實施方案中，所述方法包括(a)提供筒并寡核苷酸PCR引物的混合物，所述簡并寡核苦酸PCR引物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域從大約核普酸8245到大約8269互補的簡并核普酸序列[例如，正向引物FF1和/或FF2]或其互補物，以及與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的大約核苦酸8616到大約8641互補[例如，反向引物RR1]互補的簡并核苷酸序列或其互補物，以及(b)擴增NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列。在具體實施方案中，所述簡并寡核普酸PCR引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域乂人核普酸8256到8278互補的簡并核苷酸序列[例如，CLIP測序引物M-NS5b-Cy5.5]或其互補物；以及與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的核苦酸8611到8633互補的簡并核苷酸序列[例如，CLIP測序引物M-NS5b-Cy5]或其互補物。在另一個具體實施方案中，所述簡并寡核苷酸PCR引物的混合物包含由一個或多個下式定義的簡并寡核苷酸序列，或其互補物SEQIDNO:6:5'-TGGSBTTYKCNTAYGAYACYMGNTG-3'SEQIDNO:5:5'-GARTAYCTVGTCATRGCITCYGTRAA-3'在又一個具體實施方案中，所述簡并寡核苷酸PCR引物的混合物包含由一個或多個下式定義的簡并寡核苷酸序列，或其互補物SEQIDNO:3:5'-TGGGGTTCKCGTATGAYACCCGCTG-3'SEQIDNO:4:5'隱TGGGGTTCKCITATGAYACYMGITG-3'SEQIDNO:5:5'國GARTAYCTVGTCATRGCITCYGTRAA-3'核酸的測序以上描述的DNA的擴增將產(chǎn)生用于測序的豐富的DNA資源。如上所述制備的多核苷酸才莫板使用本領域技術人員可用和已知的用于測序核苷酸的多種方法的任一種來測序。用于測序核苷酸的多種方法是本領域技術人員可用和已知的，其中的4壬何一種都可以用于本發(fā)明的方法中。一種7>知的測序方法是Sangeretal.,PNAS(USA)74(12):5463-5467(1977)首先描述的"鏈終止"法，在Sequenase2.0產(chǎn)品資料(AmershamLifeSciences,Cleveland)中得到詳細描述，并且近來在歐洲專利EP-B1-655506中得到更為《子細地描述，它們的內(nèi)容通過引用全部合并在此。在該方法中，要測序的DNA被分離，變?yōu)閱捂湹模⒅萌胨膫€容器中。在每個容器中有復制DNA鏈的必需組分，包括才莫板依賴性DNA聚合酶、與要測序的DNA的測序起始位點互補的短引物分子以及每種堿基A、C、G和T的脫氧核糖核苷酸三磷酸鹽，處在有助于引物和要測序的DNA之間的雜交以及雜交的引物的鏈延伸的緩沖劑中。此外，每個容器含有少量的一種雙脫氧核苦酸三磷酸鹽，例如雙脫氧腺。票呤核苦三磷酸鹽("ddA")、雙脫氧鳥。票呤核苷三磷酸鹽("ddG")、雙脫氧胞嘧啶核苦三磷酸鹽("ddC")、雙脫氧胸腺嘧啶核苦三磷酸鹽("ddT")。在每個容器中，每段分離的DNA均與引物雜交。然后延伸引物，一次一個堿基來形成與才莫板DNA互補的新的核酸聚合物。當雙脫氧核苷酸被摻入延伸聚合物中時，就阻止了聚合物的進一步延伸。因而，在每個容器中，形成了一組特定長度的經(jīng)延伸的聚合物，這指出與該容器中雙脫氧核苷酸相應的核苷酸的位置。然后使用凝膠電泳評估這些組次的聚合物來確定序列。多核苷酸的測序可以使用單鏈或雙鏈DNA來進行。用于引物延伸的聚合酶的使用需要單鏈DNA模板。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法使用雙鏈DNA以獲得測序結(jié)果的確證性相反鏈確認。雙鏈DNA模板可以使用堿或熱變性來將兩條互補DNA模板分離成單鏈來測序。在聚合期間，每個DNA模板分子被復制一次形成互補的經(jīng)引物延伸的鏈。利用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(例如，Taq、Bst、Tth或VentDNA聚合酶)容許雙鏈DNA模板在測序反應中通過熱變性、引物退火、延伸和雙脫氧終止的交替周期反復循環(huán)。該循環(huán)過程有效地擴增了少量的輸入DNA模板來產(chǎn)生用于測序的足夠的模板。測序也可以對PCR擴增反應產(chǎn)物直接進4亍。雖然對經(jīng)擴增的DNA的克隆是相對直接，但是PCR產(chǎn)物的直接測序便于并加快了序列信息的獲取。只要PCR反應產(chǎn)生分立的擴增產(chǎn)物，它將可用于直接測序。與克隆PCR產(chǎn)物并測序單獨的克隆的方法相比，直接分析PCR產(chǎn)物的序列的方法一般地不受TaqDNA聚合酶的相對高差錯率的影響。差錯可能隨機地分布在整個分子上。因而，擴增產(chǎn)物的絕大多數(shù)將由正確的序列組成。PCR產(chǎn)物的直接測序相對于測序克隆的PCR產(chǎn)物具有的優(yōu)勢在于(1)它容易標準化，因為它是不取決于活細胞的使用的簡單的酶過程，以及(2)對于每個樣品僅需要測定單個序列。本發(fā)明中使用的擴增方法也可以同時地連同測序來^f吏用。同時地擴增和測序的方法是本領域公知的，包括聯(lián)合的擴增和序列(CAS)(由RuanoandKidd,Proc.Nat'l.Acad.Sci.(USA)88(7):2815-2819(1991)以及在美國專利No.5,427,911中描述，通過引用將它們合并在此)，以及CLIP擴增和測序(在美國專利NO.6,007,983和J.Clin.Microbiology41(4);1586-1593(April2003)中描述，通過引用將它們合并在此)。CLIP測序使得早先產(chǎn)生的PCR擴增片段同時進行PCR擴增和直接測序。在CAS測序中，在第一反應階段用兩個引物處理樣品，并進行多個循環(huán)的擴增來實現(xiàn)10,000到100,000倍擴增。然后在擴增反應的指數(shù)期添加ddNTP,繼續(xù)反應持續(xù)另外的熱循環(huán)數(shù)來產(chǎn)生鏈終止的測序片段。CAS法要求中途添加試劑(ddNTP試劑)，這引入了差錯或污染的機會并提高了將用于自動化的任何設備的復雜度。因而CAS方法優(yōu)選地與CLIP測序聯(lián)合起來，這使得早先產(chǎn)生的PCR擴增片段同時進行PCR擴增和直接測序。例如，利用CLH^方法的同時擴增和測序可以使用在此描述的試劑，在類似于商業(yè)上可獲得的試劑盒如TRUGENEHCV基因分型試劑盒(BayerHealthCareLLC)中描述的條件下來實現(xiàn)。在特定的方面，本發(fā)明涉及HCV的測序。在本發(fā)明的方法中使用的雙鏈DNA才莫板可以來自例如單鏈或雙鏈的DNA或RNA(包括信使RNA)。此外，DNA模板可以是含有DNA的一條鏈和RNA的一條鏈的DNA-RNA雜合體的形式。也可以采用任何這些核酸的混合物，或者要擴增的特定核酸序列可以只是較大分子的一部分，或可以首先作為分立的分子存在，從而所述具體序列構(gòu)成整個核酸。對HCV進行基因分型本發(fā)明包括用于對懷l^含有或已知含有HCV的樣品中的HCV進行基因分型的新的方法和試劑。本發(fā)明的測序引物由特異于HCV的NS5b區(qū)域的寡核苷酸組成，它可以用于擴增和測序一部分HCV。根據(jù)本領域技術人員已知的方法，從懷l是感染HCV的個體獲得的樣品;故用于回收RNA或DNA形式的病毒RNA。從樣品獲得的病毒HCVRNA被逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后利用聚合酶鏈式反應或其他基于引物延伸的方法來擴增cDNA模板。產(chǎn)生的擴增片段然后首先利用循環(huán)測序方法或CLIP雙向測序來用一組引物測序，所述引物包含期望的HCV的NS5b區(qū)域。本發(fā)明的一個特定的方面是擴增和基因分型懷疑含有HCV的樣品中的HCV的一部分NS5b區(qū)域的方法。HCV的測序本發(fā)明一般地涉及用于對測試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種進行基因分型的改進的方法和試劑。在本發(fā)明的某些方面，本發(fā)明涉及擴增和測序樣品中HCV種的NS5B區(qū)域的一部分并確定它的基因型的方法。一般地，本發(fā)明涉及通過測序HCV的NS5B區(qū)域的至少一部分來測定測試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)的基因型的方法，對于多種HCV種的每一種而言，所述NS5B區(qū)域指示該種的型或亞型。引物。本發(fā)明的測序引物包含正向引物和反向引物，它可以用可沖全測標記來標記。對于最常見的測序儀器，熒光標記是期望的，然而也可以采用其他標記類型，包括有色的、產(chǎn)色的、發(fā)熒光的(包括化學發(fā)光的)和放射性標記。引物組合可以包括適合于逆轉(zhuǎn)錄、擴增或測序的其他試劑，并且當然地可以包括用于分析的HCV遺傳物質(zhì)。雖然以下公開的本發(fā)明的測序引物優(yōu)選地選自具有以下公開的相同序列的引物，但是還是認為本發(fā)明包括具有等價的特異性和功能的簡并序列，其可以根據(jù)本領域的技術來設計和構(gòu)建。具體而言，測序引物包括具有15或更多個核苷酸的上述引物的片段。測序引物也可以包含具有16、17、18、19或20或更多個核苷酸的上述引物的片段。這種簡并序列的i殳計和構(gòu)建是本領域技術人員/>知的。與擴增引物相反，由于如果測序引物相對于3'堿基不具有相同位置，則它們不能被混合在一起，因此只有特定的簡并堿基被標注出來，然而要理解的是也可以對3'位置進行修飾。例如，5'長度可以被改變以包括序列保守性更高的區(qū)域，或者以改變解鏈溫度和結(jié)合嚴格度。如果使用原始的引物(primaryprimer)發(fā)現(xiàn)成功率是足夠的，非簡并的引物對是優(yōu)選的。反應條件也可能顯著地影響性能。測序引物的可能的修飾在以下的小節(jié)和實施例中說明。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括首先測定指示所述HCV種的基因型的HCV的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列。指示其基因型的HCV的NS5b區(qū)域的部分是與多種HCV種的核苷酸序列相對應的相同區(qū)域，所述核苷酸序列指示多種HCV種的每一種的基因型。因而，本發(fā)明的一個方面是鑒定在HCV種之中共有的、指示特定HCV種的型和/或亞型的區(qū)域。因而通過將上述步驟中測定的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與已知序列/基因型的多種HCV種之一的基因型相關聯(lián)，任何HCV種的這個區(qū)域的測序能夠確定該種的型和亞型。在另一個實施方案中，所述方法包括(a)測定指示所述HCV種的基因型的HCV的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列，其中具有基因型1、2、3、4、5和6的每種HCV種的相應核苷酸序列指示所述種的基因型；以及(b)將(a)中測定的NS5b區(qū)域的所述部分的核普酸序列與HCV基因型1、2、3、4、5和6之一相關聯(lián)。在又一個實施方案中，所述方法包括(a)測定指示所述HCV種的基因型和亞型的HCV的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列，其中具有基因型1、2、3、4、5和6以及表1中所列每種亞型的每種HCV種的相應核苷酸序列指示所述種的基因型和亞型；以及(b)將(a)中測定的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與基因型1、2、3、4、5和6之一以及表l中所列亞型之一相關耳關。在上述方法的一個特定實施方案中，HCV的NS5b區(qū)域的部分基本上由SEQIDNO:1的/人核苷酸位置大約8344到大約8547的區(qū)i或組成。在上述方法的另一個特定實施方案中，HCV的NS5b區(qū)域的部分基本上由SEQIDNO:1的乂人核苷酸位置8344到8547的區(qū)域組成。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括(a)提供能夠產(chǎn)生多種HCV種的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列的簡并寡核苷酸測序？I物的混合物，其中所述多種HCV種的每一種的相應核苦酸序列指示所述種的基因型；(b)測定指示所述種的基因型的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列；并(c)將(b)中測定的所述HCV種的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與所述多種HCV種之一的基因型相關聯(lián)。在又一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括(a)提供能夠產(chǎn)生多種HCV種的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列的簡并寡核苷酸測序虧1物的混合物，其中所述多種HCV種的每一種的相應核苷酸序列指示HCV基因型1、2、3、4、5和6之一；(b)測定指示所述種的基因型的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列；并(c)將(b)中測定的所述HCV種的NS5b區(qū)域的所述部分的核苦酸序列與HCV基因型1、2、3、4、5和6之一相關聯(lián)。在又一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括(a)提供能夠產(chǎn)生多種HCV種的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列的簡并寡核苷酸測序弓1物的混合物，其中所述多種HCV種的每一種的相應核苷酸序列指示HCV基因型1、2、3、4、5和6之一和表1中所列亞型之一；(b)測定指示所述種的基因型的NS5b區(qū)域的所述部分的核苦酸序列；并(c)將(b)中測定的所述HCV種的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與HCV基因型和亞型[例如，HCV基因型1、2、3、4、5和6之一以及表1所列亞型之一]相關聯(lián)。在一個具體實施方案中，所述簡并寡核苷酸測序引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域/人大約核芬酸8256到大約8278互補的簡并核苷酸序列[例如，CLIP測序引物M-NS5b-Cy5.5]或它的互補物，和與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的大約核苷酸8611到大約8633互補的簡并核苦酸序列[例如，CLIP測序引物M-NS5b-Cy5]或它的互4卜物。在另一個具體實施方案中，所述筒并寡核苷酸測序引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域從核苷酸8256到8278互補的簡并核苷酸序列[例如，CLIP測序引物M-NS5b-Cy5.5]或它的互補物，和與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的核苦酸8611到8633互補的簡并核苷酸序列[例如，CLIP測序引物M-NS5b-Cy5]或它的互補物。在再另一個具體實施方案中，所述簡并寡核苷酸測序引物的混合物包含由一個或多個下式定義的簡并寡核苷酸序列，或其互補物SEQIDNO:1:5'-TATGAYACCCGCTGYTTYGAYTC-3';和SEQIDNO:2:5'-VGTCATRGCITCYGTRAAGGCTC-3'。實施例1-通過測序的HCVNS5b基因分型以下的這個實施例描述了為了確定基因型和亞型而產(chǎn)生丙型肝炎病毒的NS5b區(qū)域中的204個堿基對的片^a的雙向序列的實-驗室方案。一般地，如廠家描述的使用QiagenQIAampViralRNAMini試劑盒從血漿樣品提取病毒HCVRNA。筒要地，使用隨機六聚體逆轉(zhuǎn)錄提取的RNA樣本。在cDNA合成之后，使用特異性引物擴增10juLcDNA模板來產(chǎn)生398個堿基對的擴增子。在PCR擴增之后，進行染料-引物CLIP測序反應。CLIP反應通過使用各自用不同的熒光染料(Cy5.5,Cy5)標記的正向(有義)和反向(反義)引物、鏈延伸試劑和四種鏈終止雙脫氧核苷酸三磷酸鹽(ddNTP)之一雙脫氧腺噤呤核苷(ddATP)、雙脫氧胞嘧咬核苦(ddCTP)、雙脫氧鳥。票呤核苷(ddGTP)或雙脫氧胸腺嘧啶核苷(ddTTP)三磷酸來同時地測序DNA的兩條鏈。通過添加樣品和具有對ddNTP的高親和性的熱穩(wěn)定DNA聚合酶來啟動反應。隨著反應混合物被熱循環(huán)，引物與模板DNA雜交并被延伸，然后通常在沿著目標DNA序列的某處終止。四個CLIP反應產(chǎn)生在兩個CLIP引物之間的目標的正向和反向序列。反應進行40個循環(huán)，從每個引物產(chǎn)生高水平的鏈終止反應產(chǎn)物。在完成循環(huán)程序之時，終止加載染料溶液;故添加到每個反應管，加熱反應來分離雙鏈DNA片段。每個反應的一部分然后加載到MicroCel500盒的頂部，其含有具有特定孔徑大小的成形基質(zhì)的超薄的垂直聚合的聚丙烯酰胺凝膠。聚丙烯酰胺凝膠含有高濃度的尿素來將DNA片段維持在單鏈的變性狀態(tài)。緩沖溶液保持與超薄凝膠的頂部和底部接觸。施加高壓電場，促使帶負電的DNA片段遷移穿過凝膠走向陽極。DNA片段的遷移速度與聚丙烯酰胺基質(zhì)形成的孔洞大小以及DNA片段大小相關，更小的片段遷移更快。接近聚丙烯酰胺凝膠的底部，激光束激發(fā)與移動通過激光的DNA片段連接的熒光染料，檢測器測量焚光染料產(chǎn)生的光線數(shù)量和波長。然后測序儀收集這種光學測量值并傳輸?shù)奖４鏀?shù)據(jù)的工作站。每個測序反應需要四條泳道，每個泳道對應四種鏈終止雙脫氧核苷酸(ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP)的每一種。組合正向和反向CLIP序列，并與"最佳匹配的"參考序列(W)的序列比較。操作員檢查標志位置處的比對并根據(jù)需要編輯堿基。軟件為每個樣品生成HCVNS5b報告。逆轉(zhuǎn)錄(cDNA合成)根據(jù)以下方案從來自樣品的基因組RNA合成cDNA。以下描述的RT試劑(除了Superscript和RNase抑制物)被渦旋和微離心來回收體積。制備HCVNS5bRT主混合物，使用根據(jù)以下式子計算的體積<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>PCR擴增聚合酶鏈式反應(PCR)的擴增如下進行。制備PCR試管并對樣品標記。以下描述的PCR試劑(除了AmpliTaqGold酶)被渦旋和微離心來回收體積。制備簡并引物的混合物，該簡并引物-皮設計來擴增多個臨床相關的HCV種，具有以下的核苷酸序列正向PCR引物(FF-1):5'-TGGGGTTCKCGTATGAYACCCGCTG-3'(SEQIDNO:7)正向PCR引物(FF-2):5'-TGGGGTTCKCITATGAYACYMGITG-3'(SEQIDNO:8)反向PCR引物(RR1):5'-GARTAYCTVGTCATRGCITCYGTRAA-3'(SEQIDNO:9)使用試劑體積的工作表來制備PCR主混合物。根據(jù)以下公式計算體積<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>PCR主混合物(40juL)等分到每個標記的PCR試管中。RTcDNA(10juL)添加到裝有PCR試劑的適當標記的試管中，將試管置于被編程以進行以下步驟的熱循環(huán)儀中HCVNS5bPCR程序<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>從熱循環(huán)儀取出PCR樣品，可在4。C保存最長到兩周或進行如下所述的CLIP測序。CLIP測序制備簡并測序引物的混合物，該簡并測序引物被設計來對多個臨床相關HCV種進行測序，具有以下的核苷酸序列正向CLIP引物5'Cy5.5-5'TATGAYACCCGCTGYTTYGAYTC-3'(SEQIDNO:10)反向CLIP引物Cy5-5'-VGTCATRGCITCYGTRAAGGCTC-3'(SEQIDNO:ll)將必需數(shù)量的PCR螺紋管和帽子裝配在托架上并置于冷塊中。對每個樣品和對照的0.5mL管進行標記并置于冷塊中。從冷藏箱取出CLIP試劑(除了ThermoSequenase酶)，并在室溫下解凍。渦旋每種組分(除了ThermoS叫uenase酶)并快速旋轉(zhuǎn)來回收體積。4吏用10pL可調(diào)整吸移管，將3juL合適的CLIP終止混合物直接轉(zhuǎn)移到每個PCR管中各個孔柱底部。制備ThermoSequenase酶在ThermoSequenase稀釋緩沖液中的1:10稀釋液。使用由以下公式計算得到的試劑體積制備CLIP主混合物。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>20juLCLIP主混合物等分到每個標記的試管中，并轉(zhuǎn)移到裝有CLIP試劑的試管中。PCR擴增子(2|uL)添加到裝有CLIP主混合物的合適的試管中，短暫渦旋并微離心來收集試管底部的體積。將CLIP混合物(5nL)添加到冷塊中的4個終止試管的每一個中。CLIP擴增/測序反應在熱循環(huán)儀上根據(jù)以下方案進行HCVNS5bCLIP<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>從熱循環(huán)儀取出試管，向每個試管添加停止加載染料(6]LiL),渦旋混合。試管放回熱循環(huán)儀并經(jīng)歷變性條件，如下HCVNS5b變性<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>從熱循環(huán)儀取出試管，保存或進行凝膠電泳，如下所述。如廠家所描述的使用Long-ReadTower測序儀進行凝膠電泳，使用以下的測序儀控制設置凝膠溫度(°C)60°C凝膠電壓(V)1800V激光功率(％)50%運行時鐘(采樣間隔)0.5秒運行時鐘(運行持續(xù)時間)50分鐘分析配備有樣品和對照信息。實施例2-通過測序的HCVNS5b基因分型的性能特征評估使用以下試劑，基本上根據(jù)以上在實施例1中描述的基因分型分析，評估了HCVNS5b基因分型分析的性能特征。HCVNS5b特定試劑<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>使用以下的樣品:樣品<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>分析精度分析為了確定本發(fā)明的方法和試劑的分析精確性，使用包含基因型1-5的25成員系列、包含基因型1-6的6成員系列、包含基因型4-10的12成員系列進行分析，并分析了包含基因型1-6的15種其他的臨床樣品，結(jié)果與早先的基因型比較。使用以上實施例1中描述的方法對樣品進行基因分型，與早先通過LiPA或TmGene5'NC基因分型或在樣品小節(jié)中詳述的另一種NS5b方法表征的相同樣品的基因型比較，來確定分析精確性。這項分析的結(jié)果在以下的表格中概述分析精確度數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>樣品ID預期的基因型(新命名)BRTLNS5B基因型GP6A畫C2(10,000c/mL)6a薩i圖國國圖圖圖圍醫(yī)所分析的總共58份精確性樣品產(chǎn)生了51個NS5b基因型結(jié)果?？捎肗S5b基因分型的51個中的51個或100%的樣品產(chǎn)生了在型水平上與早先確定的基因型一致的基因型。51個樣品中的48個在型和亞型水平上是一致的，51個樣品中的3個僅在型水平上是一致的(所有的3個根據(jù)LiPA是lb,根據(jù)NS5b是la)。7個樣品(5個基因型6a和2個基因型7c)未能擴增，并且不能通過NS5b來進行基因分型。獲得的分析。該分析表現(xiàn)出與i前在型水平上可用NS5bi行丄因分^的51個樣品的基因型結(jié)果100%—致。不能用NS5b進行基因分型的七個樣品從這個評估階段中排除。所有7個不能進行基因分型的樣品在這項評估的階段2中重復。備選RT-PCR引物對正在開發(fā)中以擴增基因型6a和7c,如以下連同階段2分析描述的，隨后被設計和分析。重現(xiàn)性分析為了確定本發(fā)明的HCVNS5b基因分型分析和試劑的重現(xiàn)性，由兩個操作員在兩個獨立試驗上對包含基因型1-10的總共22個樣品進行分析，并對結(jié)果在型和亞型水平上的一致性進行比較。還比較了對八個試-險的每一個上的陽性對照的結(jié)果。操作員之間的重現(xiàn)性數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>試驗之間的重現(xiàn)性數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>分別由兩個操作員分析了22個樣品，產(chǎn)生了16種NS5b基因型。以上數(shù)據(jù)表明，NS5b基因分型分析在兩個操作員之間以及在兩個試驗之間NS5b基因型在型和亞型水平上產(chǎn)生了16/16或100%的一致性。6個樣品(4個基因型6a和2個基因型7c)不能被兩個操作員擴增或進行基因分型。試驗之間的重現(xiàn)性8個試驗的8份陽性對照之間一致性為100%。敏感性分析為了確定基因分型分析的敏感性水平，還如以下詳述的制備了基因型1-10的系列稀釋物。HCVNS5b敏感性系列稀釋物<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>*根據(jù)供應廠商提供的分析值證書制造敏感性系列稀釋物。隨后通過bDNA測定的病毒載荷被用于重新計算這些敏感性系列成員的標稱值。**這個樣品通過LiPA和HCV5'NCTruGene基因分型確認為2b，用NS5b基因分型確認為lb基因型。它將被送到參比實驗室進行附加的測試來解決基因型矛盾。上述數(shù)據(jù)表明，對基因型1-5的HCVNS5b基因分型分析滿足可接受的壽丈感性的^見定，因為1,000c/mL(192IU/mL)的HCV基因型1-5被精確地和可重現(xiàn)地基因分型。然而，HCVNS5b基因分型分析并不能始終對HCV基因型6的樣品進行基因分型。1,000c/mL(192IU/mL)的HCV基因型6樣品始終不能被基因分型。因而，由于在制備基因型6-10的敏感性稀釋物中的問題，1,000c/mL的敏感性不能由這些數(shù)據(jù)確定。因而NS5b基因分型分析對于1,000c/mL的基因型l-5是精確的，同時一致性有所變化。實施例3-通過測序的HCVNS5b基因分型的性能特征評估分析精度分析將對一小部分階段1驗證精確性樣品進行分析，并將結(jié)果與之前的基因型進行比較，所述樣品由包含基因型1-6的6成員系列、包含基因型4-10的12成員系列、以及包含基因型4、5和6的4個其他臨床樣品組成。樣品早先通過LiPA或TmGene5'NC基因分型或在采樣小節(jié)詳述的另一種NS5b方法來表征。分析精確度數(shù)據(jù)<table>complextableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>上述數(shù)據(jù)顯示了在來自4個試驗的4份陽性對照中的100%—致性。敏感性分析如以下詳述的制備基因型l-6的系列稀釋物:敏感性數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>*這個樣品通過LiPA和HCV5'NCTruGene基因分型確認為2b,用NS5b確認為lb基因型。它將被送到參比實驗室用于附加的測試來解決基因型矛盾。這項分析對1,000c/mL(192IU/mL)的基因型1-5產(chǎn)生了精確的和可重現(xiàn)的基因分型，并對5,000c/mL(962IU/mL)的基因型6產(chǎn)生了精確的和可重現(xiàn)的基因分型。權利要求1.一種測定測試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種的基因型的方法，包括(a)測定指示測試樣品中存在的所述HCV種的基因型的HCV的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列，其中多種HCV種的相應核苷酸序列指示所述HCV種的特有基因型；(b)將(a)中測定的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與所述多種HCV種之一的基因型相關聯(lián)。2.權利要求l的方法，其中HCV的NS5b區(qū)域的所述部分基本上由從SEQIDNO:1的大約核苷酸位置8344到大約8547的區(qū)域組成。3.權利要求l的方法，其中所述HCV的NS5b區(qū)域的部分基本上由從SEQIDNO:l的核苷酸位置8344到8547的區(qū)域組成。4.一種測定測試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種的基因型的方法，包4舌(a)測定指示存在于所述測試樣品中的所述HCV種的基因型的HCV的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列，其中具有HCV基因型1、2、3、4、5和6的多種HCV種的每一種的相應核苦酸序列指示所述HCV種的特有基因型；(b)將(a)中測定的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與所述HCV基因型1、2、3、4、5和6之一相關耳關。5.權利要求4的方法，其中所述HCV的NS5b區(qū)域的部分基本上由從SEQIDNO:1的大約核苷酸位置8344到大約8547的區(qū)域組成。6.權利要求4的方法，其中所述HCV的NS5b區(qū)域的部分基本上由從SEQIDNO:1的核苷酸位置8344到8547的區(qū)域組成。7.—種測定測試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種的基因型和亞型的方法，包括(a)測定指示存在于測試樣品的所述HCV種的基因型和亞型的HCV的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列，其中具有HCV基因型1、2、3、4、5和6以及表1所列的每一種HCV亞型的相應核香酸序列指示所述HCV種的特有基因型和亞型；(b)將(a)中測定的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與所述HCV基因型1、2、3、4、5和6之一以及表1中所列所述亞型之一相關耳關。8.權利要求7的方法，其中所述HCV的NS5b區(qū)域的部分基本上由從SEQIDNO:1的大約核普酸位置8344到大約8547的區(qū)域組成。9.權利要求7的方法，其中所述HCV的NS5b區(qū)域的部分基本上由從SEQIDNO:l的核普酸位置8344到8547的區(qū)域組成。10.—種測定測試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種的基因型的方法，包4舌(a)提供能夠產(chǎn)生多種HCV種的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列的簡并寡核苷酸測序引物的混合物，其中所述多種HCV種的每一種的相應核苷酸序列指示所述HCV種的特有基因型；(b)測定指示存在于測試樣品中的所述HCV種的基因型的NS5b區(qū)域的所述部分的核普酸序列；并(c)將(b)中測定的所述HCV種的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與所述多種HCV種之一的基因型相關聯(lián)。11.權利要求10的方法，其中所述簡并寡核苷酸測序引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域從大約核普酸8256到大約8278互補的筒并核苷酸序列或其互補物，以及與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的大約核苷酸8611到大約8633互補的簡并核苷酸序列或其互補物。12.權利要求10的方法，其中所述簡并寡核普酸測序引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域從核苷酸8256到8278互補的簡并核苷酸序列或其互補物，以及與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:l的核苷酸8611到8633互補的簡并核普酸序列或其互補物。13.權利要求10的方法，其中所述筒并寡核苷酸測序引物的混合物包含由下式定義的筒并寡核苷酸序列，或其互補物SEQIDNO:1:5'-TATGAYACCCGCTGYTTYGAYTC國3';和SEQIDNO:2:5'-VGTCATRGCITCYGTRAAGGCTC-3'。14.一種測定測試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種的基因型的方法，包4舌(a)提供能夠產(chǎn)生多種HCV種的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列的筒并寡核苷酸測序引物的混合物，其中所述多種HCV種的每一種的相應核苷酸序列指示HCV基因型l、2、3、4、5和6之一；(b)測定指示存在于所述測試樣品中的所述HCV種的基因型的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列；以及(c)將(b)中測定的所述HCV種的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與HCV基因型1、2、3、4、5和6之一相關耳關。15.權利要求14的方法，其中所述筒并寡核苷酸測序引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域從大約核苷酸8256到大約8278互補的簡并核苷酸序列或其互補物，以及與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的大約核苷酸8611到大約8633互補的簡并核苷酸序列或其互補物。16.權利要求14的方法，其中所述簡并寡核苷酸測序引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域從核苷酸8256到8278互補的簡并核苷酸序列或其互補物，以及與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:l的核苷酸8611到8633互補的簡并核苦酸序列或其互補物。17.權利要求14的方法，其中簡并寡核苷酸測序引物的混合物包含由下式定義的簡并寡核苷酸序列，或其互補物SEQIDNO:1:5'畫TATGAYACCCGCTGYTTYGAYTC-3';和SEQIDNO:2:5'-VGTCATRGCITCYGTRAAGGCTC-3'。18.—種測定測試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種的基因型的方法，包^t舌(a)提供能夠產(chǎn)生多種HCV種的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列的筒并寡核普酸測序引物的混合物，其中所述多種HCV種的每一種的相應核苦酸序列指示HCV基因型1、2、3、4、5和6之一和所述亞型之一；(b)測定指示存在于測試樣品中的所述HCV種的基因型和亞型的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列；以及(c)將(b)中測定的所述HCV種的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與HCV基因型和亞型相關聯(lián)。19.權利要求18的方法，其中所述簡并寡核苷酸測序引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域從大約核苷酸8256到大約8278互補的簡并核苷酸序列或其互補物，以及與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的大約核苦酸8611到大約8633互補的簡并核苷酸序列或其互補物。20.權利要求18的方法，其中所述簡并寡核苷酸測序引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域從核苷酸8256到8278互補的簡并核苷酸序列或其互補物，以及與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:l的核苷酸8611到8633互補的簡并核苷酸序列或其互補物。21.權利要求18的方法，其中所述簡并寡核苷酸測序引物的混合物包含由下式定義的簡并寡核苷酸序列，或其互補物SEQIDNO:1:5'-TATGAYACCCGCTGYTTYGAYTC-3';和SEQIDNO:2:5'國VGTCATRGCITCYGTRAAGGCTC畫3'。22.—種擴增測試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種的NS5b區(qū)域的一部分的方法，包括(a)提供簡并寡核苷酸PCR引物的混合物，它包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域從大約核普酸8245到大約8269互補的簡并核苷酸序列或其互補物；和與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的大約核香酸8616到大約8641互補的簡并核苷酸序列或其互補物；并(b)擴增NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列。23.權利要求22的方法，其中所述簡并寡核苷酸PCR引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域乂人核苷酸8256到8278互補的簡并核苷酸序列或其互補物；和與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的核苷酸8611到8633互補的簡并核苷酸序列或其互補物。24.權利要求22的方法，其中所述簡并寡核苷酸PCR引物的混合物包含由下式定義的簡并寡核苷酸序列，或其互補物SEQIDNO:6:5'-TGGSBTTYKCNTAYGAYACYMGNTG-3'SEQIDNO:5:5'誦GARTAYCTVGTCATRGCITCYGTRAA-3'25.權利要求22的方法，其中所述簡并寡核苷酸PCR引物的混合物包含由下式定義的簡并寡核苷酸序列，或其互補物SEQIDNO:3:5'國TGGGGTTCKCGTATGAYACCCGCTG-3'SEQIDNO:4:5'隱TGGGGTTCKCITATGAYACYMGITG-3'SEQIDNO:5:5'-GARTAYCTVGTCATRGCITCYGTRAA-3'26.—種簡并寡核苷酸PCR引物的混合物，其中所述混合物包含由一個或多個下式定義的多種寡核苷酸PCR引物SEQIDNO:3:5'-TGGGGTTCKCGTATGAYACCCGCTG-3'SEQIDNO:4:5'-TGGGGTTCKCITATGAYACYMGITG-3'SEQIDNO:5:5'-GARTAYCTVGTCATRGCITCYGTRAA-3'27.權利要求26的簡并寡核苷酸PCR引物的混合物，其中所述混合物包含由下式定義的多種寡核苷酸PCR引物SEQIDNO:3:5'-TGGGGTTCKCGTATGAYACCCGCTG-3'28.權利要求26的簡并寡核普酸PCR引物的混合物，其中所述混合物包含由下式定義的多種寡核苷酸PCR引物SEQIDNO:4:5'隱TGGGGTTCKCITATGAYACYMGITG-3'29.權利要求26的簡并寡核苷酸PCR引物的混合物，其中所述混合物包含由下式定義的多種寡核苷酸PCR引物SEQIDNO:5:5'-TGGGGTTCKCITATGAYACYMGITG-3"30.—種簡并寡核苷酸測序引物的混合物，其中所述混合物包含由一個或多個下式定義的多種寡核苷酸測序引物SEQIDNO:1:5'-TATGAYACCCGCTGYTTYGAYTC-3';和SEQIDNO:2:5'-VGTCATRGCITCYGTRAAGGCTC-3'。31.權利要求30的簡并寡核苷酸測序引物的混合物，其中所述混合物包含由下式定義的多種寡核苷酸測序引物SEQIDNO:1:5'-TATGAYACCCGCTGYTTYGAYTC-3';和32.權利要求30的簡并寡核苷酸測序引物的混合物，其中所述混合物包含由下式定義的多種寡核苷酸測序引物SEQIDNO:2:5'-VGTCATRGCITCYGTRAAGGCTC-3'。全文摘要本發(fā)明涉及用于測定測試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種的基因型的方法和試劑。本發(fā)明更特別地涉及簡并擴增和測序引物的混合物，以及使用這種引物的方法，所述引物與多種HCV種互補，并且能夠產(chǎn)生HCV的NS5B的一個區(qū)域的核苷酸序列信息，對于每個種而言，所述HCV的NS5B區(qū)域指示是在樣品中存在的種的型和/或亞型。文檔編號C12N5/08GK101341247SQ200680048422公開日2009年1月7日申請日期2006年12月22日優(yōu)先權日2005年12月23日發(fā)明者C·B·M·范德米爾,J·赫納蒂塞恩,M·G·H·M·貝爾德,R·古夫,T·格托赫申請人:西門子醫(yī)療保健診斷公司