專利名稱：：反-10，順-12十八碳二烯酸的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過表達(dá)編碼反-10，順-12共輒亞油酸異構(gòu)酶的核酸分子的轉(zhuǎn)基因微生物從而產(chǎn)生反-10，順-12十八碳二烯酸的方法。本發(fā)明還涉及富含共軛亞油酸的伺料或食品制品(尤其是營養(yǎng)制品)的生產(chǎn)方法。本發(fā)明也涉及富含共軛亞油酸的飼料、食品制品和營養(yǎng)制品，和涉及表達(dá)編碼反-10，順-12共軛亞油酸異構(gòu)酶的外來基因的轉(zhuǎn)基因微生物，并涉及同樣益生菌在食品或伺料中的用途。本發(fā)明的所附實(shí)施方案涉及根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的發(fā)酵油和所述發(fā)酵油在藥品生產(chǎn)中的用途。
背景技術(shù)：
：脂肪酸和甘油三酯在食品工業(yè)、動物營養(yǎng)、化妝品和制藥方面有多種應(yīng)用。由其是否是游離飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸或是具有增加量的飽和或不飽和脂肪酸的甘油三酯決定，它們適合于很廣泛的應(yīng)用；因此，例如多不飽和脂肪酸添加到嬰兒配方中從而增加營養(yǎng)價(jià)值。多種脂肪酸和甘油三酯主要獲自微生物例如被孢霉菌，或獲自產(chǎn)油植物例如大豆、油料種子、向曰葵等等，其中通常以它們的三?；视王サ男问将@得?？蛇x擇地，它們最好從動物(例如魚類)獲取。最好通過水解作用制備游離脂肪酸。依賴于預(yù)期目的而優(yōu)選具有不飽和脂肪酸或具有飽和脂肪酸的油脂；因此，例如優(yōu)選具有不飽和脂肪酸(尤其是多不飽和脂肪酸)的脂類用于人體營養(yǎng)，因?yàn)樗鼈儗τ谘褐械哪懝檀妓骄哂嘘栃孕?yīng)，而且因此減少心臟疾病的可能性。它們應(yīng)用于多種^:食的食物或藥品中。尤其有價(jià)值的不飽和脂肪酸是所謂的共軛不飽和脂肪酸，例如共輒亞油酸。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了共軛脂肪酸的一系列陽性效應(yīng)；因此，施用共輒亞油酸減少人和動物的體脂肪并^f吏動物飼料向體重的轉(zhuǎn)變增加(WO94/16690、WO96/06605、WO97/46230、WO97/46118)。通過施用共輒亞油酸，也可能對例如過敏反應(yīng)(WO97/32008)或癌癥產(chǎn)生積極的影響(Banni等人，Carcinogenesis,第20巻，1999:1019-1024，Thompson等人，Cancer,Res"第57巻，1997:5067-5072)。共軛亞油酸(CLA)包含具有兩個(gè)共軛雙鍵的亞油酸(LA)的位置和幾何異構(gòu)體家族。已報(bào)道順-9，反-11CLA(c9,tl1CLA)和反-10,順-12CLA(tlO，cl2CLA)異構(gòu)體具有最大的生物活性，包括抗癌、抗動脈粥樣硬化、抗糖尿病、抗肥胖、免疫增強(qiáng)應(yīng)答和對骨形成的陽性作用(Belury，2002;Pariza等人，1999;Pariza等人，2000)。許多最近的研究表明特異的tl0，cl2CLA異構(gòu)體能夠通過減少動物和人的體脂肪含量和增加無脂肪身體組織從而改變機(jī)體組成。用tl0，cl2CLA異構(gòu)體喂養(yǎng)嚙齒動物的研究表明其減少體脂肪、增加身體水量、增加機(jī)體蛋白質(zhì)和增加機(jī)體灰分(Park等人，1999;deDeckere等人，1999)。在小鼠組織培養(yǎng)中，tl0，cl2CLA異構(gòu)體減少脂蛋白脂肪酶活性和細(xì)胞內(nèi)甘油三酯濃度(Park等人1999)。其他的小鼠研究表明該異構(gòu)體減少肝?；?輔酶A去飽和酶mRNA的表達(dá)(Lee等人，1998)和小鼠脂肪細(xì)胞中?；?輔酶A去飽和酶的表達(dá)(Choi等人，2000)，從而降低脂肪的合成。此夕卜，Os什owski等人(1999)證明攝入共輒亞油酸(含約30%tl0，cl2CLA的異構(gòu)體混合物)會導(dǎo)致生長的豬中無脂肪組織增加和脂肪沉積減少，而且Brown等人(2003)揭示了tl0，cl2CLA異構(gòu)體在人脂肪前體細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞中特異性下調(diào)甘油三酯累積和PPARY表達(dá)。向53個(gè)健康男人和女人組補(bǔ)充人CLA(4.2g/d;等量c9，tl1和tl0,cl2CLA)，與補(bǔ)充橄欖油的對照組相比體脂肪減少的比例為3.8。/。(Smedman和Vessby，2001)。Blankson等人，2000得到類似的結(jié)果，他們報(bào)道了用大于3.4gCLA/天的劑量(等量c9，tl1和tl0，cl2CLA)施用于超重和肥胖的人12周后與對照組比較顯著減少體脂肪量。同樣，Thorn等人(2001)在12周的試驗(yàn)以后得到相近的結(jié)果。tl0，cl2CLA異構(gòu)體也能減少奶牛的乳脂合成。tl0,cl2CLA異構(gòu)體的4天皺胃浸出液引起乳脂百分比減少42%和乳脂產(chǎn)量減少44%。而c9，tllCLA對乳脂沒有影響(Baumgard等人，2000)。tl0，cl2CLA異構(gòu)體抑制乳脂合成的機(jī)制仍然未知，但是其可能包括抑制涉及脂肪酸從頭合成的主要酶(例如?；?輔酶A羧化酶和脂肪酸合成酶)的活性或合成(Baumgard等人2000)。因此證據(jù)表明CLA在促進(jìn)健康中起重要作用，并且特異性tl0，cl2CLA異構(gòu)體可以用于治療超重和肥胖的動物和受試人。通過富集該異構(gòu)體和摻入功能性食品并作為每日基本成分，可能對這些情況進(jìn)行預(yù)防和治療。已報(bào)道，tl0，cl2和c9，t11CLA異構(gòu)體都可以行使抗癌活性。具體地，其可以抑制皮膚瘤起始和前胃瘤形成，并且抑制化學(xué)誘導(dǎo)的皮膚瘤誘發(fā)和乳房和結(jié)腸肺瘤發(fā)生(Belury，2002)。對CLA執(zhí)行許多生理效應(yīng)的4幾制仍未完全了解，但是至少提出了兩個(gè)不同的模型。一個(gè)模型提出CLA減少花生四烯酸鹽庫從而減少下游類花生酸產(chǎn)物的產(chǎn)生，該類花生酸產(chǎn)物調(diào)控涉及炎癥和癌癥的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。另一個(gè)模型包括對已知調(diào)控脂類氧化、脂肪細(xì)胞分化、能量平衡和動脈粥樣硬化形成的基因表達(dá)的調(diào)控(Behiri,2002;Pariza等人，2000)。CLA可以從亞油酸和亞麻酸、或含亞油酸或亞麻酸的植物油的堿性異構(gòu)化作用合成制造。當(dāng)在堿性條件下將油脂加熱到180。C時(shí)，兩個(gè)反應(yīng)被催化;脂肪酸酯鍵從甘油三酯脂類主鏈上水解產(chǎn)生游離脂肪酸，和具有兩個(gè)或更多合適的雙鍵的非共軛不飽和脂肪酸的共軛反應(yīng)(WO99/32604)。該方法產(chǎn)生約20-35%的順-9，反-11CLA和約等量的反-10，順-12CLA,但是相對于其他異構(gòu)體，可以通過分步結(jié)晶法實(shí)現(xiàn)這兩種異構(gòu)體的任一種的富集。此外，產(chǎn)生的其他異構(gòu)體主要是反，反異構(gòu)體。US3,356,699和US4,164,505中也描述了共輒脂肪酸(例如共扼亞油酸)的化學(xué)制備。CLA作為瘤胃細(xì)菌中亞油酸生物氫化過程中的中間體而天然形成，因此CLA的天然來源是反芻動物的乳和脂肪。乳脂中的主要CLA異構(gòu)體是c9，tl1CLA，其占有總?cè)橹珻LA的80-90%,而tl0，cl2CLA異構(gòu)體只有約1%(Jensen，2002)。除瘤胃微生物群以外，具有將亞油酸轉(zhuǎn)變?yōu)閏9，tl1CLA異構(gòu)體能力的培養(yǎng)物的范圍是已知的。某些雙歧桿菌菌林能夠產(chǎn)生CLA(主要是順9，反-11異構(gòu)體)(Coakley等人，2003;Rosberg-Cody等人，2004)。能夠生物合成CLA異構(gòu)體(主要是順9，反-11CLA異構(gòu)體)的其他種屬是作為乳品發(fā)酵劑的丙酸桿菌(Jiang等人，1998)、大鼠腸道微生物叢菌林(Chin等人，1994)和某些乳酸桿菌屬(Lin等人，1999)。Nordgren(1999)鑒定許多雙歧桿菌菌林能夠以游離亞油酸作為底物生物合成CLA。WO99/29886描述了食物等級細(xì)菌中(尤其在乳品發(fā)酵劑中)發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌菌林的用途，其具有通過體外發(fā)酵產(chǎn)生CLA的能力。然而，只有少數(shù)細(xì)菌菌林可以用于生物技術(shù)的CLA生產(chǎn)，這些菌林僅可以通過大量和文庫篩選方法進(jìn)行鑒定。這是由于多數(shù)可獲得的細(xì)菌菌林(i)是不能從游離亞油酸產(chǎn)生CLA的，和/或(ii)這些菌林的生長速率被培養(yǎng)基中的游離亞油酸徹底地抑制。專利申請WO99/29886公開了22個(gè)受試細(xì)菌菌株中僅有4個(gè)能夠從游離亞油酸產(chǎn)生CLA,并且19個(gè)受試菌林的生長速率被培養(yǎng)基中的游離亞油酸抑制超過50%。不幸地，能夠從游離亞油酸產(chǎn)生CLA的4個(gè)細(xì)菌菌林對于培養(yǎng)基中的亞油酸敏感。此外，由鑒定的細(xì)菌菌林產(chǎn)生的CLA的70-卯％是由c9，tll/t9，c11-18:2異構(gòu)體代表的，沒有檢測到反-10，順-12十八碳二烯酸。能產(chǎn)生tl0，cl2CLA的種僅有痤齊丙酸桿菌(Propionibacteriiimacnes)(Verhulst等人，1987)和瘤胃細(xì)菌埃氏巨球型菌(Megaspheraelsdenii)YJ-4(Kim等人2000)。這些結(jié)果證明仍然需要鑒定在經(jīng)濟(jì)上具有有利水平的細(xì)菌菌林或生物技術(shù)生產(chǎn)CLA，尤其是反-10，順-12十/V暖二烯酸的方法。WO99/32604描述了來自羅伊乳桿菌(Lactobacillusreuteri)的亞油酸鹽異構(gòu)酶。該酶活性可使亞油酸轉(zhuǎn)化為6個(gè)不同的CLA種，如下(順，反)-9，ll-CLA、(反,順)醫(yī)10，12-CLA、(順，順)-9，ll-CLA、(順，順)-10,12-CLA、(反，反)-9，ll-CLA和(反，反)-10，12畫CLA。使用上述異構(gòu)酶的缺點(diǎn)是反應(yīng)產(chǎn)量非常低，產(chǎn)生的CLA的純度不足以用于工業(yè)生產(chǎn)方法，而且僅發(fā)生很低的空間時(shí)間產(chǎn)量。這導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)上不利的方法。因此，仍然非常需要不具有上述缺點(diǎn)的產(chǎn)生CLA的單一的、經(jīng)濟(jì)的生物技術(shù)方法。
發(fā)明內(nèi)容因此本發(fā)明的目的是提供在微生物中產(chǎn)生共軛亞油酸(尤其是反-10，順-12共軛亞油酸)的有效方法。此外，本發(fā)明的目的是鑒定能夠用于有效發(fā)酵生產(chǎn)共輒亞油酸的微生物。我們發(fā)現(xiàn)可以通過使用表達(dá)編碼CLA異構(gòu)酶(尤其A^-10，順-12共輒亞油酸異構(gòu)酶)的核酸分子的轉(zhuǎn)基因微生物來實(shí)現(xiàn)所述目的，該微生物屬于乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)、鏈球菌科(Streptococcaceae)、丙酸桿菌科(Propionibacteriaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)或雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)。意料之外的是，由于多數(shù)上述微生物的野生型細(xì)胞的生長被培養(yǎng)基中的游離亞油酸所抑制，上述微生物當(dāng)表達(dá)編碼(反-10，順-12)共輒亞油酸異構(gòu)酶的核酸分子時(shí)，能夠從亞油酸產(chǎn)生共輒亞油酸(尤其是反-10，順-12共輒亞油酸)。因而，技術(shù)人員事先未預(yù)期能夠?qū)⑦@些微生物應(yīng)用于產(chǎn)生共輒亞油酸的發(fā)酵進(jìn)程。更令人吃驚的是，當(dāng)在乳酸乳球菌(LactococcusIactis)中表達(dá)時(shí)，反-10，順-12共軛亞油酸異構(gòu)酶的表達(dá)使轉(zhuǎn)基因微生物將加入的亞油酸的50%轉(zhuǎn)化為反-10，順-12共軛亞油酸，在大腸桿菌和副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)中轉(zhuǎn)化率分別為40%和30%。發(fā)明概述本發(fā)明的第一個(gè)主題因此涉及在轉(zhuǎn)基因微生物中產(chǎn)生反-10，順-12共輒亞油酸的方法，包含以下步驟(a)將至少一種編碼反-10，順-12共軛亞油酸異構(gòu)酶的核酸分子引入到所述樣吏生物中，(b)培養(yǎng)在(a)獲得的轉(zhuǎn)基因微生物，(c)通過向培養(yǎng)物中加入亞油酸來資導(dǎo)反-10，順-12共輒亞油酸的產(chǎn)生，(d)將誘導(dǎo)的培養(yǎng)物培養(yǎng)至少12小時(shí)，和(e)從培養(yǎng)基和/或微生物中分離共輒亞油酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述反-10，順-12共軛亞油酸異構(gòu)酶的特征在于，其序列i.如SEQIDNo.1所述，或ii.具有SEQIDNo.1所述序列的至少50個(gè)連續(xù)堿基對，或iii.與具有SEQIDNo.1所述序列的至少100個(gè)連續(xù)核酸堿基對的序列有至少80%同一性，或iv.在高嚴(yán)格性條件下與具有SEQIDNo.1所述核酸分子的至少50個(gè)連續(xù)堿基對的核酸片段雜交，或v.編碼與SEQIDNo.2所示氨基酸序列至少有75。/。同一性的多肽，并且編碼反-10，順-12共軛亞油酸異構(gòu)酶。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述反-10,順-12共軛亞油酸異構(gòu)酶是從瘤胃細(xì)菌、優(yōu)選從埃氏巨球型菌YJ-4中分離的。另外，本發(fā)明涉及上述方法，其中編碼所述反-10，順-12共輒亞油酸異構(gòu)酶的核酸分子是從屬于丙酸桿菌屬(優(yōu)選從痤瘡丙酸桿菌)的微生物中分離的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)上述(a)到(e)步驟在轉(zhuǎn)基因微生物中產(chǎn)生共軛亞油酸的方法，其特征在于(a)中所用的微生物選自乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)、鏈球菌科(Streptococcaceae)、丙酸桿菌科(Propionibacteriaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)和雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)，優(yōu)選所用微生物選自乳球菌屬(Lactococcus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、大腸桿菌屬(Escherichia)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium),更優(yōu)選所述微生物選自乳酸乳J求菌(Lactococcuslactis)、副干酪乳桿菌和大腸桿菌(Escherichiacoli)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)上述(a)到(e)步驟在轉(zhuǎn)基因微生物中產(chǎn)生共軛亞油酸的方法的特征在于在光密度(OD6。。)至少為0.1的微生物培養(yǎng)物中力口入亞油酸。本發(fā)明尤其優(yōu)選的實(shí)施方案涉及在轉(zhuǎn)基因微生物中根據(jù)上述(a)到(e)步驟產(chǎn)生共軛亞油酸的方法，其特征在于亞油酸的生物轉(zhuǎn)化率高于10%。此外，本發(fā)明涉及生產(chǎn)富含共軛亞油酸的飼料或食品產(chǎn)品、或營養(yǎng)制品的方法，其中所用共軛亞油酸是才艮據(jù)上述方法產(chǎn)生的。本發(fā)明還涉及富含共軛亞油酸的飼料產(chǎn)品、食品產(chǎn)品、和營養(yǎng)制品，其中共軛亞油酸是根據(jù)上述方法產(chǎn)生的。另夕卜，本發(fā)明涉及表達(dá)編碼反-10，順-12共軛亞油酸異構(gòu)酶的核酸分子的轉(zhuǎn)基因微生物，該酶的序列特征在于(i)如SEQIDNo.1所述的序列，或(ii)具有SEQIDNo.1所述序列的至少50個(gè)連續(xù)堿基對的序列，或(iii)與具有SEQIDNo.1所述序列的至少100個(gè)連續(xù)核酸堿基對的序列有至少80%的同一性，或(iv)在高嚴(yán)格性條件下與具有SEQIDNo.1所述核酸分子的至少50個(gè)連續(xù)堿基對的核酸片段雜交，或(v)編碼與SEQIDNo.2所示氨基,列至少有75%同一性的多肽，其中所述核,列優(yōu)選從瘤胃細(xì)菌中、更優(yōu)選從埃氏巨球型菌中、最優(yōu)選從埃氏巨球型菌YJ-4中分離，或從屬于丙酸桿菌屬的微生物、優(yōu)選痤瘡丙酸桿菌中分離，其中所述核酸分子功能上連接于至少一個(gè)異源啟動子序列。在本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及發(fā)明的轉(zhuǎn)基因樣吏生物作為食品和飼料中的益生菌的用途，微生物優(yōu)選屬于選自乳球菌屬、乳酸桿菌屬、丙酸桿菌屬、大腸桿菌屬和雙歧桿菌屬，更優(yōu)選^:生物選自短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)、齒雙歧桿菌(Bifidobacteriumdentium)和假鏈狀雙歧桿菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)。另外，本發(fā)明涉及在轉(zhuǎn)基因微生物中根據(jù)上述本發(fā)明方法產(chǎn)生的發(fā)酵油。本發(fā)明還涉及根據(jù)上述本發(fā)明方法產(chǎn)生的發(fā)酵油用于治療癌癥的藥物生產(chǎn)的用途。附圖簡述圖1:pNZ44畫coPAI構(gòu)建體(SEQIDNo.5)圖2:乳酸乳桿菌(l.Zfl"&)pNZ44-coPAI與0.2mg/ml亞油酸培養(yǎng)72小時(shí)后上清(A)和膜(B)的GLC層析鐠，以及乳酸乳桿菌pNZ44(C)與0.2mg/ml亞油酸培養(yǎng)72小時(shí)后的GLC層析i普。(D)tl0，cl2CLA標(biāo)準(zhǔn)物的GLC層析鐠。(E)攜帶pMSP3535-coPAI構(gòu)建體(未誘導(dǎo)的)的副千酪乳桿菌(Lb.paracasei)NFBC338與0.5mg/ml亞油酸培養(yǎng)48小時(shí)后的培養(yǎng)上清的GLC層析謙，和帶有pMSP3535構(gòu)建體的副干酪乳桿菌NFBC338與0.5mg/ml亞油酸培養(yǎng)48小時(shí)后的培養(yǎng)上清的GLC層析鐠(F)。(G)大腸桿菌pNZ44-coPAI在0.5mg/mlLA中培養(yǎng)72小時(shí)后上清的GLC層析語，和pNZ44在0.5mg/mlLA中培養(yǎng)72小時(shí)后上清的GLC層析謙(H)。峰1=亞油酸，峰2-tlO，cl2CLA。圖3:乳酸乳桿菌pNZ44-coPAI與0.2mg/ml亞油酸(LA)培養(yǎng)72小時(shí)后，CLA的產(chǎn)生及亞油酸利用和膜中脂肪酸的積聚。培養(yǎng)物在LA中培養(yǎng)到OD6。q=0.5。圖4:大腸桿菌pNZ44-coPAI與0.5mg/mlLA培養(yǎng)72小時(shí)后，CLA產(chǎn)生及亞油酸(LA)利用和膜中脂肪酸的積聚。圖5:以5-25ng發(fā)酵油/脂肪^/ml培養(yǎng)基處理培養(yǎng)5天后的SW480細(xì)胞的細(xì)胞活力。數(shù)據(jù)代表以乙醇對照百分比表示的細(xì)胞活力，其設(shè)定為100%。(A)從37。C培養(yǎng)72小時(shí)后的LB培養(yǎng)基提取的LA對照油的GLC譜，和用LA對照油處理的SW480的細(xì)胞活力(B)。(C)乳酸乳桿菌pNZ44-coPAI在0.5mg/mlLA中生長72小時(shí)后的GM17培養(yǎng)基的GLC譜，和用乳酸乳桿菌tlO，cl2CLA(發(fā)酵油)處理后的細(xì)胞活力(D)。(E)大腸桿菌pNZ44-coPAI在0.5mg/mlLA中生長后的LB培養(yǎng)基的GLC鐠，和用大腸桿菌tl0，cl2CLA(發(fā)酵油)處理后的細(xì)胞活力(F)。(G)用純化的合成tl0，cl2CLA異構(gòu)體(Matreya)和(H)亞油酸(希格瑪(Sigma))處理后的細(xì)胞活力。****表示與對照油(未發(fā)酵的亞油酸)相比具有顯著性差異的值(pO.OOl)，***表示顯著性差異的值^<0.01)，**表示顯著性差異的值(p<0.05)，*表示顯著性差異的值^<0.1)。圖6:人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480在與不同的油/脂肪酸培養(yǎng)5天后的顯微:鏡檢查。(A)亞油酸未發(fā)酵對照油，5ng/ml培養(yǎng)基(放大倍數(shù)100x)，和(B)25ng/ml培養(yǎng)基(200x)。(C)大腸桿菌tl0，cl2CLA(發(fā)酵油)，5ng/ml培養(yǎng)基(IOOx)，和(D)20ng/ml培養(yǎng)基(200x)。(E)乳酸乳桿菌tl0，cl2CLA(發(fā)酵油)、5照/ml培養(yǎng)基(100x)、和(F)20將/ml培養(yǎng)基(200x)。一般定義應(yīng)該理解本發(fā)明并不受限于所述的特定方法學(xué)、實(shí)驗(yàn)方法、細(xì)胞系、細(xì)菌種或?qū)佟?gòu)建體、和試劑。必需注意，除非文中明確指出，在此處和所附權(quán)利要求中所用的單數(shù)形式也包括復(fù)數(shù)。因此，例如參考"載體，，指一個(gè)或多個(gè)載體，并包括本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其等同物。約此處所用術(shù)語"約"指大約、大致、在……附近或在……區(qū)域內(nèi)。當(dāng)術(shù)語"約"與數(shù)字范圍結(jié)合使用時(shí)，其對該范圍的修飾是延伸到該數(shù)值的上下邊界。通常，此處所用術(shù)語"約"修飾一個(gè)數(shù)值的上下變化20%的狀態(tài)值，優(yōu)選上下10%(更高或更低)。此處所用術(shù)語"或"指詳細(xì)列出的任一成員。動物用于此處指分類學(xué)上指定為動物界(animalia)的生物。優(yōu)選其為四足動物目(陸生脊推動物)和魚目(pisces)的脊推動物(vertebrata)。尤其優(yōu)選鳥綱和哺乳綱，智人(Homosapiens)是尤其優(yōu)選的哺乳動物。特別尤其優(yōu)選的是豬科(Suidae)、?？?Bovinae)、雉科及其相關(guān)的雉(Phasianidae)、鴨科、鵝和天鵝(Anatidae)、馬科(Equidae)、鯉魚科(Cyprinidae)和鱒魚科(Salmonidae)。這些科中最優(yōu)選的是馴養(yǎng)動物和農(nóng)用動物。本發(fā)明中馴養(yǎng)動物的含意是非自由生活的動物，其習(xí)慣于人并主要在人馴養(yǎng)住宅中生活。尤其優(yōu)選的馴養(yǎng)動物是貓和狗。本發(fā)明中農(nóng)用動物的含意是被人用于經(jīng)濟(jì)目的的動物。尤其優(yōu)選的農(nóng)用動物是馴養(yǎng)的牛(Bostaurus)、馴養(yǎng)的雞(Gallusgallusdomesticus)、馴養(yǎng)的豬、馴養(yǎng)的羊(Ovisammonaries)和馴養(yǎng)的灰鶴(Anseranser)。術(shù)語生物轉(zhuǎn)化率此處參考共軛亞油酸的產(chǎn)生使用，優(yōu)選反-10，順12共軛亞油酸，其指在特定發(fā)酵階段之后或在發(fā)酵過程結(jié)束時(shí)游離亞油酸轉(zhuǎn)化為共輒亞油酸的量的百分比。例如，在表達(dá)反-10，順12共軛亞油酸異構(gòu)酶的轉(zhuǎn)基因乳酸乳桿菌細(xì)胞培養(yǎng)液中加入0.5mg/ml亞油酸，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，然后從培養(yǎng)液樣品中提取脂肪酸。樣品中CLA/LA的比例用GLC(氣液層析法)測定。如果樣品中的CLA/LA比例為1:1,那么生物轉(zhuǎn)化率即為50%。細(xì)胞指單個(gè)細(xì)胞。術(shù)語"細(xì)胞"指細(xì)胞群體。該群體可以是包含一種細(xì)胞類型的純化群體。同樣，該群體可以包含多于一種的細(xì)胞類型。在本發(fā)明中，對于細(xì)胞群體中可以包含的細(xì)胞類型數(shù)沒有限制。細(xì)胞可以是同步化的或非同步化的，優(yōu)選細(xì)胞是同步化的。編碼區(qū)或編碼序列(CDS):當(dāng)用于參考基因時(shí)，其指編碼由mRNA分子翻譯形成的新生多肽的氨基酸的核苷酸序列。真核生物中編碼區(qū)的5，側(cè)結(jié)合編碼起始甲硫氨酸的核苷酸三聯(lián)體密碼子"ATG"，3，側(cè)結(jié)合三個(gè)特異性終止密碼子(即TAA、TAG、TGA)之一。共軛亞油酸(CLA):指亞油酸的位置和幾何異構(gòu)體的混合物，在7和9、9和11、10和12或11和13位點(diǎn)包含雙鍵。特別令人感興趣的是順-9，反-11異構(gòu)體和反10，順-12異構(gòu)體，因?yàn)樗霎悩?gòu)體具有許多有益的作用。異構(gòu)體可以是位置上不同(主要在7和9、9和11或10和l2位點(diǎn))(Ha等人，Anticarcinogensfromfriedgroundbeef:heat-alteredderivativesoflinoleicacid.Carcinogenesis.1987Dec;8(12):1881-7)和幾4可上不同(順畫順、順-反、反-順、反-反)。對于CLA的單個(gè)異構(gòu)體，順-9,反-11共軛亞油酸是最具生物學(xué)活性的，因?yàn)槠錇閾饺爰?xì)胞膜磷脂、肝磷脂和甘油三酯的主要異構(gòu)體(Kramer等人，Distributionsofconjugatedlinoleicacid(CLA)isomersintissuelipidclassesofpigsfedacommercialCLAmixturedeterminedbygaschromatographyandsilverion-high-performanceliquidchromatography.Lipids.1998Jun;33(6):549畫58.)。在喂以CLA異構(gòu)體混合物的動物中，其為唯一摻入細(xì)胞膜磷脂部分的異構(gòu)體(Ha等人，Inhibitionofbenzo(a)pyrene-inducedneoplasiabyconjugateddienoicderivativesoflinoleicacid.CancerRes.50:1097-1101(1990);Ip等人，Mammarycancerpreventionbyconjugateddienoicderivativesoflinoleicacid.CancerRes.51:6118-6124(1991))。該異構(gòu)體也是CLA的主務(wù)沃食形式，其獲自反芻動物衍生的脂肪，包括乳、乳制品和肉(Chin等人，Dietarysourcesofconjugateddienoicisomeresoflinoleicacid,anewlyrecognizedclassofanticarcinogens.J.FoodComp.andAnal.5:185-197(1992))。術(shù)語反-10，順-12共軛亞油酸和反-10,順-12CLA此處可以互換4吏用。共軛亞油酸(CLA)異構(gòu)酶是催化亞油酸或共軛亞油酸異構(gòu)體異構(gòu)化的蛋白質(zhì)，其特征在于在一個(gè)碳位點(diǎn)上的雙鍵轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位點(diǎn)的碳上從而形成一個(gè)可能的CLA異構(gòu)體。反-10，順-12共軛亞油酸異構(gòu)酶在本發(fā)明中用來指催化亞油酸異構(gòu)化形成反-10，順-12共輒亞油酸的酶。術(shù)語反-10,順-12共軛亞油酸異構(gòu)酶和反-10，順-12CLA異構(gòu)酶此處可以互換^f吏用。培養(yǎng):在本發(fā)明方法中指微生物在可控制條件下在液體培養(yǎng)基中生長。依賴于方法中所用的生物體，生長條件可以極為不同，而且通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。通常，微生物在含有碳源(通常以糖的形式)、氮源(通常以有機(jī)氮源例如酵母提取物，或鹽例如硫酸銨的形式)、磷酸源(例如磷酸氫鉀)、微量元素(例如鐵鹽、錳鹽、鎂鹽)、和需要情況下含維生素的液體培養(yǎng)基中生長，生長溫度在0-100。C之間，優(yōu)選在10-65。C、15-55°。之間，更優(yōu)選在20-50。C、25-45。C之間，尤其優(yōu)選在30-40。C之間，并供以氧氣。生物體可以在需氧或厭氧條件下生長。液體培養(yǎng)基的pH值可以保持在固定值，即在培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)pH值。pH值范圍應(yīng)該在2-9之間，優(yōu)選在4-8.5、4.5-8之間，更優(yōu)選在5-7.5、5.5-7之間。然而，微生物也可以在沒有pH調(diào)節(jié)的條件下培養(yǎng)?？蛇M(jìn)行分批法、半分批法或連續(xù)培養(yǎng)。營養(yǎng)素可以在發(fā)酵起始時(shí)供應(yīng)，或半連續(xù)或連續(xù)地加入。此類方法可以在例如ScardoviV(1986)GenusBifidobacteriumandGenusLactobacillus.InBergey，sManualofSystematicBacteriology[匪PHASneath,MESharpe,JGHolteditor].Baltimore:Williams&Wilkins中找到。表達(dá)指基因產(chǎn)物的生物合成。例如，對于結(jié)構(gòu)基因的情況，表達(dá)涉及結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄為mRNA和4壬選地隨后mRNA翻譯為一個(gè)或多個(gè)多肽。術(shù)語發(fā)酵油此處用來指含有微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的部分的油和脂肪酸。此處所用發(fā)酵指微生物在生長培養(yǎng)基中大批生長。術(shù)語需氧和厭氧代謝在用于本發(fā)明中時(shí)沒有差異。術(shù)語發(fā)酵油指可以從微生物中(尤其是從微生物的細(xì)胞膜或發(fā)酵液中)回收/分離的脂肪酸部分(例如見實(shí)施例8)。功能性等同物關(guān)于本發(fā)明的核酸序列應(yīng)該理解為SEQIDNo.1的天然或人工突變。突變可以是一個(gè)或多個(gè)核酸的插入、缺失或取代，而不減少所述序列表達(dá)產(chǎn)物的亞油酸異構(gòu)化活性。這些功能性等同物與SEQIDNo.1所述序列具有至少80%、優(yōu)選85%、更優(yōu)選90%、最優(yōu)選大于95%、特別尤其優(yōu)選至少98%、但小于100%的同一性，其中所述同一性通過任一個(gè)的SEQIDNo.1所述序列的至少100個(gè)、優(yōu)選至少150個(gè)、更優(yōu)選至少200個(gè)連續(xù)堿基對的序列來確定并且與SEQIDNo.2所示序列具有基本相同酶活性。功能性等同物尤其是所述序列的同系物。當(dāng)同系物參考共軛亞油酸異構(gòu)酶使用時(shí)，其指SEQIDNo.1所示核酸分子的直向同源物和旁系同源物。這些直向同源物或旁系同源物編碼與SEQIDNo.2在氨基酸水平上具有大于60%、優(yōu)選65%、70%、75%、80%、更優(yōu)選85%、90%、95%、或最優(yōu)選大于95%序列同一性的蛋白質(zhì)，其中所述同一性通過任一個(gè)SEQIDNo.2所述序列的至少100個(gè)、優(yōu)選至少150個(gè)、更優(yōu)選至少200個(gè)連續(xù)氨基酸并且基本上與SEQIDNo.2所示序列具有相同酶活性的序列來確定。上述功能性等同物與來自痤瘡丙酸桿菌的反-10，順-12共軛亞油酸異構(gòu)酶(SEQIDNo.l)相比，可以具有減少的或增加的酶活性或生物轉(zhuǎn)化率。在本發(fā)明中，功能性等同物的酶活性或生物轉(zhuǎn)化率至少比來自痤瘡丙酸桿菌的反-10,順-12共軛亞油酸異構(gòu)酶(SEQIDNo.l)在未改變條件下的參考值高50%、優(yōu)選至少高100%、尤其優(yōu)選至少高300%、特別尤其優(yōu)選至少高500%。功能性連接或有效連接應(yīng)理解為例如調(diào)控元件(例如啟動子)與要表達(dá)的核酸序列和適當(dāng)情況下的另外調(diào)控元件(例如終止子)的有序排列，從而使每個(gè)調(diào)控元件能夠?qū)崿F(xiàn)其允許、修飾、有利于或另外影響所述核*列表達(dá)的預(yù)期功能。依賴于核酸序列的排列，表達(dá)可以形成正義或反義RNA。為此，不必需在化學(xué)意義上的直接連接?；蚩刂菩蛄?例如增強(qiáng)子序歹ij)也可以從更遠(yuǎn)的位點(diǎn)、或從其他DNA分子上對耙序列行使功能。此處所用術(shù)語功能性連接、"有效連接"、"有效組合"和"有效順序"參考共輒亞油酸異構(gòu)酶指至少一個(gè)異構(gòu)酶與核酸序列的連接，從而使異構(gòu)酶能夠在宿主細(xì)胞中依靠所述DNA分子來產(chǎn)生或合成。實(shí)施例中顯示了表達(dá)構(gòu)建體，其中來自痤瘡丙酸桿菌的反-10，順-12共軛亞油酸異構(gòu)酶(SEQIDNo.l)功能性連接于啟動子。可以通過常用重組和克隆技術(shù)產(chǎn)生有效連接和表達(dá)盒，例如在ManiatisT，F(xiàn)ritschEF和SambrookJ(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室操作手冊，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor(NY)和SilhavyTJ，BermanML和EnquistLW(1984)基因融合實(shí)驗(yàn)，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor(NY)以及在AusubelFM等人.(1987)現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，GreenePublishingAssoc,andWileylnterscience和Gelvin等人(19卯)植物分子生物學(xué)手冊中的描述。然而，兩個(gè)序列之間也可能存在另外的序列，例如作為具有限制性內(nèi)切酶的特異切割位點(diǎn)的連接序列、或信號肽序列。序列的插入也可能導(dǎo)致融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。優(yōu)選地，包含啟動子和要表達(dá)的核酸序列相連接的表達(dá)構(gòu)建體可以以載體整合的形式存在，并且例如通過轉(zhuǎn)化被插入到細(xì)菌基因組中?；蛑赣行нB接于能夠以某種方式調(diào)控多肽表達(dá)的合適調(diào)控序列的編碼序列?；虬ㄔ诰幋a區(qū)(開放讀碼框，ORF)前(上游)和后(下游)的DNA非翻譯調(diào)控區(qū)(例如啟動子、增強(qiáng)子、抑制子等等)，適用情況下也包括在各編碼區(qū)(即外顯子)之間的插入序列(即內(nèi)含子)?；蛞部梢园ㄎ挥谛蛄械?，-和3，-端的序列，其存在于RNA轉(zhuǎn)錄本中。這些序列指"側(cè)翼"序列或區(qū)(這些側(cè)翼序列位于mRNA轉(zhuǎn)錄本中的5，或3，非翻譯序列)。5，-側(cè)翼區(qū)可以包含調(diào)控序列，例如啟動子和增強(qiáng)子，其控制或影響基因的轉(zhuǎn)錄。3，-側(cè)翼區(qū)可以包含直接終止轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后切割和多聚腺苷酸化的序列。生物體的基因組和基因組DNA:此處用來指在DNA中(或?qū)τ谀承┎《驹赗NA中)編碼的生物體的全部遺傳信息。這既包括基因，也包括非編碼序列。術(shù)語"染色體DNA"或"染色體DNA序列"應(yīng)理解為不依賴于細(xì)胞周期狀態(tài)的細(xì)胞基因組DNA。因此染色體DNA可以以不同形式組織，它們可以是聚集的或解螺旋的?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域內(nèi)公知的多種方法來證明和分析染色體DNA的插入，例如通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析、DNA印跡分析、熒光原位雜交(FISH)和原位PCR。異源的對于核酸序列，指連接于核酸序列的核苷酸序列，其在天然情況下不連接于核酸序列或連接于核酸序列的不同位置。雜交用于此處包括"核酸鏈與互補(bǔ)鏈通過堿基配對連接的任意方法"(Coombs1994,生物技術(shù)字典，StocktonPress,NewYorkN.Y.)。雜交和雜交強(qiáng)度(即核酸之間結(jié)合的強(qiáng)度)受到以下因素的影響，如核酸之間的互補(bǔ)程度、涉及的嚴(yán)格性條件、形成的雜化物的Tm值、和核酸內(nèi)部的G:C比例。此處所用術(shù)語"Tm"參考"解鏈溫度"使用。解鏈溫度是雙鏈核酸分子群體的一半解鏈變成單鏈的溫度。計(jì)算核酸Tm值的公式是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的。以標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)表示，當(dāng)核酸在lMNaCl水溶液中時(shí)，Tm值的簡單評估可以通過公式Tm=81.5+0.41(%G+C)來計(jì)算[見例如Anderson和Young，QuantitativeFilterHybridization,inNucleicAcidHybridization(1985)j。其他參考文獻(xiàn)包括更高級的計(jì)算，其在計(jì)算Tm值的過程中考慮到結(jié)構(gòu)和序列特征。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知可以應(yīng)用許多雜交條件來構(gòu)成低或高嚴(yán)格性條件；例如考慮探針的長度和本性(DNA、RNA、堿基組成)，和靶的特性(DNA、RNA、堿基組成、存在于溶液中或固定的等等)，以及鹽和其他組分的濃度(例如是否存在甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇)，而且雜交溶液可以是多種多樣的，從而產(chǎn)生低或高嚴(yán)格性雜交條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知優(yōu)選更高的嚴(yán)格性從而減少或消除本發(fā)明內(nèi)含子的核苷酸序列與其他核酸序列之間的非特異性結(jié)合，而優(yōu)選較低的嚴(yán)格性來檢測大量與本發(fā)明的核苷酸序列具有不同同源性的核酸序列。此類條件在Sambrook(分子克??；實(shí)驗(yàn)室操作手冊，笫二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，NY(1989))或現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)6.3.1-6.3.6中描述。優(yōu)選的雜交條件在詳述中公開。同一性當(dāng)用于核酸時(shí)指互補(bǔ)的程度。兩核酸之間的同一性應(yīng)理解為各情況下核酸序列在序列全長水平的同一性，其在程序算法GAP(WisconsinPackageVersion10.0，UniversityofWisconsin,GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison,USA)的輔助下通過比較來計(jì)算，所用參數(shù)如下缺口加權(quán)12，長度加權(quán)4，平均匹配2912，平均不匹配-2003。例如，在核酸水平上與SEQIDNo:1序列具有至少95%同一性的序列應(yīng)理解為以上述參數(shù)組用上述程序算法與SEQIDNo:l序列相比較具有至少95%同一性的序列。其可以是部分的同一性(即小于100%的部分同一性)或完全同一性(即100%的完全同一性)。誘導(dǎo)當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法使用時(shí)，指在所用的驅(qū)動共軛亞油酸異構(gòu)酶表達(dá)的啟動子是誘導(dǎo)型啟動子的情況下，用(i)亞油酸或(ii)表達(dá)誘導(dǎo)劑接種細(xì)胞培養(yǎng)物。引入對于細(xì)胞，指要引入細(xì)菌細(xì)胞的重組DNA表達(dá)構(gòu)建體。術(shù)語引入包含例如轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化的方法。分離當(dāng)用于根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的共軛亞油酸時(shí)，指從發(fā)酵液、發(fā)酵液離心后的細(xì)菌沉淀/細(xì)菌細(xì)胞膜或上清中提取(i)發(fā)酵油、或(ii)脂肪酸/脂類部分、或(iii)共輒亞油酸、或(iv)反-10，順-12共軛亞油酸的方法(見實(shí)施例)?？梢酝ㄟ^分批操作或補(bǔ)料-分批操作來分離。在分批操作中，所用的所有成分在起始時(shí)加入到加工器皿中，并在發(fā)酵過程中不添加或撤出材料。在補(bǔ)料-分批操作中，在發(fā)酵過程中可以添加或收集材料。微生物用于此處指Woese所定義的酵母種和細(xì)菌(Woese等人,"Towardsanaturalsystemoforganisms:proposalforthedomainsArchaea，Bacteria,andEucarya."Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87:4576-4579)，優(yōu)選的微生物選自乳酸桿菌科、鏈球菌科、丙酸桿菌科、腸桿菌科和雙歧桿菌科，更優(yōu)選所用微生物選自乳球菌屬、乳酸桿菌屬、丙酸桿菌屬、大腸桿菌屬和雙歧桿菌屬，尤其優(yōu)選所述^:生物選自乳酸乳球菌、副干酪乳桿菌和大腸桿菌，包括乳酸桿菌種、雙歧桿菌種、乳球菌種和酵母。核酸指脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其單鏈或雙鏈、正義或反義形式的聚合物或雜化物。除非另外說明，特定核酸序列也包含其保守修飾的變體(例如簡并密碼子取代)和互補(bǔ)序列，以及明確標(biāo)明的序列。術(shù)語"核酸"可以用于描述"基因"、"cDNA"、"DNA"、"mRNA""寡核苦酸"和"多核苷酸"。核^列用于此處指DNA片段(寡核苷酸、多核苷酸、基因組DNA、cDNA等等)的連續(xù)的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸(核苷酸)序列，可以通過DNA測序技術(shù)獲得代表核苷酸的縮寫、字母、字符或字碼的列表。核酸分子用于此處指生理上存在于基因組DNA、合適載體或質(zhì)粒中的DNA分子。核酸分子通過核酸序列來定義。術(shù)語"營養(yǎng)制品，，是"營養(yǎng)的，，和"藥物的"組合，其指對人健康具有有益作用的食品。營養(yǎng)制品是其為食品或食品的部分的任意物質(zhì)，并且提供醫(yī)藥或健康益處，包括預(yù)防和治療疾病。此類產(chǎn)品的范圍可以從分離的營養(yǎng)素、食品添加物和特異飲食到基因工程設(shè)計(jì)的食品、草藥制品、和加工的食品例如谷類、湯和々大料。光密度(或吸光度)對于細(xì)菌培養(yǎng)物，是所述培養(yǎng)物的混濁度(光密度)。為測量光密度，用分光光度計(jì)確定通過細(xì)胞懸浮液的波長600nm的光的量?；鞚岫然蚨嗷蛏倥c細(xì)胞數(shù)或量直接相關(guān)。光密度直接與細(xì)胞濃度成比例。更高的細(xì)胞濃度導(dǎo)致更高的光密度。在分光光度計(jì)中，用光電管來測量通過樣品的光。如果樣品的細(xì)胞密度增加，即變得更為混濁，那么散射光的量就會更大而不能到達(dá)光電管。以光密度(OD)或吸光度(A)單位的形式測量。OD(A)=loglo/l其中1『落在樣品上的入射光1=透射光；通過樣品到達(dá)光電管的光量?？梢援a(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線從而使細(xì)胞數(shù)或量與光密度讀數(shù)相關(guān)聯(lián)，即確定包含不同微生物量的一系列樣品的光密度和細(xì)胞數(shù)(或量)。通常樣品的光密度與細(xì)胞密度直接相關(guān)(在Klett-Summerson比色計(jì)中，1A單位=500Klett單位)。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>其他未改變的條件指，例如，由要比較的表達(dá)構(gòu)建體之一起動的表達(dá)不通過與另外的遺傳控制序列(例如增強(qiáng)子序列)的組合來修飾，并且該行。益生菌定義為活的微生物，包括乳酸桿菌種、雙歧桿菌種、乳球菌種和酵母，其被宿主攝入以后通過促進(jìn)腸內(nèi)微生物群的平衡從而對宿主起到有益作用。以下描迷用作益生菌的多種細(xì)菌和酵母雙歧桿菌屬雙歧桿菌是人和動物結(jié)腸中的正常定居者。新生兒(尤其是那些母乳喂養(yǎng)的新生兒)在出生后數(shù)天即有雙歧桿菌定居。雙歧桿菌是首先從母乳喂養(yǎng)的嬰兒的糞便中分離出來的。這些結(jié)腸中的細(xì)菌種群相對穩(wěn)定，直到年老時(shí)才出現(xiàn)衰退。許多因素可以影響雙歧桿菌種群，包括飲食、抗生素和脅迫。雙歧桿菌是革蘭氏陽性厭氧菌。它們是無運(yùn)動、無芽胞形成和過氧化氫酶陰性。它們具有多種形狀，包括短桿狀、彎曲桿狀、棒形桿狀和兩部分Y形桿狀。其名稱由它們通常以Y形或分叉形的形式存在而衍生。其DNA的鳥噪呤和胞嘧咬含量在54摩爾％到67摩爾°/。之間。它們是糖解生物體，除在降解葡糖酸鹽的過程中，其產(chǎn)生乙酸和乳酸而不產(chǎn)生C02。它們也分類為乳酸細(xì)菌(LAB)。迄今為止，分離了30個(gè)雙歧桿菌種。用于益生菌的雙歧桿菌包括青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)、動物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis)、嗜熱雙歧桿菌(Bifidobacteriumthermophilum)、短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)、長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis)和乳酸雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis)。用于益生菌的特異雙歧桿菌菌林包括短雙歧桿菌菌抹Yakult、短雙歧桿菌R070、乳酸雙歧桿菌Bbl2、長雙歧桿菌R023、兩歧雙歧桿菌R071、嬰兒雙歧桿菌R033、長雙歧桿菌BB536和長雙歧桿菌SBT-2928。乳酸桿菌乳酸桿菌是人腸和陰道中的正常定居者。乳酸桿菌是革蘭氏陽性兼性厭氧菌。它們是無芽胞形成和無鞭毛桿狀或^Mf菌。其DNA的鳥嘌呤和胞嘧咬含量在32摩爾％到51摩爾％之間。它們是耐氧或厭氧的和嚴(yán)格發(fā)酵的。對于同型發(fā)酵菌的情況，葡萄糖主要發(fā)酵為乳酸。乳酸桿菌也分類為乳酸細(xì)菌(LAB)。迄今為止，鑒定了56個(gè)乳酸桿菌屬種。用作益生菌的乳酸桿菌包括嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillusadd叩hilus)、短乳酸桿菌(Lactobacillusbrevis)、保加利亞乳酸桿菌(Lactobacillusbulgaricus)、干酪乳酸桿菌(Lactobacilluscasei)、纖維二糖乳酸桿菌(Lactobacilluscellobiosus)、巻曲乳酸桿菌(Lactobacilluscrispatus)、彎曲乳酸桿菌(Lactobacilluscurvatus)、發(fā)酵乳酸桿菌(Lactobacillusfermentum)、GG乳酸桿菌(鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)或千酪乳桿菌鼠李糖亞種(Lactobacilluscaseisubspeciesrhamnosus))、力口氏乳酸桿菌(Lactobacillusgasseri)、johnsonii乳酸桿菌、植物乳酸桿菌(Lactobacillusplantarum)和唾液乳酸桿菌(Lactobacillussalivarus)。植物乳酸桿菌299v菌林發(fā)現(xiàn)于發(fā)酵的生面團(tuán)中。植物乳酸桿菌本身是人起源的。乳酸桿菌的其他益生菌菌林有嗜酸乳酸桿菌BG2F04、嗜酸乳酸桿菌INT-9、植物乳酸桿菌ST31、羅伊乳酸桿菌(Lactobacillusreuteri)、johnsonii乳酸桿菌LAI、嗜酸乳酸桿菌NCFB1748、干酪乳酸桿菌Shirota、嗜酸乳酸桿菌NCFM、嗜酸乳酸桿菌DDS-1、德氏乳酸桿菌德氏亞種(Lactobacillusdelbmeckiisubspeciesddbmeckii)、德氏乳酸桿菌保加利亞型2038、嗜酸乳酸桿菌SBT-2062、短乳酸桿菌、唾液乳酸桿菌UCC118和副干酪乳桿菌副干酪亞種F19。乳球菌乳球菌是革蘭氏陽性兼性厭氧菌。它們也分類為乳酸細(xì)菌(LAB)。乳酸乳球菌(以前為乳鏈球菌)在乳制品中被發(fā)現(xiàn)，并且通常負(fù)責(zé)乳品的發(fā)酵。用于或正發(fā)展為益生菌的乳球菌包括乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、乳酸乳球菌亞種cremoris(乳脂鏈球菌Streptococcuscremoris)、乳酸乳球菌乳酸亞種NCD0712、乳酸乳球菌乳酸亞種NIAI527、乳酸乳球菌乳酸亞種NIAI1061、乳酸乳球菌亞種lactisbiovardiacetylactisNIAI8W和乳酸乳球菌亞種lactisbiovardiacetylactisATCC13675。啟動子、啟動子元件或啟動子序列用于此處指，當(dāng)連接于目的核苷酸序列時(shí)，能夠控制該目的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA的DNA序列。因此，啟動子是DNA序列上為基因提供表達(dá)控制元件的識別位點(diǎn)，RNA聚合酶特異性地與之結(jié)合并起始該基因的RNA合成(轉(zhuǎn)錄)。啟動子通常(盡管不是必需)位于目的核苷酸序列的5'端(即上游)(例如接近結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))。當(dāng)參考啟動子使用時(shí)，術(shù)語"構(gòu)成型"指啟動子能夠在沒有刺激(例如熱激、化學(xué)、光等等)的情況下直接轉(zhuǎn)錄與其有效連接的核酸序列。通常，構(gòu)成型啟動子基本上能夠在細(xì)胞的任意生理?xiàng)l件下直接表達(dá)轉(zhuǎn)基因。相反，"可調(diào)控型，，啟動子是在存在刺激(例如熱激、化學(xué)、光等等)的情況接的核酸序列的轉(zhuǎn)錄水平。在細(xì)菌中有功能的啟動子序列原則上應(yīng)理解為能夠在細(xì)菌細(xì)胞中指導(dǎo)基因(尤其是外源基因)表達(dá)的任意啟動子。在本發(fā)明中，表達(dá)例如可以是構(gòu)成型的、誘導(dǎo)型的或發(fā)育依賴型的。構(gòu)成型啟動子是RNA聚合酶的結(jié)合和起始率近似恒定并相對不依賴于外界刺激的啟動子。有用的啟動子是構(gòu)成型啟動子，例如cos、tac、trp、tet、trp-tet、Ipp、lac、Ipp-lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、k誦Pn或K啟動子，所有這些啟動子最好用于革蘭氏陰性細(xì)菌中。也包括其他有利的調(diào)控序列，例如革蘭氏陽性啟動子amy和SP02,酵母或真菌啟動子ADC1、MFcx、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH。原則上，可以使用帶有上述其調(diào)控序列的所有天然的細(xì)菌啟動子用于根據(jù)本發(fā)明的方法。另外，使用合成的啟動子也是有利的。多肽、肽、寡肽、基因產(chǎn)物、表達(dá)產(chǎn)物和蛋白質(zhì)此處可以互換使用，指連續(xù)氨基酸殘基的聚合物寡聚物。重組或轉(zhuǎn)基因DNA表達(dá)構(gòu)建體對于例如核酸序列(包含所述核酸序列的表達(dá)構(gòu)建體、表達(dá)盒或載體)指所有通過實(shí)驗(yàn)操作形成的構(gòu)建體，其中a)所述核酸序列，或b)有效連接于所述核酸序列(a)的遺傳控制序列(例如啟動子)，或c)(a)和(b)不位于其天然遺傳環(huán)境中或者通過實(shí)驗(yàn)操作被修飾，修飾的實(shí)例是一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基的取代、添加、缺失、倒置或插入。天然遺傳環(huán)境指起源生物體的天然染色體位點(diǎn)或指基因組文庫中的存在。對于基因組文庫的情況，核酸序列的天然遺傳環(huán)境優(yōu)選是固定的，至少部分固定。環(huán)境至少在核酸序列的一側(cè)，并具有長度至少50bp、優(yōu)選至少500bp、尤其優(yōu)選至少1000bp、特別尤其優(yōu)選至少5000bp的序列。天然存在的表達(dá)構(gòu)建體(例如天然存在的啟動子與相應(yīng)基因的組合)當(dāng)被非天然的合成的"人工"方法(例如誘變)修飾時(shí)，成為轉(zhuǎn)基因表達(dá)構(gòu)建體。此類方法在(US5,565,350;WO00/15815)中描述。重組多肽或蛋白質(zhì)指通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的多肽或蛋白質(zhì)，即由編碼所希望多肽或蛋白質(zhì)的外源重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞所產(chǎn)生。重組核酸和多肽也可以包含不是天然存在的而是被修飾、改變、突變或另外人工操作的分子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，重組DNA表達(dá)構(gòu)建體可使一個(gè)或多個(gè)核酸分子表達(dá)。所述根據(jù)本發(fā)明的重組DNA表達(dá)構(gòu)建體最好包括在細(xì)菌中有功能的啟動子、附加的調(diào)控或控制元件或在細(xì)菌中有功能的序列和在細(xì)菌中有功能的終止子。另外，該重組表達(dá)構(gòu)建體可以包含附加的功能性元件，例如表達(dá)盒，其可以表達(dá)例如陽性和陰性篩選標(biāo)記、才艮告基因、重組酶或核酸內(nèi)切酶(其影響才艮據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒、栽體或重組生物體的產(chǎn)生、擴(kuò)增或功能)。此外，重組表達(dá)構(gòu)建體可以包含與目的細(xì)菌基因同源的核#列，其具有足夠長度從而在引入細(xì)菌中以后誘導(dǎo)目的基因位點(diǎn)的同源重組(HR)事件?？梢酝ㄟ^常用重組和克隆技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的重組轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒(或包含所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因載體)，例如在Maniatisl989，分子克隆實(shí)驗(yàn)室操作手冊，第二版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor(NY);Silhavy1984，和基因融合實(shí)驗(yàn)，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY;以及在Ausubel1987，現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，GreenePublishingAssoc,和WileyInterscience)中的描述。最好可以用載體將根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒引入細(xì)菌，所述載體包含上述核酸、啟動子、終止子、調(diào)控或控制元件和功能性元件。調(diào)控序列指啟動子、增強(qiáng)子或其他DNA片段，其結(jié)合調(diào)控蛋白質(zhì)例如轉(zhuǎn)錄因子，并且由此影響指定基因的轉(zhuǎn)錄效率。術(shù)語瘤胃細(xì)菌指能夠從反芻動物(羊、山羊、牛、鹿等)的瘤胃或胃腸道分離的細(xì)菌，其中反芻動物的消化過程大部分由細(xì)菌來完成。結(jié)構(gòu)基因用于此處指轉(zhuǎn)錄為mRNA的DNA序列，這些mRNA隨后翻譯為特異多肽的特征氨基酸序列。轉(zhuǎn)化用于此處指遺傳材料(例如轉(zhuǎn)基因)引入到細(xì)胞中。細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以是穩(wěn)定的或瞬時(shí)的。術(shù)語"瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，，或"瞬時(shí)地轉(zhuǎn)化"指一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因引入細(xì)胞，而轉(zhuǎn)基因不整合到宿主細(xì)胞基因組中。術(shù)語"瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體，，指瞬時(shí)摻入一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞。相反，術(shù)語"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化"或"穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化"指一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因引入并整合到細(xì)胞基因組中，優(yōu)選得到染色體整合和穩(wěn)定遺傳。細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化可以用能夠結(jié)合一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因的核酸序列通過細(xì)胞基因組DNA的DNA印跡雜交來檢測?？蛇x擇地，細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化也可以通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在細(xì)胞基因組DNA中擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因來檢測。術(shù)語"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體"指一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定整合到基因組DNA中的細(xì)胞。因此，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體與瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體的區(qū)別在于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的基因組DNA包含一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因，而瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體的基因組DNA不包含轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)化也包括以載體的形式將遺傳材料引入細(xì)菌中，涉及染色體復(fù)制和基因表達(dá)。這些載體可以在宿主生物體中自主復(fù)制。轉(zhuǎn)基因或重組當(dāng)參考細(xì)胞使用時(shí)，指包含轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞、或其基因組通過引入的轉(zhuǎn)基因改變的細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可以由幾種方法產(chǎn)生，包括向靶細(xì)胞中引入(如上所述)包含核酸(通常是DNA)的"轉(zhuǎn)基因"或通過人為干涉(例如通過此處所述方法)將轉(zhuǎn)基因整合到靶細(xì)胞的染色體中。對于反芻動物，技術(shù)人員可以在下列出版物中找到合適的方法Gregg，K.，Teather，R.M.(1992)Thegeneticmanipulationofrumenbacteria,in"Manipulationofrumenmicroorganisms".K.El-Shazly.Alphagraph，Alexandria,Egypt編輯，第1-12頁.Gregg,K.,Schafer，D.，Cooper,C，Alien,G.(1995)Geneticmanipulationofrumenbacteria:nowareality,in"RumenEcologyResearchPlanning.J.Wallace,A.Lahlou-Kassi編輯.Intl.Livestock.Res.Inst.Nairobi,Kenya,第227-240頁.Beard，C.E.，Hefford，M.A"Forster，R.J.，Sontakke,S"Teather,R.M"Gregg,K.(1995)StableandefficienttransformationsystemforButyrivibriofibrisolvensOB156.CurrentMicrobiol.30:105-109.Gregg,K.，Allen,G"Beard,C.(1996)Geneticmanipulationofrumenbacteria:frompotentialtoreality.Aust.J.Agric.Res.47:247-256.Wong,CM.，Klieve，A.V"Hamdorf，B.J.，Schafer，D.J.，Brau,L.，Seet，S.G.M.Gregg,K.(2003)FamilyofshuttlevectorsforruminalBacteroides.J.Mol.Microbiol.Biotech.5:57-66.對于乳球菌和乳酸桿菌，技術(shù)人員可以在下列出版物中找到合適的方法根據(jù)Ruyter等人(1996)描述的方法制備和轉(zhuǎn)化電感受態(tài)乳酸乳桿菌，而根據(jù)Luchansky等人(1988)的描述用3.5xSMEB(1M蔗糖，3.5mMMgCl2)制備電感受態(tài)副干酪乳桿菌NFBC338細(xì)胞。用DNAStar軟件(DNAStar，Madison,Wisconsin,USA)進(jìn)行序列分析，deRuyter，P.G.，O.P.Kuipers，和W.M.deVos.1996.ControlledgeneexpressionsystemsforLactococcuslactiswiththefood-gradeinducernisin.ApplEnvironMicrobiol62:3662-7.Luchansky，J.B.，P.M.Muriana，和T.R.Klaenhammer.1988.ApplicationofelectroporationfortransferofplasmidDNAtoLactobacillus,Lactococcus,Leuconostoc，Listeria,Pediococcus，Bacillus,Staphylococcus,EnterococcusandPropionibacterium.MolMicrobiol2:637-46。治療此處關(guān)于癌癥治療指包含發(fā)酵油的藥物在治療上的應(yīng)用，優(yōu)選包含純化的共輒亞油酸、更優(yōu)選用本發(fā)明方法產(chǎn)生的反-10，順-12共軛亞油酸。所述治療上的應(yīng)用應(yīng)該理解為廣義的，包含例如所述藥物用于(i)預(yù)防癌細(xì)胞形成、(ii)減少或終止癌細(xì)胞生長、和/或(iii)預(yù)防癌細(xì)胞在機(jī)體中擴(kuò)散的應(yīng)用。野生型，天然或天然來源的對于生物體、多肽或核酸序列，指所述生物體、多肽或核酸序列是天然存在的或從至少一種天然存在的生物體、多肽或核酸序列中獲得的，并且未經(jīng)改變、突變或其他人為操作。載體能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA分子。質(zhì)粒和粘粒是載體的實(shí)例。此外，術(shù)語"載體"和"運(yùn)載體"可參考從一個(gè)細(xì)胞向另一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移DNA片段的核酸分子而互換使用，其中細(xì)胞不需要屬于同樣生物體(例如向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移DNA片段形成農(nóng)桿菌屬細(xì)胞)。此處所用術(shù)語"表達(dá)載體"指包含所希望的編碼序列和在特定宿主生物體中表達(dá)有效連接的編碼序列所需的合適核酸序列的DNA分子。發(fā)明詳述可以根據(jù)本發(fā)明在轉(zhuǎn)基因微生物中生產(chǎn)反-10，順-12共軛亞油酸。本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案涉及在轉(zhuǎn)基因微生物中生產(chǎn)反-10，順-12共輒亞油酸的方法，包括以下步驟(a)向所述微生物中引入至少一種編碼反-10，順-12共軛亞油酸異構(gòu)酶的核酸分子，(b)培養(yǎng)由(a)獲得的轉(zhuǎn)基因微生物，(c)向培養(yǎng)物中加入亞油酸來誘導(dǎo)產(chǎn)生反-10，順-12共軛亞油酸，(d)誘導(dǎo)培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)至少12小時(shí)，和(e)從培養(yǎng)基和/或微生物中分離共軛亞油酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)上述步驟(a)到(e)在轉(zhuǎn)基因微生物中生產(chǎn)共軛亞油酸的方法，其特征在于所產(chǎn)生的共軛亞油酸是不同CLA同工型的混合物，其包含至少30%、優(yōu)選至少40%、更優(yōu)選至少50%、尤其優(yōu)選至少60%、特別尤其優(yōu)選至少70%、最優(yōu)選至少80%的反-10，順-12共軛亞油酸。另外，通過技術(shù)人員公知的方法(例如結(jié)晶)可以進(jìn)一步有利地增加反-10，順-12共輒亞油酸的異構(gòu)純度。在本發(fā)明的此外優(yōu)選的實(shí)施方案中，如(a)所述引入微生物中的核酸分子編碼具有共軛亞油酸異構(gòu)酶活性的多肽，其能夠使亞油酸(順-9，順-12共輒亞油酸)轉(zhuǎn)化為反_10，順-12共輒亞油酸，該核酸分子選自如下i.具有SEQIDNo.1所述序列的核酸分子，或ii.由(i)中所述核酸分子編碼的多肽的功能性等同物，例如a.具有SEQIDNo.1所述序列的至少50個(gè)、優(yōu)選至少75個(gè)、更優(yōu)選至少100個(gè)、尤其優(yōu)選至少125個(gè)、特別尤其優(yōu)選至少150個(gè)連續(xù)堿基對的核酸分子，或b.與SEQIDNo.l所述序列的至少100個(gè)、優(yōu)選至少125個(gè)、更優(yōu)選至少150個(gè)、尤其優(yōu)選至少175個(gè)、特別尤其優(yōu)選至少200個(gè)連續(xù)核酸堿基對的序列具有至少80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、尤其優(yōu)選至少95%、特別尤其優(yōu)選至少98%同一性的核酸分子，或c.在高嚴(yán)格性條件下與SEQIDNo.1所述序列的至少50個(gè)、優(yōu)選至少100個(gè)、更優(yōu)選至少150個(gè)、尤其優(yōu)選至少200個(gè)、特別尤其優(yōu)選至少500個(gè)連續(xù)堿基對的核酸片段雜交的核酸分子，或d.編碼與SEQIDNo.2所示氨基酸序列具有至少75%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選90%、尤其優(yōu)選至少95%、特別尤其優(yōu)選至少98%同一性的多肽的核酸分子。原則上可以從所有微生物中鑒定和分離在(i)和(ii)中定義的核列。SEQIDNo.1或其同系物/功能性等同物最好從細(xì)菌、優(yōu)選能夠產(chǎn)生共軛脂肪酸的細(xì)菌中分離。所述細(xì)菌可以是革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽性細(xì)菌。菌中分離，例如從丙酸桿菌、乳球菌、雙歧桿菌或乳酸桿菌中，最好從雙歧桿菌中分離。SEQIDNo.1序列的功能性衍生物還應(yīng)理解為例如的具有至少75%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、尤其優(yōu)選至少95%、特別尤其優(yōu)選至少98%同一性的等位變體。按一般定義所描述或使用另外的計(jì)算機(jī)程序(如PileUp)來計(jì)算同一性(J.Mol.Evolution.,25(1987)，351-360，Higgins等人，CABIOS，51989:151-153)。從上述核酸衍生的氨基酸序列是SEQIDNo.2所描述的序列。具體地，等位變體包含從SEQIDNo.l所示序列通過核苷酸缺失、插入或取代獲得的功能性變體，并保持了衍生的合成蛋白質(zhì)的酶活性。上述共輒亞油酸異構(gòu)酶的功能性等同物可以通過在核酸數(shù)據(jù)庫中的同源檢索來確定，或用SEQIDNo.l所述核酸分子的至少50個(gè)、優(yōu)選至少100個(gè)、更優(yōu)選至少150個(gè)、尤其優(yōu)選至少200個(gè)、特別尤其優(yōu)選至少500個(gè)連續(xù)堿基對的片段和嚴(yán)格性條件通過DNA雜交(基因組DNA文庫篩選)來確定。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，嚴(yán)格性雜交條件可以選自如下雜交緩沖液包含甲酰胺、NaCl和PEG6000(聚乙二醇，分子量6000)。曱酰胺具有使雙鏈核酸分子失穩(wěn)定的作用，因此，當(dāng)用于雜交緩沖液時(shí)，其使雜交溫度降低到42。C而不減少雜交嚴(yán)格性。NaCl對DNA雙鏈體的退火速率和DNA探針與其互補(bǔ)DNA靶的雜交效率具有正面的影響。PEG增加雜交緩沖液的粘度，從而原則上對雜交效率產(chǎn)生負(fù)面影響。雜交緩沖液的組成如下250mMpH7.2的磷酸鈉緩沖液、1mMEDTA(乙二胺四乙酸)、7%SDS(g/v)(十二烷基石克酸鈉)、250mMNaCl(氯化鈉)、10jig/ml單鏈DNA、5。/o聚乙二醇(PEG)6000、40%甲酰胺。_雜交優(yōu)選在42。C過夜進(jìn)行。第二天早上，用2xSSC+0.1%SDS洗雜交濾器3次，每次10分鐘。雜交最好用長度至少為50、60、70或80bp、優(yōu)選至少90bp的片段進(jìn)行。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，雜交應(yīng)以上述條件用全長核酸序列進(jìn)行。技術(shù)人員可以在下述教科書中找到雜交的更多信息Ausubel等人(eds)，1985，現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，JohnWiley&Sons,NewYork;Hames和Higgins(eds)，1985,核酸雜交實(shí)踐入門，IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford;Brown(ed)，1991，基本分子生物學(xué)實(shí)踐入門，IRJLPressatOxfordUniversityPress,Oxford.根據(jù)本發(fā)明的氨基酸序列應(yīng)理解為包含SEQIDNo.2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或通過取代、倒置、插入或缺失SEQIDNo.2中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基獲得的序列，其中仍然保持或基本不減少SEQIDNo.2所示蛋白質(zhì)的酶活性。術(shù)語基本不減少應(yīng)理解為具有起始酶的至少10%、優(yōu)選20%、尤其優(yōu)選30。/。酶活性的所有酶。例如，特定氨基酸可以用其他具有相似理化性質(zhì)(空間維數(shù)、堿性、疏水性等等)的氨基酸所取代。例如，精氨酸殘基變?yōu)橘嚢彼釟埢?、纈氨酸殘基變?yōu)楫惲涟彼釟埢蛱於彼釟埢優(yōu)楣劝彼釟埢?。或者，可能通過添加或除去一個(gè)或多個(gè)氨基酸、或通過這些方法中的兩個(gè)或多個(gè)彼此組合來交換序列。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述反-10,順-12共軛亞油酸異構(gòu)酶是從瘤胃細(xì)菌(優(yōu)選從埃氏巨球型菌YJ-4)中分離的。在本發(fā)明此外尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼反-10，順-12共軛亞油酸異構(gòu)酶的核酸分子是從丙酸桿菌屬(優(yōu)選痤瘡丙酸桿菌)中分離的。在本發(fā)明的特別尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述反-10，順-12共軛亞油酸異構(gòu)酶是來自痤癡丙酸桿菌的具有登錄號CQ766028的反-10，順-12共軛亞油酸異構(gòu)酶(SEQIDNo.1)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，上述核酸分子是重組或轉(zhuǎn)基因DNA表達(dá)構(gòu)建體(如一般定義中所定義的)的部分。重組或轉(zhuǎn)基因DNA表達(dá)構(gòu)建體應(yīng)理解為SEQIDNo.1中給出的序列，或由SEQIDNo.1所述核酸分子編碼的多肽的功能性等同物(如上述(ii)中定義的，其功能性連接于有利于增加基因表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控信號)。這些調(diào)控序列是例如誘導(dǎo)物或抑制物結(jié)合的序列并且因而調(diào)控該核酸的表達(dá)。除這些新的調(diào)控序列以外，或代替這些序列，可能在實(shí)際結(jié)構(gòu)基因上游仍存在這些序列的天然調(diào)控，如果需要也可以進(jìn)行遺傳上的改變，從而關(guān)閉天然調(diào)控而增加基因表達(dá)。然而，基因構(gòu)建體的表達(dá)也可以具有簡單的結(jié)構(gòu)，即在序列或其衍生物上游不插入另外的調(diào)控信號，并且不除去調(diào)控其的天然啟動子?；蛘呤菍⑻烊徽{(diào)控序列突變從而不發(fā)生天然調(diào)控而增加基因表達(dá)。這些改變的啟動子也可以獨(dú)自放置在天然基因的上游，從而增加活性。另外，基因構(gòu)建體最好還包含一個(gè)或多個(gè)與啟動子功能性連接的所謂增強(qiáng)子序列，以增強(qiáng)核,列的表達(dá)。也可能在DNA序列的3，端插入其他有利的序列，例如其他的調(diào)控元件或終止子。在基因構(gòu)建體中可以包含共軛亞油酸異構(gòu)酶基因的一個(gè)或多個(gè)拷貝。用于本發(fā)明方法的有利調(diào)控序列包含在例如啟動子，例如cos、tac、trp、tet、trp-tet、Ipp、lac、Ipp-lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、Ur或X-PL啟動子中，所有這些啟動子都最好在革蘭氏陰性細(xì)菌中使用。其他有利的調(diào)控序列包含在例如革蘭氏陽性啟動子amy和SP02、酵母或真菌啟動子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。原則上，根據(jù)本發(fā)明的方法可以使用所有具有上述調(diào)控序列的天然啟動子。另外使用合成的啟動子也是有利的。為了表達(dá)存在的基因，所述重組或轉(zhuǎn)基因DNA表達(dá)構(gòu)建體最好包含另外的3，和/或5'末端調(diào)控序列來增強(qiáng)表達(dá)，根據(jù)所選宿主生物體或基因來選擇這些調(diào)控序列，以達(dá)到最佳表達(dá)。這些調(diào)控序列旨在使特異基因表達(dá)成為可能。這意味著取決于宿主生物體，例如該基因僅在誘導(dǎo)后表達(dá)或過表達(dá)，或者立即表達(dá)和/或過表達(dá)。為此，優(yōu)選調(diào)控序列或因子對引入基因的表達(dá)具有正面影響，因而增強(qiáng)該基因的表達(dá)。因此，使用強(qiáng)轉(zhuǎn)錄信號(例如啟動子和/或增強(qiáng)子)在轉(zhuǎn)錄水平上增強(qiáng)調(diào)控元件是有利的。然而，也可以通過例如改良RNA穩(wěn)定性來增強(qiáng)翻譯。重組或轉(zhuǎn)基因DNA表達(dá)構(gòu)建體也可以包含引入生物體的另外基因。這些基因可以與根據(jù)本發(fā)明的異構(gòu)酶基因在分離的調(diào)控下或在相同的調(diào)控區(qū)調(diào)控下。這些基因是例如其他生物合成基因，最好是脂肪酸和脂類合成，其可以增加異構(gòu)酶起始材料(例如亞油酸)的合成。為了實(shí)現(xiàn)在生物體中異源基因的最佳表達(dá)，最好根據(jù)生物體的特定密碼子使用來修飾核酸序列?；谟?jì)算機(jī)評估有關(guān)生物的其他已知基因，可以容易地確定"密碼子使用"。為了實(shí)現(xiàn)在宿主生物體中、例如微生物中(例如酵母或細(xì)菌)的表達(dá)，最好將核酸片段插入到載體中，例如質(zhì)粒、噬菌體或其他DNA，這可使基因在宿主中最優(yōu)表達(dá)。合適的質(zhì)粒的實(shí)例是大腸桿菌的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、plN-lll113-Bl、kgtll或pBdCl，鏈霉菌的plJ101、plJ364、plJ702或plJ361，桿菌的pUB110、pC194或pBD214，棒狀桿菌的pSA77或pAJ667,真菌的pALSl、plL2或pBBl16，酵母中的2ocM、pAG-l、YEp6、YEpl3或pEMBLYe23，或上述質(zhì)粒的衍生物。所述質(zhì)粒是可能質(zhì)粒的一小部分選擇。其它質(zhì)粒是技術(shù)人員所熟知的，并且能夠在例如《克隆載體》(PouwelsP.H.等人編輯Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985,ISBN0444卯4018)中找到。合適的植物載體尤其在1直物分子生物合生物技術(shù)方法"(CRCPress),第6/7章，pp.71-119描述。除質(zhì)粒以外，載體也指技術(shù)人員所公知的所有其它載體，例如噬菌體、IS元件、線性或環(huán)狀DNA。這些載體可以在宿主生物體中自主復(fù)制或隨染色體復(fù)制。優(yōu)選自主復(fù)制的載體。載體最好包含根據(jù)本發(fā)明的核酸序列的至少一個(gè)拷貝。為了表達(dá)所包含的其他基因，核酸片段還有利地包含3，和/或5'末端調(diào)控序列來增強(qiáng)表達(dá)，這些序列根據(jù)宿主生物和基因的選擇而加以選擇，以達(dá)到最佳表達(dá)。這些調(diào)控序列可使靶基因表達(dá)。這意味著取決于宿主生物體，例如基因只在誘導(dǎo)后表達(dá)和/或過表達(dá)，或者立即表達(dá)和/或過表達(dá)。優(yōu)選調(diào)控序列或因子具有正面影響，因而增強(qiáng)被引入的基因的表達(dá)。因此，使用強(qiáng)轉(zhuǎn)錄信號(例如啟動子和/或增強(qiáng)子)在轉(zhuǎn)錄水平增強(qiáng)調(diào)控元件是有利的。然而，除此之外，也可能通過例如改良mRNA穩(wěn)定性來增強(qiáng)翻譯0在另一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的基因構(gòu)建體也可能以線性DNA的形式被有利地引入生物體中，并通過異源或同源重組的方式整合到宿主生物體的基因組中。此線性DNA可能由線性化質(zhì)粒組成，或僅由作為載體的核酸片段組成，或由根據(jù)本發(fā)明的核酸序列組成。根據(jù)本發(fā)明的核酸序列最好與至少一種才艮告基因共同克隆到核酸構(gòu)建體中，并且將核酸構(gòu)建體引入基因組中。該報(bào)告基因應(yīng)該可以通過生長測定、熒光測定、化學(xué)測定、生物發(fā)光測定或抗性測定、或通過光度計(jì)測量而容易地檢測。相關(guān)報(bào)告基因的實(shí)例是抗生素(例如氨節(jié)青霉素、氯霉素、四環(huán)素、紅霉素)抗性基因或水解酶基因、熒光蛋白質(zhì)基因、生物發(fā)光基因、糖代謝基因或核苷酸代謝基因、或生物合成基因(例如Ura3基因、11v2基因、熒光素酶基因、P-半乳糖苷酶基因、gfp基因、2-脫氧葡萄糖-6-磷酸鹽磷酸酶基因、p-葡糖苷酸酶基因、p-內(nèi)酰胺酶基因、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因或潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)。在本發(fā)明的另一有利實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸序列也可以單獨(dú)引入生物體中。如果試圖向生物體中引入除根據(jù)本發(fā)明的核^列以外的其他基因，它們可以同在一個(gè)具有報(bào)告基因的載體中、或每個(gè)載體含有一個(gè)單獨(dú)基因與報(bào)告基因，可以同時(shí)或連續(xù)引入多個(gè)載體。宿主生物體(=轉(zhuǎn)基因生物體)最好含有根據(jù)本發(fā)明的核酸和/或根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的至少一個(gè)拷貝。原則上，可以通過技術(shù)人員公知的方法將根據(jù)本發(fā)明的核酸、核酸構(gòu)建體或載體引入生物體(例如細(xì)菌)中。對于微生物的情況，技術(shù)人員可以在教科書中找到合適的方法，如在Sambrook，J.等人(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室操作手冊，ColdSpringHarborLaboratoryPress,F.M.Ausubel等人(1994)現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，JohnWiley和Sons,D.M.Glover等人，DNA克隆，第1巻，(1995)，IRLPress(ISBN019-963476-9)，Kaiser等人(1994)酵母遺傳方法，ColdSpringHarborLaboratoryPress或Guthrie等人，酵母遺傳和分子生物學(xué)指導(dǎo)，酶學(xué)方法，1994，AcademicPress中。根據(jù)本發(fā)明的方法中合適的生物體或宿主生物體(轉(zhuǎn)基因生物體)原則上是所有能夠合成不飽和脂肪酸的生物體和適合于表達(dá)重組基因的生物體。其實(shí)例選自乳酸桿菌科、鏈球菌科、丙酸桿菌科、腸桿菌科和雙歧桿菌科，優(yōu)選選自乳球菌屬、乳酸桿菌屬、大腸桿菌屬和雙歧桿菌屬，最優(yōu)選所述^:生物選自乳酸乳球菌、副干酪乳桿菌和大腸桿菌。技術(shù)人員已知精細(xì)化學(xué)藥品生產(chǎn)的其他合適來源，其也代表有用的核酸分子來源。它們通常包括所有原核或真核細(xì)胞，優(yōu)選單細(xì)胞微生物，例如真菌如麥角菌屬(Claviceps)或曲霉(Aspergillus),或革蘭氏陽性細(xì)菌如桿菌屬(Bacillus)、才奉狀桿菌屬(Corynebacterium)、細(xì)球菌屬(Micrococcus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、紅球菌屬(Rhodococcus)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、乳酪桿菌屬(Caseobacter)或節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)，或革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌屬(Escherichia)、黃桿菌屬(Flavobacterium)或沙門氏菌屬(Salmonella)，或酵母例如赤釀酵母屬(Rhodotorula)、漢森酵母屬(Hansenula)或假絲酵母屬(Candida)。在根據(jù)本發(fā)明方法中尤其有利的生產(chǎn)菌抹選自放線菌科(Actinomycetaceae)、芽胞桿菌科(Bacillaceae)、短桿菌科(Brevibacteriaceae)、棒狀軒菌科(Corynebacteriaceae)、腸軒菌科(Enterobacteriacae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、孩吏J求菌科(Micrococcaceae)、分枝桿菌科(Mycobacteriaceae)、諾卡氏菌科(Nocardiaceae)、假單月包菌科(Pseudomonaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、鏈霉菌科(Streptomycetaceae)、毛殼菌科(Chaetomiaceae)、笄霉科(Choanephoraceae)、隱球菌科(Cryptococcaceae)、小克銀漢霉科(Cunninghamellaceae)、Demetiaceae、念珠菌科(Moniliaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、毛霉菌科(Mucoraceae)、腐霉科(Pythiaceae)、酵母菌科(Sacharomycetaceae)、7jC霉科(Saprolegniaceae)、裂殖酵母菌科(Schizosacharomycetaceae)、糞殼菌科(Sodariaceae)、擲孢酵母科(Sporobolomycetaceae)、結(jié)節(jié)菌科(Tuberculariaceae)、Adelotheciaceae、甲藻綱(Dinophyceae)、牛毛蘚科(Ditrichaceae)和綠色鞭毛藻綱(Prasinophyceaeor),選自異常漢森酵母屬(Hansenulaanomala)、假絲酵母屬(Candidautilis)、麥角菌屬(Clavicepspurpurea)、環(huán)狀芽胞桿菌屬(Bacilluscirculans)、枯草芽胞桿菌屬(Bacillussubtilis)、桿菌屬(Bacillussp.)、乳白少豆桿菌(Brevibacteriumalbidum)、Brevibacteriumalbum、Brevibacteriumcerinum、黃色短軒菌屬(Brevibacteriumflavum)、Brevibacteriumglutamigenes、多輿短桿菌屬(Brevibacteriumiodinum)、Brevi-bacteriumketoglutamicum、Brevibacteriumlactofermentum、擴(kuò)展短桿菌屬(Brevibacteriumlinens)、Brevibacteriumroseum、Brevibacteriumsaccharolyticum、短軒菌屬(Brevibacteriumsp.)、Coryne-bacteriumacetoacidophilum、醋谷氛酸棒狀桿菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)、Corynebacteriumammoniagenes、谷氛酸棒狀軒菌屬(Corynebacteriumglutamicum)(=谷氛酸微球菌)、Coryne-bacteriummelassecola、棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)或大腸桿菌屬(Escherichiacoli)尤其是大腸桿菌K12和其衍生菌抹。尤其優(yōu)選的是那些分類于或用作益生菌(如一般定義中所定義的)的細(xì)菌。依據(jù)宿主生物體，按本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法生長或培養(yǎng)上述過程中使用的生物體。微生物通常生長在液體培養(yǎng)基中，其中包含碳源(通常以糖的形式)、氮源(通常以有機(jī)氮源的形式，例如酵母提取物，或例如硫酸銨等鹽類)、磷酸源(例如辨酸氫鉀)、微量元素(例如鐵鹽、錳鹽和鎂鹽)、以及適用情況下的維生素，生長溫度在0。C到100'C之間，優(yōu)選在10。C到60°C,更優(yōu)選在15。C到50°C，同時(shí)供以氧氣。培養(yǎng)液pH值可以維持在固定值，即在培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)pH值。pH值應(yīng)在2-9的范圍內(nèi)。然而，也可以在不調(diào)節(jié)pH值的條件下培養(yǎng)微生物。可以進(jìn)行分批發(fā)酵、半分批發(fā)酵或補(bǔ)料/連續(xù)培養(yǎng)?？梢栽诎l(fā)酵最初開始時(shí)引入營養(yǎng)素，或以半連續(xù)或連續(xù)方式進(jìn)行隨后加料。生物體可以在需氧或厭氧條件下生長。培養(yǎng)液pH值可以維持在固定值，即在培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)pH值。pH值范圍應(yīng)在2-9之間，優(yōu)選在4-8.5、4.5-8之間，更優(yōu)選在5-7.5、5.5-7之間。然而，也可以在不調(diào)節(jié)pH值的條件下培養(yǎng)微生物。根據(jù)本發(fā)明的方法最好在0。C到100。C之間的溫度進(jìn)行，優(yōu)選l(TC到65°C、15。C到55。C，更優(yōu)選20。C到50。C、25。C到45。C，尤其優(yōu)選30。C到40°C，同時(shí)供以氧氣。根據(jù)本發(fā)明，方法(體外)中的pH值最好保持在4-12之間，優(yōu)選在4-8.5、4.5-8之間，更優(yōu)選在5-7.5、5.5-7之間。然而，也可以在不調(diào)節(jié)pH值的條件下培養(yǎng)^t生物。已知的培養(yǎng)方法的概述可以在Chmiel教科書(Bioprozeptechnik1.Einfi3hrungindieBioverfahrenstechnik(GustavFischerVerlag,Stuttgart,1991))或Storhas教科書(BioreaktorenundperiphereEinrichtungen(ViewegVerlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994))中找到。所用的培養(yǎng)基必須以合適的方式滿足各自菌林的需要。多種微生物的培養(yǎng)基在美國細(xì)菌學(xué)會(WashingtonD.C，USA,1981)的"普通細(xì)菌學(xué)方法手冊"中描述?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明使用的這些培養(yǎng)基如上所述通常包括一種或多種碳源、氮源、無機(jī)鹽、維生素和/或微量元素。優(yōu)選的碳源是糖例如單糖、二糖或多糖。很好的碳源的實(shí)例是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、己酮糖、核酮糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纖維素。糖也可以以復(fù)合化合物形式加入到培養(yǎng)基中，例如糖蜜、或其他糖精制的副產(chǎn)品。加入多種碳源的混合物也是有利的。其他可能的碳源是油和脂肪例如豆油、葵花籽油、花生油和/或椰子脂肪，脂肪酸例如棕櫚酸、^J旨酸和/或亞油酸，乙醇和/或多元醇例如甘油、甲醇和/或乙醇，和/或有機(jī)酸例如乙酸和/或乳酸。氮源通常是有機(jī)或無機(jī)氮化合物或包括這些化合物的材料。氮源的實(shí)例包括液態(tài)或氣態(tài)形式的氨或銨鹽(例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨或硝酸銨)、硝酸鹽、尿素、氨基酸或復(fù)合氮源(例如玉米漿、大豆粉、酵母提取物、肉提取物和其他)。氮源可以單獨(dú)或作為混合物使用。可能存在于培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽化合物包括鈣、鎂、鈉、鈷、鉬、鉀、錳、鋅、銅和鐵的氯化鹽、磷酸鹽或硫酸鹽。磷酸、磷酸二氬鉀或磷酸氫二鉀或相應(yīng)的含鈉鹽也可以用作磷源?？梢栽谂囵B(yǎng)基中加入螯合劑從而保持溶液中的金屬離子。尤其合適的螯合劑包括二羥基酚(dihydroxyphenols)例如鄰苯二酚或原兒茶酸(protocatechuate),或有機(jī)酸例如檸檬酸。根據(jù)本發(fā)明使用的用于培養(yǎng)微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基通常也包含其他生長因子例如維生素，或生長促進(jìn)因子包括例如生物素、核黃素、硫胺素、葉酸、煙酸、泛酸和吡哆醇。生長因子和鹽通常從復(fù)合培養(yǎng)基成分衍生而來，例如酵母提取物、糖蜜、玉米漿等等。而且也可以向培養(yǎng)基中加入合適的前體。培養(yǎng)基化合物的精確組成很大程度上依賴于特定實(shí)驗(yàn)，并且針對各種特異情況進(jìn)行分別選擇。最佳培養(yǎng)基的信息可以從教科書"應(yīng)用微生物生理學(xué)，實(shí)踐入門"(P.M.Rhodes、P.F.Stanbury編輯，IRLPress(1997)第53-73頁，ISBN0199635773)中獲得。生長培養(yǎng)基也可以購自供應(yīng)商例如標(biāo)準(zhǔn)1(默克(Merck))或BHI(腦心浸液，DIFCO)等。所有培養(yǎng)基成分通過加熱(1.5巴和121°C，20分鐘)或過濾滅菌。各成分可以一起滅菌，或者在需要的情況分別滅菌。所有培養(yǎng)基成分可以在培養(yǎng)開始時(shí)就存在，或者任選地連續(xù)或分批加入。培養(yǎng)溫度通常在15。C到45。C之間，優(yōu)選在25。C到40。C之間，并且在實(shí)驗(yàn)過程中可以保持恒定或可變。培養(yǎng)基的pH值范圍應(yīng)該在5-8.5之間，優(yōu)選在7左右。在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基pH值可以通過加入堿性化合物來控制，例如加入氫氧化鈉、氬氧化鉀、氨或氨水，或加入酸性化合物，例如磷酸或硫酸。通過應(yīng)用消泡劑來控制泡沫形成，例如脂肪酸聚乙二醇酯。通過向培養(yǎng)基中加入合適具有選擇作用的物質(zhì)(例如抗生素)來維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。通過向培養(yǎng)物中引入氧或含氧氣體混合物(例如空氣)來維持好氧條件。培養(yǎng)溫度通常從20。C到45。C并且優(yōu)選從25。C到40°C。培養(yǎng)持續(xù)到形成所需產(chǎn)物達(dá)到最大量。該目標(biāo)通常在10小時(shí)到160小時(shí)以內(nèi)實(shí)現(xiàn)。可能使用包含根據(jù)本發(fā)明的核酸、核酸構(gòu)建體或載體的生長細(xì)胞用于根據(jù)本發(fā)明的方法。也可能使用靜止的或破裂的細(xì)胞。破裂的細(xì)胞指例如通過溶劑處理而有滲透性的細(xì)胞，或通過酶處理、化學(xué)處理(例如弗氏細(xì)胞壓碎器或超聲)或其他方法而破裂的細(xì)胞。此方法獲得的粗提物對于根據(jù)本發(fā)明的方法是有利的。該方法也可以使用純化或部分純化的酶。同樣，有利于在反應(yīng)中使用的固定化微生物或酶也是合適的。如果根據(jù)本發(fā)明的方法使用游離生物體或酶，那么可以在提取之前通過例如過濾或離心將它們方便地除去。最好不必需使用固定化生物體或酶，但是仍然可以發(fā)生。作為主要起始材料的亞油酸可以分批、半分批或連續(xù)加入到反應(yīng)混合物中。發(fā)酵過程的起始材料(優(yōu)選亞油酸)的濃度不高于3mg/ml，優(yōu)選不高于2mg/ml，更優(yōu)選不高于1mg/ml，尤其優(yōu)選不高于0.5mg/ml。在本發(fā)明特別尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于誘導(dǎo)反-10，順-12共軛亞油酸產(chǎn)生的亞油酸的濃度范圍為0.1-0.5mg/ml，優(yōu)選0.4-0.5mg/ml，更優(yōu)選0.3-0.4mg/ml，尤其優(yōu)選0.2-0.3mg/ml，最優(yōu)選0.1-0.2mg/ml。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，加入亞油酸的微生物培養(yǎng)物的光密度(OD6oo)至少為0.1、優(yōu)選至少0.2、更優(yōu)選至少0.3或0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39,尤其優(yōu)選至少0.4或0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49，特別尤其優(yōu)選至少0.5或0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.6。然而，亞油酸甚至可以加入到光密度(OD卯。)大于0.6的微生物培養(yǎng)物中。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，分離CLA之前，誘導(dǎo)培養(yǎng)物至少要培養(yǎng)12-18小時(shí)，優(yōu)選至少18-24小時(shí)，更優(yōu)選至少24-30小時(shí)，尤其優(yōu)選至少30-42小時(shí)，最優(yōu)選至少42-72小時(shí)。對于已建立的類型，根據(jù)本發(fā)明方法的產(chǎn)物(=共軛不飽和脂肪酸，尤其是CLA,優(yōu)選反-10，順-12共軛亞油酸)可以基于反應(yīng)中所用的亞油酸的量以產(chǎn)量的20-100%、優(yōu)選30-100%、尤其優(yōu)選50-100%、更尤其優(yōu)選60-100%、70-100%、80-100%、90-100%來分離。另外，產(chǎn)物具有高度的異構(gòu)純度，需要時(shí)有利于通過結(jié)晶進(jìn)一步增加異構(gòu)純度。本發(fā)明的方法的主要產(chǎn)物是反-10，順-12共軛亞油酸。可以通過技術(shù)人員熟悉的方法從生物體中分離脂肪酸產(chǎn)物。例如通過抽提、鹽沉淀和/或不同的層析方法。對于微生物發(fā)酵的情況，可以在培養(yǎng)基和/或細(xì)胞中積累上述脂肪酸。如果在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用微生物，那么可以在培養(yǎng)以后處理發(fā)酵液。按需要，通過分離方法(例如離心、過濾、傾析或這些方法的組合)從發(fā)酵液中移出全部或一些的生物體，或者將生物體留在發(fā)酵液中。隨后用已知方法將發(fā)酵液減少或濃縮，例如用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、薄層蒸發(fā)器、降膜式蒸發(fā)器、或通過反滲透或納米過濾。然后最好可以加入另外的組成化合物例如玉米淀粉或硅酸鹽。隨后濃縮的發(fā)酵液最好與組成化合物一起通過凍干、噴霧干燥、噴霧成?；蚱渌椒▉砑庸ぁ?yōu)選用已知方法從生物體中分離脂肪酸或脂肪酸組合物，例如從微生物或生物體生長的培養(yǎng)基中，或從生物體和培養(yǎng)基中，例如通過抽提、蒸餾、結(jié)晶、層析或這些方法組合的方法?？梢詥为?dú)使用或與上述方法(例如分離和/或濃縮方法)組合4吏用這些純化的方法?？梢詫a(chǎn)物的組合物用于進(jìn)行例如在硅膠板上薄層層析法或例如硅膠鎂載體(Florisil)柱層析(BouhoursJ.F"J.Chromatrogr.1979，169，462)，其中所希望的產(chǎn)物或混雜物在層析樹脂上保持完整或部分。如果需要，可以用同樣或不同的層析樹脂重復(fù)這些層析步驟。技術(shù)人員熟知合適的層析樹脂的選擇和它們最有效的用途。純化脂肪酸的可選擇方法是例如在尿素存在下結(jié)晶。這些方法可以彼此組合使用?？梢酝ㄟ^現(xiàn)有技術(shù)來確定分離的化合物的鑒定和純化。這些包括高效液相層析(HPLC)、分光光度法、質(zhì)傳法(MS)、染色法、薄層層析法、NIRS、酶測定或微生物測定。這些分析方法在Patek等人(1994)Appl.Environ.Microbiol.60:133-140;Malakhova等人(1996)Biotekhnologiya1127-32;和Schmidt等人(1998)BioprocessEngineer.19:67-70.工業(yè)化學(xué)Ulmann，s百科全書(1996)第A27巻，VCH:Weinheim，第89-90頁、521-540頁、540-547頁、559-566頁、575-581頁和581-587頁；Michal，G(1999)生物化學(xué)途徑生物化學(xué)和分子生物學(xué)圖片集，JohnWiley和Sons;Fallon,A.等人(1987)HPLC在生物化學(xué)中的應(yīng)用生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，17巻中和無述。本發(fā)明尤其優(yōu)選的實(shí)施方案涉及在轉(zhuǎn)基因微生物中根據(jù)上述步驟(a)到(e)生產(chǎn)共軛亞油酸的方法，其特征在于在操作或發(fā)酵過程中(分批或補(bǔ)料分批)亞油酸的生物轉(zhuǎn)化率(如在一般定義中所定義的)比乳酸桿菌屬的細(xì)菌高于10%、優(yōu)選高于20%、更優(yōu)選高于30%,比大腸桿菌屬的細(xì)菌高于10%、優(yōu)選高于20%、更優(yōu)選高于30%、尤其優(yōu)選高于40%,比乳J求菌屬的細(xì)菌高于10%、優(yōu)選高于20%、更優(yōu)選高于30%,尤其優(yōu)選高于40%、非常特別優(yōu)選高于50%。此外，本發(fā)明涉及生產(chǎn)富舍共軛亞油酸的飼料或食品產(chǎn)品或營養(yǎng)制品的方法，其中根據(jù)上述方法產(chǎn)生共軛亞油酸。本發(fā)明還涉及富含共軛亞油酸的伺料、食品產(chǎn)品和營養(yǎng)制品，其中根據(jù)上述方法產(chǎn)生共軛亞油酸。本發(fā)明的組合物具有多種營養(yǎng)的、治療的和藥理學(xué)的用途。這些用途包括減少動物體脂肪、增加動物肌肉量、增加動物飼養(yǎng)效率、減少人體重、減弱動物過敏性反應(yīng)、防止由于免疫刺激導(dǎo)致的動物體重減輕、增加動物骨的礦物含量、防止動物骨骼異常和降低動物血液中膽固醇含量。飼料或食品產(chǎn)品、優(yōu)選作為飼料或食品產(chǎn)品的添加劑使用的制品，除根據(jù)上述方法產(chǎn)生的共軛亞油酸、優(yōu)選發(fā)酵油或純化的共軛亞油酸異構(gòu)體混合物、更優(yōu)選純化的反-10，順-12共輒亞油酸以外，也可以包含其他組分。其他組分應(yīng)依據(jù)制品的用途來選擇，并且是技術(shù)人員一般公知的。本發(fā)明含義內(nèi)考慮的其他組分是例如如下物質(zhì)其他有機(jī)酸、類胡蘿卜素、微量元素、抗氧化劑、維生素、酶、氨基酸、礦物質(zhì)、乳化劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、消結(jié)塊劑和/或香味增強(qiáng)劑。所述物質(zhì)的典型實(shí)例在才艮據(jù)歐洲規(guī)則的食品添加劑的各自有效目錄中列出，例如當(dāng)前有效的EC導(dǎo)則95/2/EC。在下文中，列出對于產(chǎn)生本發(fā)明的制品合適的其他組分根據(jù)其不同的性質(zhì)和具有所選用途的功能，將這些組分以不同的量加入到制品中。定量混合比還有具有所選用途的功能的物質(zhì)的方便組合是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。有機(jī)酸優(yōu)選使用甲酸、丙酸、乳酸、乙酸和檸檬酸，尤其優(yōu)選甲酸、丙酸或乳酸。在本發(fā)明中，類胡蘿卜素指四薛類，其中一個(gè)或兩個(gè)芷香酮環(huán)與具有9個(gè)雙鍵的碳鏈結(jié)合，并且可以是植物或動物來源。類胡蘿卜素也指氧合葉黃素。它們的實(shí)例是a-、p-、，胡蘿卜素、ixin、降胭脂樹素、辣椒紅(capsanthin)、辣4僅玉紅素(capsorubin)、番茄紅素(lycopene)、卩-脫輔基國8-胡蘿卜素醛、胡蘿卜酸乙酯(carotinicacidethylester)和葉黃素、黃莨黃質(zhì)(flavoxanthin)、黃體素(lutein)、玉米黃質(zhì)(cryptoaxanthin)、玉紅黃質(zhì)(rubixanthin)、紫黃質(zhì)(violaxanthin)、紫杉紫素(rhodoxanthin)、還有角黃素(canthaxanthiii)。本發(fā)明的制品可以包含例如如下微量元素鉻、鐵、氟、碘、鈷、銅、錳、鉬、鎳、竭、釩、鋅或錫。下面列出的E編號是食品添加劑的導(dǎo)則95/2/EEC中指定的?？梢允褂玫目寡趸瘎┦抢缈箟难?維生素C，E300)、L-抗壞血酸鈉(E301)、L-抗壞血酸釣(E302)、抗壞血酸棕櫚酸酯(E304)、丁基化羥基苯甲醚(E320)、丁基羥基甲苯(E321)、EDTA二鈉鈣(E385)、沒食子酸酯(gallates)例如沒食子酸丙酯(E310)、沒食子酸辛酯(E311)、沒食子酸十二酯(沒食子酸月桂酯)(E312)、異抗壞血酸(E315)、異抗壞血酸鈉(E316)、卵砩脂(E322)、乳酸(E270)、多重磷酸鹽例如二砩酸鹽(E450)、三磷酸鹽(E451)、多磷酸鹽(E452)、二氧化硫(E220)、亞硫酸鈉(E221)、亞硫酸氫鈉(E222)、二硫化鈉(E223)、亞硫酸鉀(E224)、亞硫酸釣(E226)、亞硫酸氫鈣(E227)、亞石克酸氫鉀(E228)、硒、生育酚(維生素E，E306)、例如a-生育酚(E307)、，生育酚(E308)，S-生育酚(E309)和所有生育三烯酚類(tocotrienols)、氯^1錫(11)(E512)、檸檬酸(E330)、檸檬酸鈉(E331)、類胡蘿卜素、維生素A、還有檸檬酸鉀(E332)。可用的維生素不僅有脂溶性維生素，還有水溶性維生素。脂溶性維生素的實(shí)例是維生素A0見黃醇)、維生素D(麥角鈣化醇)、維生素E(生育酚和生育三烯酚類)、維生素K(葉綠醌和曱基萘醌)，優(yōu)選維生素A和E。水溶性維生素的實(shí)例是維生素B1(硫胺素)、維生素B2(核黃素)、維生素B5(泛酸)、維生素B6(吡哆醇)、維生素Bl2(鈷胺素)、維生素C(抗壞血酸)、維生素H(生物素)、葉酸和煙酸，優(yōu)選維生素B2和C。制品也可以包含酶。其實(shí)例是淀粉酶、蛋白酶和轉(zhuǎn)化酶。本發(fā)明中可用的氨基酸是例如谷氨酸、L-肉堿、L-谷氨酰胺、L-?；撬帷-天冬氨酸、L-甘氨酸、L-賴氨酸、DL-苯丙氨酸、L-色氨酸、酪氨酸、L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-瓜氨酸、L-纈氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-鳥氨酸或L-脯氨酸。尤其優(yōu)選必需氨基酸，例如L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、DL-苯丙氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸和L-纈氨酸，特別尤其優(yōu)選動物營養(yǎng)中重要的氨基酸L-賴氨酸、DL-甲硫氨酸或L-蘇氨酸。本發(fā)明中的礦物質(zhì)是例如鈉、鉀、鎂、鈣、磷、鐵和鋅。乳化劑可使用下列物質(zhì)，例如E420山梨糖醇、E420ii山梨糖醇糖漿、E421甘露糖醇、E422甘油、E431聚氧乙烯(40)硬脂酸鹽、E432聚氧乙烯山梨聚糖單月桂酯/聚山梨酸酯20、E433聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯/聚山梨酸酯80、E434聚氧乙烯山梨聚糖單棕櫚酸酯/聚山梨酸酯40、E435聚氧乙烯山梨聚糖單硬脂酸酯/聚山梨酸酯60、E436聚氧乙烯山梨聚糖三硬脂酸酯/聚山梨酸酯65、E440果膠、E440i果膠、E440ii酰胺化果膠、E442磷脂銨、E444蔗糖乙酸異丁酯、E445根爭>香甘油酯、E450二磷酸、E450i二磷酸二鈉、E450ii二磷酸三鈉、E450iii二磷酸四鈉、E450iv二磷酸二鉀、E450v二磷酸四鉀、E450vi二磷酸二鉤、E450vii二磷酸二氬鍋、E451三砩酸、E451i三磷酸五鈉、E451ii三磷酸五鉀、E452多磷酸、E452i多磷酸鈉、E452ii多磷酸鉀、E452iii多磷酸鈉4丐、E452iv多碼酸4丐、E460纖維素、E460i微晶纖維素、E460ii纖維素粉、E461曱基纖維素、E463羥丙基纖維素、E464羥丙基曱基纖維素、E465甲基乙基纖維素、E466羧甲基纖維素、E469酶水解的羧甲基纖維素、E470a脂肪酸的鈉鹽、鉀鹽和鉤鹽、E470b脂肪酸的鎂鹽、E471脂肪酸的單-或二甘油酯、E472a脂肪酸的單-或二甘油酯的乙酸酯、E472b脂肪酸的單-或二甘油酯的乳酸酯、E472c脂肪酸的單-或二甘油酯的檸檬酸酯、E472d脂肪酸的單-或二甘油酯的酒石酸酯、E472e脂肪酸的單-或二甘油酯的單-或二乙酰酒石酸酯、E472f脂肪酸的單-或二甘油酯的混和乙酸和酒石酸酯、E473蔗糖脂肪酸酯、E474蔗糖甘油酯、E475脂肪酸聚甘油酯、E476聚甘油聚蓖麻油酸酯、E477脂肪酸的丙二醇酯、E479與脂肪酸的單-或二甘油酯相互作用的熱氧化的大豆、E481硬脂酰-2-乳酸鈉、E482硬脂酰-2-乳酸鉤、E483硬脂酰酒石酸酯、E491山梨聚糖單硬脂酸酯、E492山梨聚糖三硬脂酸酯、E493山梨聚糖單月桂酸酯、E494山梨聚糖單油酸酯、E495山梨聚糖單棕櫚酸酯。穩(wěn)定劑是保持食品稠度或組成的物質(zhì)。其實(shí)例是抗壞血酸(E300)、尿素(E927b)、乳酸鐵(11)(E585)、葡萄糖酸亞鐵(E579)、甘油酯(E445)、卵磷脂(E322)、偏酒石酸(E353)、果膠(E440)、蔗糖乙酸異丁酯(E444)和氯化錫(ll)(E512)。防腐劑是通過防止微生物對食品的有害作用從而延長食品儲存期限的物質(zhì)。其實(shí)例是E200山梨酸、E201山梨酸鈉、E202山梨酸鉀、E203山梨酸鉤、E210苯曱酸、E211苯甲酸鈉、E212苯甲酸鉀、E213苯甲酸鉀、E214乙基對羥基苯甲^/PHB酯、E215乙基對羥基苯曱酸鈉/PHB乙酯鈉鹽、E216丙基對羥基苯曱^/PHB丙酯、E217丙基對羥基苯甲酸鈉/PHB-丙酯鈉鹽、E218甲基對羥基苯曱^/PHB-曱酯、E219曱基對羥基苯甲酸鈉/PHB-甲酯鈉鹽、E220二氧化硫、E221亞硫酸鈉、E222確<氫化鈉(sodiumhydrogensulfite)/亞石克酸氫鈉(sodiumbisulfite)、E223偏亞硫酸氫鈉/二硫化鈉(sodiumdisulfite)、E224偏亞硫酸氬鉀/亞石克酸鉀、E226亞硫酸釣、E227硫氫化釣(calciumhydrogensulfite)、E228硫氬化鉀(potassiumhydrogensulfite)/亞硫酸氫鉀、E230聯(lián)苯/二苯、E231鄰苯基酚(orthophenylphenol)、E232鄰苯酚鈉、E233噻唑苯并咪唑、E234乳鏈菌肽、E235游霉素、E239六亞甲基四胺、E242二甲基碳酸氫鈉、E249亞硝酸鉀、E250亞硝酸鈉、E251硝酸鈉和E252硝酸鉀。本發(fā)明中的消結(jié)塊劑是能夠通過防止顆粒聚集和粘附在一起從而增加食品流動性的天然存在或合成的物質(zhì)。其實(shí)例是E530氧化鎂、E535亞纟失氰化鈉、E536亞4失氰化鉀、E541酸性磷酸鋁鈉(acidicsodiumaluminumphosphate)、E551二氧化硅、E552珪酸鉤、E553ai硅酸鎂、E553aii三硅酸鎂(無石棉)、E553b滑石(無石棉)、E554硅酸鋁鈉和E556硅酸鋁鈣。本發(fā)明中的香味增強(qiáng)劑指能夠?qū)崿F(xiàn)或增強(qiáng)食品香味的天然存在或合成的物質(zhì)。也包括調(diào)味料。其實(shí)例是E620谷氨酸、E621谷氨酸單鈉、E622谷氨酸單鉀、E623二谷氨酸釣、E624谷氨酸單銨、E625二谷氨酸鎂、E626鳥苷酸、E627鳥苷酸二鈉、E628鳥苷酸二鉀、E629鳥苷酸鈣、E630肌苷酸、E631肌苷酸二鈉、E632肌苷酸二鉀、E633肌苷酸二鈣、E6345-核糖核苷酸鉀、E6355-核糖核苷酸二鈉、E640甘氨酸和E650乙在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所用的制品可以包含助劑。根據(jù)本發(fā)明，助劑指可用于改良產(chǎn)品性質(zhì)(例如粉末行為、流動性質(zhì)、吸水能力和儲存穩(wěn)定性)的物質(zhì)。助劑可以基于糖例如乳糖或麥芽糖糊精，基于谷類或豆類產(chǎn)品例如玉米芯、麩皮和大豆粉，基于礦物鹽尤其是鉤、鎂、鈉或鉀鹽，以及D-泛酸或其鹽類(化學(xué)的或發(fā)酵產(chǎn)生的D-泛酸鹽)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所用的制品可以包含載體。合適的載體是"惰性"載體材料，即不與本發(fā)明制品中所用的成分產(chǎn)生不利相互作用的材料。很明顯，載體材料在各自所用的例如食品和動物飼料中必需是安全的。合適的載體材料不僅有無機(jī)載體，還有有機(jī)載體。合適載體材料的實(shí)例是低分子量無機(jī)或有機(jī)化合物和相對高分子量的天然或合成來源的有機(jī)化合物。合適的低分子量無機(jī)載體的實(shí)例是鹽，例如氯化鈉、碳酸4丐、硫酸鈉和硫酸鎂、硅藻土或硅酸、或硅酸衍生物例如二氧化硅、硅酸鹽或硅膠。合適的有機(jī)載體的實(shí)例尤其是糖，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、以及糊精和淀粉產(chǎn)品。相對高分子量的有機(jī)載體的實(shí)例是淀粉和纖維素制品，例如尤其是玉米淀粉、玉米芯、地稻外殼、麥麩粗面粉或谷類面粉，例如小麥、黑麥、大麥和燕麥面粉或麥l夫和其混合物。本發(fā)明所用的制品可以包含混合的其他組分、載體和助劑。制品中共軛亞油酸的重量分?jǐn)?shù)可以在很廣的泛圍內(nèi)變化，通常根據(jù)所選擇的應(yīng)用領(lǐng)域(例如農(nóng)業(yè)畜牧業(yè)、培育家畜或人營養(yǎng))的實(shí)踐考慮來確定。在最簡單的情況下，通過混合組分來生產(chǎn)制品。同樣可以通過混合各單獨(dú)組分的溶液來生產(chǎn)制品，合適情況下隨后除去溶劑。多種組分的混合物可以以相對于彼此的任意重量比例存在?；旌衔锏淖詈唵涡问绞菍⒏鹘M分集中在混合器中。此類混合器是本領(lǐng)域技術(shù)人員所7>知的，例如來自Ruberg公司(垂直雙柄混合器(HM(10-50000I)型)、環(huán)層混合器-pelletizer(RMG型)、連續(xù)凝集干燥機(jī)(HMTK型)、垂直單柄混合器(VM(10-50000I)型)、容器混合器(COM(50-4000I)型)。更多的混合器也可以獲自Lodige，Drais，Engelsmann?？梢苑峙蜻B續(xù)操作混合器。在分批混合器中，通常要混合的所有組分以預(yù)期的比例帶電荷，然后混合足夠的時(shí)間，時(shí)間范圍從幾分鐘到幾小時(shí)?；旌蠒r(shí)間和混合應(yīng)力是特異的，從而使組分在混合物中呈現(xiàn)同質(zhì)的分散。在連續(xù)混合的情況下，連續(xù)加入組分，合適情況在預(yù)混合以后加入。在連續(xù)混合器中，也選擇一定的保留時(shí)間和混合應(yīng)力，從而使組分在混合物中呈現(xiàn)同質(zhì)的*。在連續(xù)的情況下與分批混合的情況相比混合時(shí)間通常較短而混合應(yīng)力更高。混合通常在室溫下進(jìn)行，但是取決于所用物質(zhì)也可以在更高或更低的溫度下進(jìn)行。在優(yōu)選實(shí)施方案中，制品以固體形式存在。依賴于應(yīng)用的需要，制品可以是平均顆粒大小從10jim到5000nm、優(yōu)選平均顆粒大小從20nm到1000jim的粉末。可以用MalvernInstrumentsGmbH，MastersizerS儀器來研究得到的粉末產(chǎn)品的顆粒大小分布。組分的混合物可能是純化的摻和物，即物質(zhì)以所需的顆粒大小和濃度比混合在一起，合適情況下添加更多的添加劑，如果需要還可以通過包被來保護(hù)這些物質(zhì)。此外，可以使用芯鞘結(jié)構(gòu)，即一種組分位于內(nèi)部作為芯而另一組分位于外部作為鞘，或相反。當(dāng)然，對于這些結(jié)構(gòu)，如果需要也可以使用進(jìn)一步的包被。也可以用共用的載體材料基質(zhì)或保護(hù)性膠體將物質(zhì)一起包入膠嚢。這些的實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，并且例如在RAMorten:Fat-SolubleVitamins,PergamonPress,1970，第131到145中描述?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的結(jié)晶、沉淀、干燥、造?；蚓奂姆椒ā⒒蚱渌F(xiàn)代教科書中描述的固體形成方法生產(chǎn)粉末。摻入到醫(yī)療食品中的CLA的精確量由食品的預(yù)期用途、CLA的使用形式和施用途徑?jīng)Q定。也可以由異構(gòu)體比例決定。然而，醫(yī)療食品可以含有重量等同于食品重量的約0.05-1%、或約0.1-0.9%、或約0.2-0.8%、或約0.3-0.7%、或約0.4-0.6%的CLA。在另外實(shí)施方案中，食品包含重量等同于食品重量的約1-10%、或約2-8%、或約3-7%、或約4-6%的CLA。CLA含量也可以表示為基于提供的總熱量的CLA量，例如每100卡路里0.03-3克CLA?；蛘?，CLA量也可以表示為食物中脂類或脂肪的百分比，例如食物脂類的0.3-100%。另外合適的含共軛亞油酸的飼料和/或食品在美國專利6.042.869(實(shí)施例2到9)和US5,760,082(實(shí)施例2到5)中描述。所述專利的內(nèi)容在此引用作為參考。其它專利也描述了多種CLA制品。歐洲專利申請EP779033Al在此處引用作為參考，其公開了含有0.05-20%(按重量計(jì))CLA殘余的食用脂肪涂布。其中，商業(yè)上可獲得的游離脂肪酸混合物含有95.3%的亞油酸含量，將該混合物用NaOH在乙二醇中進(jìn)行堿性異構(gòu)化。通過混合10份棕櫚油和脂肪酶將游離脂肪酸摻入到甘油三酯中?；旌衔镌?5'C攪拌48小時(shí)，除去脂肪酶和游離脂肪酸。將70份該組合物和29份水、0.5份乳清蛋白粉末、0.1份鹽和少量香料和檸檬酸(以獲得pH4.5)混合并加工產(chǎn)生脂肪涂布。其它包含安全有效量的CLA的醫(yī)療食品在PCT出版物WO97/46118(Cook等人)中公開，其在此處引用作為參考。其中，公開了用于人腸胃外給藥的包含直徑約0.33-0.5微米脂肪顆粒的液體醫(yī)療食品。乳劑包含0.5-10mg/gm的CLA、或可選擇的基于食品液體0.3-100%的CLA或每100卡路里0.03-0.3gm的CLA。該申請也公開了含相似CLA量及2.66gm蛋白質(zhì)、5.46gm脂肪、10.1gm碳水化合物、133gm水和RDA量(每日推薦量)的維生素和礦物質(zhì)的嬰兒制劑。公開了作為高蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)補(bǔ)充劑的低殘余液體腸內(nèi)醫(yī)療食品的另一個(gè)實(shí)例。該補(bǔ)充劑包含產(chǎn)品重量的約0.05-5%的CLA、或液體的約0.3-100%的CLA或每100卡路里約0.03-0.3gm的CLA。另夕卜，140卡路里的典型制劑可以包含7.5gm蛋清固體、O.lgmCLA、27.3gm碳水化合物(例如蔗糖或水解的玉米淀粉)、1.9gm水和RDA量的樣吏生物和礦物質(zhì)。另外，本發(fā)明涉及表達(dá)上述編碼反-10，順-12共軛亞油酸異構(gòu)酶的核酸分子的轉(zhuǎn)基因微生物，該核酸分子特征在于(i)具有SEQIDNo.l所述序列的核酸分子，或(ii)來自由(i)所述的核酸分子編碼的多肽的功能性等同物，例如e.具有SEQIDNo.l所述序列的至少50個(gè)、優(yōu)選至少75個(gè)、更優(yōu)選至少100個(gè)、尤其優(yōu)選至少125個(gè)、特別尤其優(yōu)選至少150個(gè)連續(xù)堿基對的核酸分子，或f.與SEQIDNo.l所述序列的至少IOO個(gè)、優(yōu)選至少125個(gè)、更優(yōu)選至少150個(gè)、尤其優(yōu)選至少175個(gè)、特別尤其優(yōu)選至少200個(gè)連續(xù)核酸堿基對的序列具有至少80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、尤其優(yōu)選至少95%、特別尤其優(yōu)選至少98%同一性的核酸分子，或g.在嚴(yán)格條件下與SEQIDNo.l所述序列的至少50個(gè)、優(yōu)選至少100個(gè)、更優(yōu)選至少150個(gè)、尤其優(yōu)選至少200個(gè)、特別尤其優(yōu)選至少500個(gè)連續(xù)堿基對的核酸片段雜交的核酸分子，或h.編碼與SEQIDNo.2所示氨基酸序列具有至少75%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、尤其優(yōu)選至少95%、特別尤其優(yōu)選至少98%同一性的多肽的核酸分子。其中所述核酸序列優(yōu)選從瘤胃細(xì)菌中分離、更優(yōu)選從埃氏巨球型苗、最優(yōu)選從埃氏巨球型菌YJ-4中分離，或從丙酸桿菌屬、優(yōu)選痤瘡丙酸桿菌中分離，其中所述核酸分子功能性連接至少一個(gè)異源啟動子序列。在另外的優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明轉(zhuǎn)基因微生物用作食品和飼料中益生菌的用途，優(yōu)選微生物選自上述乳球菌屬、乳酸桿菌屬、丙酸桿菌屬、大腸桿菌屬和雙歧桿菌屬，更優(yōu)選微生物選自短雙歧桿菌、齒雙歧桿菌和假鏈狀雙歧桿菌。另外，本發(fā)明涉及在轉(zhuǎn)基因微生物中根據(jù)上述本發(fā)明方法產(chǎn)生的發(fā)酵油。在優(yōu)選實(shí)施方案中，發(fā)酵油從發(fā)酵液中分離，并主要由反-10，順-12共輒亞油酸和9,12-共輒亞油酸組成，并且富含至少20%、30%、40%，優(yōu)選至少50%、55%、60%,更優(yōu)選至少65%、70%、75%，尤其優(yōu)選至少80%、85%、90%,特別尤其優(yōu)選至少91%、92%、93%、94%、95%的反-10，順-12共輒亞油酸。為了純化脂肪酸部分(優(yōu)選CLA部分)，可以進(jìn)一步加工所述發(fā)酵油(見實(shí)施例)。1.通過施用約0.1-1%濃度的CLA來維持白細(xì)胞數(shù)目從而減弱動物中由1型或TgE超敏介導(dǎo)的過敏反應(yīng)，如美國專利號3,585,400(Cook等人)中所述，其在此處引用作為參考。該專利公開了用0.25%CLA或?qū)φ诊嬍澄桂B(yǎng)豚鼠兩周，然后在兩周時(shí)用卵清蛋白免疫和在三周時(shí)高度免疫。用表面灌流模式系統(tǒng)來確定喂養(yǎng)CLA是否對過敏誘導(dǎo)的氣管收縮有影響。在表面灌流系統(tǒng)中，以CLA喂養(yǎng)的豚鼠的氣管比對照喂養(yǎng)的豚鼠的氣管更穩(wěn)定。當(dāng)過敏原注入到豚鼠氣管中時(shí)，在CLA喂養(yǎng)的動物組織中觀察到較少的氣管收縮。CLA喂養(yǎng)的動物的白細(xì)胞量與對照動物相比有所增高，CLA喂養(yǎng)的動物白細(xì)胞量為3.5x106+/-0.6，而對照動物為2.4x106+/-0.3。2.減少動物體脂肪。在此引用美國專利號5,554,646(Cook等人)作為參考，其公開了CLA用于減少動物體脂肪的用途。在該方法中，使用足夠引起體脂肪減少的安全有效的CLA量來喂養(yǎng)動物。用含有0.5%CLA的飲食喂養(yǎng)小鼠，在喂養(yǎng)結(jié)束時(shí)總脂肪含量顯著低于喂以含0.5。/。玉米油的對照小鼠。為減少體脂肪施用的精確的CLA量依賴于動物、CLA的應(yīng)用形式和施用途徑。CLA量的范圍通常為約0.001-1g/kg動物體重。3.增加動物體重增長和喂養(yǎng)效率。在美國專利號5,428,072(Cook等人)中公開CLA的此類營養(yǎng)用途。其中，向動物喂養(yǎng)安全有效量的CLA能夠增強(qiáng)動物體重增長和喂養(yǎng)效率。向小雞喂以含0.5。/。CLA的飲食補(bǔ)充劑證明了盡管喂養(yǎng)CLA的雞消耗較少的食品，但是其與喂以0.5%亞油酸的對照雞的體重相等。4.防止由免疫刺激引起的食欲缺乏和體重減輕。在此處引用美國專利號5，430，066(Cook等人)作為參考，其公開了使用CLA來促進(jìn)生長和防止由免疫刺激(例如暴露于內(nèi)毒素)引起的食欲缺乏和體重減輕以及分解代謝的激素(例如IL-1)的不利作用。以含0.5%CLA的飲食喂養(yǎng)小雞，隨后注射內(nèi)毒素進(jìn)行激發(fā)，小雞的體重增加，而用對照飲食喂養(yǎng)的小雞在暴露于內(nèi)毒素之后并沒有增加體重。用含0.5%CLA的飲食喂養(yǎng)的兔子與用含0.5%玉米油的對照飲食喂養(yǎng)的兔子相比較也得到同樣的結(jié)果。公開的制品和劑量范圍與美國專利號5,554,646中公開的一致。5.保持或提高動物中CD-4和CD-8細(xì)胞的水平。在此引用美國專利號5,674，卯2(Cook等人)作為參考，其中公開了保持或提高動物中CD-4和CD-8細(xì)胞的水平的方法，和防止或減輕由腫瘤壞死因子(TNF)的產(chǎn)生或外源施用引起的或由病毒引起的不利作用的方法，其包含向動物施用安全有效量的CLA。用對照飲食或含0.5%CLA的飲食喂養(yǎng)小鼠，隨后注射TNF進(jìn)行激發(fā)。喂以CLA的小鼠與對照小鼠相比體重減少較小。同樣，用含0.5。/。CLA的飲食喂養(yǎng)小雞，隨后翼網(wǎng)注射減毒活雞痘病毒進(jìn)行激發(fā)，會使小雞與喂以對照飲食的小雞相比增加更多的重量。喂以0.5。/。CLA飲食的小雞與喂以對照飲食的小雞相比CD-4和CD-8細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)明顯增加。6.改良動物的血脂鐠。在此處引用歐洲專利申請779,033Al(Lievense等人)作為參考，其公開了CLA用于改良血脂譜的用途。簡言之，用含CLA的飲食喂養(yǎng)倉鼠，其中以飲食總熱量的1.5%的比例摻入脂肪涂布形式的甘油三酯。喂以CLA的倉鼠的總膽固醇增加、HDL膽固醇降低和LDL膽固醇降低。7.生產(chǎn)治療癌癥的醫(yī)藥或治療試劑。本發(fā)明的發(fā)明者檢測了由乳酸乳桿菌和大腸桿菌產(chǎn)生的發(fā)酵油對人SW480癌細(xì)胞的抗增殖作用，結(jié)果清楚地證明tl0，cl2異構(gòu)體對癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用。tl0，cl2CLA抑制細(xì)胞生長的作用是劑量依賴的，最高細(xì)胞毒作用在濃度20照/ml。乳酸乳桿菌tl0，cl2CLA殺死多數(shù)癌細(xì)胞，當(dāng)用最高濃度(20ng/ml)處理時(shí)剩余少于8%的活細(xì)胞，與之對照的是乙醇對照(=100%)和用大腸桿菌產(chǎn)生的發(fā)酵tl0，cl2CLA培育會減少到約20%。先前報(bào)道CLA異構(gòu)體減少SW480細(xì)胞活力和刺激細(xì)胞凋亡。在Miller等人(2002)的研究中，tl0,cl2CLA異構(gòu)體是最有效的異構(gòu)體，其可以減少細(xì)胞活力到47-61%，而c9，tllCLA減少到40-52%。CLA也可以抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞系的生長(Schultz等人，1992;O'Shea等人，1999)。當(dāng)用20fig/mltl0，cl2CLA異構(gòu)體處理MCF-7細(xì)胞8天時(shí)，細(xì)胞數(shù)減少15%，而用相等量的c9，tl1CLA異構(gòu)體在相同條件下引起細(xì)胞活力下降60。/。(O'Shea等人，1999)。在另一個(gè)研究中，用16jig/mltl0，cl2CLA異構(gòu)體培育4天使SW480和MCF-7細(xì)胞系的活力均減少50-60%(Miller等人，2001)。相反，同樣量的亞油酸使SW480細(xì)胞的活性增加23%。未發(fā)酵的對照亞油酸和純化亞油酸(希格瑪)對細(xì)胞活力僅有很小的影響。醫(yī)藥和治療劑指那些不僅用于預(yù)防而且用于治療動物(優(yōu)選人)的過敏反應(yīng)、體脂肪增加、由于免疫刺激引起的食欲缺乏和體重減輕、血脂譜和癌癥的試劑。在例如過敏反應(yīng)、體脂肪增加、由于免疫刺激引起的食欲缺乏和體重減輕、血脂語和癌癥的治療中，制品可以按本領(lǐng)域技術(shù)人員通常公知的方法配制，是適合并可以用常規(guī)技術(shù)進(jìn)行藥劑形式的生產(chǎn)。此類技術(shù)例如在"Remingtons藥學(xué)科學(xué)手冊"，MackPublishingCo"NewYork,USA，第17版，1985中描述。此類藥劑形式或食品添加劑可以是液體、粉末、預(yù)混合劑、片劑、膠嚢或混懸液。藥量一般為人々大食中約1000ppm(百萬分之一)到約10000ppm范圍的CLA。然而，因?yàn)镃LA無毒，所以使用的量的上限并不嚴(yán)格。也可以以多種形式制備用于此類或其他用途的CLA。這些包括無毒的CLA鈉或鉀鹽與藥用稀釋劑和活化的酯類組合。CLA也可以直接摻入到動物飼料或人食品中，使CLA構(gòu)成動物或人食品重量的約0.01-2%或更多。序列1.SEQIDNo.1從痤瘡丙酸桿菌中分離的反-10，順-12共軛亞油酸異構(gòu)酶的核酸序列(登錄號CQ766028)2.SEQIDNo.2從痤瘡丙酸桿菌中分離的反-10，順-12共軛亞油酸異構(gòu)酶的氨基酸序列(登錄號CQ766028)3.SEQIDNo.3PCR-引物ERcoPAIl的核酸序列5'-aaaactgcagaggaggaaaaaaaATGGGTTCCATTTCCAAGGA畫3'4.SEQIDNo.4ERcoPAI2的核,列5'-CGGGGTACCTCACACGAAGAACCGCGTCA-3'5.SEQIDNo.5載體pNZ44-coPAI的核酸序列實(shí)施例為證明和進(jìn)一步說明特定優(yōu)選實(shí)施方案和本發(fā)明的方面，提供如下實(shí)施例，其并不限制本發(fā)明的范圍。在下述實(shí)驗(yàn)性公開(和本發(fā)明的上述說明書)中，如下縮寫為M(摩爾濃度)；mM(毫摩爾濃度)；(微摩爾濃度)；nM(納摩爾濃度)；mol(摩爾量)；mmol(毫摩爾量)；pmol(微摩爾量)；nmol(納摩爾量)；gm(克);mg(毫克)；jig(微克)；pg(皮克)；L(升);ml(毫升)；jil(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；Jim(微米)；nm(納米);。C(攝氏度)；MQ(milli-Q水；進(jìn)一步除去揮發(fā)物的去離子水，提供具有18.2歐姆電阻的純化水)；PSI(磅/平方英寸)；cDNA(DNA拷貝或互補(bǔ)DNA);DNA(脫氧核糖核酸)；ssDNA(單鏈DNA);dsDNA(雙鏈DNA);dNTP(三磷酸脫氧核糖核苷酸)；RNA(核糖核酸)；PBS(磷酸鹽緩沖液)；OD(光密度)；HEPES(N-2-羥乙基]哌溱-N-[2-乙磺酸)；HBS(HEPES緩沖液)；SDS(十二烷基硫酸鈉);Tris-HCI(三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)；DMSO(二甲基亞砜)；EGTA(乙二醇_二((3-氨乙基醚)N，N，N，，N'-四乙酸)；EDTA(乙二胺四乙酸)實(shí)施例1:培養(yǎng)物和培養(yǎng)基。乳酸乳球菌NZ9800(由于缺失nisA基因而不產(chǎn)生乳鏈菌肽的乳酸乳桿菌NZ9700衍生物，包含整合在染色體中的nisRK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因)在M17(Difco實(shí)驗(yàn)室，DetroitMichigan,USA)液體培養(yǎng)基和/或含葡萄糖(0.5%w/v)的瓊脂中于30。C培養(yǎng)。預(yù)先從人胃腸道(GIT)分離益生菌菌林副千酪乳桿菌副干酪亞種NFBC338(Lactobacillusparacaseissp.ParacasdNFBC338)(副干酪乳桿菌NFBC338),按照限制性材料轉(zhuǎn)移合約從愛爾蘭Cork綜合大學(xué)獲得。副干酪乳桿菌NFBC338常規(guī)在MRS液體培養(yǎng)基(OxoidLtd.,Hampshire,UK)中過夜(約17小時(shí))培養(yǎng)，在缺氧條件下用含厭氧培養(yǎng)氣體包(默克，Darmstedt，德國)的厭氧培養(yǎng)罐在37。C培養(yǎng)。在篩選標(biāo)記氯霉素(5照/ml)的存在下常規(guī)培養(yǎng)攜帶質(zhì)粒pNZ44的乳酸乳桿菌。以紅霉素(IOng/ml)作為篩選標(biāo)記來常規(guī)培養(yǎng)含有載體pMSP3535的副干酪乳桿菌NFBC。在補(bǔ)充氯霉素(20ng/ml)的LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有質(zhì)粒pNZ44的大腸桿菌TOP10(英杰公司(Invitrogen))。人結(jié)腸癌細(xì)胞獲自美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物收集所(ATCC，馬納薩斯，VA，USA)。tlO，cl2CLA異構(gòu)體(純度98%+)獲自Matreya(MatreyaInc"PA，USA;)。除另外說明，細(xì)胞培養(yǎng)基和補(bǔ)充物購自希格瑪Aldrich愛爾蘭Ltd.(都柏林，愛爾蘭)。SW480細(xì)胞維持在補(bǔ)充5%(v/v)胎牛血清、0.2mML-谷氨酰胺、1mMHEPES和1單位/ml青霉素和鏈霉素的Dulbecco，s極限必需培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)。SW480細(xì)胞在96孔板中生長，并且維持在37"C在pH7.2-7.4、需要95%空氣和5%C02流量的潮濕空氣中。實(shí)施例2:DNA操作。設(shè)計(jì)兩個(gè)寡核苷酸引物來擴(kuò)增完整的亞油酸異構(gòu)酶(coPAI)，從原始構(gòu)建體pC".l-coPAI(在植物載體中的亞油酸異構(gòu)酶基因；BASF,德國)產(chǎn)生tl0，cl2CLA。正向引物ERcoPAIl(SEQIDNo.3)包含Pstl限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)，在5，端有4個(gè)額外的堿基，在RBS和基因起點(diǎn)之間有7個(gè)額外堿基；5'-aaaactgcagaggaggaaaaaaaATGGGTTCCATTTCCAAGGA國3'(SEQIDNo.3)。反向引物ERcoPAI2(SEQIDNo.4)包含Kpnl限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和5，端3個(gè)額外堿基；5，-CGGGGTACCTCACACGAAGAACCGCGTCA-3'(SEQIDNo.:4)。使用200ng質(zhì)粒DNA(pC33.1-coPAI)作為模版，在EppendorfMastercyclerGradient(Eppendorf)中以高保真延伸按供應(yīng)商所述(羅氏診斷有限公司(RocheDiagnosticsLimited),EastSussex,英格蘭)擴(kuò)增1278bp的coPAI基因。PCR反應(yīng)在總體積50jd體系中進(jìn)行，包含lnl的各引物、3mMMgCl2、5nll0x延伸緩沖液、1jildNTP's和0.75fil延伸DNA。PCR條件如下2分鐘、15秒變性(94。C)、30秒退火(55。C)、2分鐘延伸(72。C)，IO個(gè)循環(huán)，隨后15秒(94。C)、30秒(55。C)、2分鐘+5秒/循環(huán)(72。C)20個(gè)循環(huán)和最終一次7分鐘72。C循環(huán)。PCR反應(yīng)混合物在1。/。(w/v)瓊脂糖凝膠上分析，可見得到的PCR片段。使用Qiagen質(zhì)粒小量提取試劑盒(Qiagen，WestSussex,UK)從大腸桿菌TOP10、乳酸乳桿菌NZ9800和副干酪乳桿菌NFBC338中分離質(zhì)粒DNA，對于乳酸乳桿菌和副干酪乳桿菌作微小修飾，即在Pl緩沖液中加入40mg/ml溶菌酶并在37。C培育20分鐘(乳酸乳桿菌)和2小時(shí)(副干酪乳桿菌)。PCR產(chǎn)物用QiaquickPCR純化試劑盒(Qiagen)純化。兩個(gè)質(zhì)粒pNZ8048(含PnisA啟動子的乳鏈菌肽可誘導(dǎo)的質(zhì)粒)和pNZ44(pNZ8048衍生物，其中PnisA啟動子被P44取代，P44是組成型乳酸乳桿菌染色體啟動子)和用限制性內(nèi)切酶Pstl和Kpnl消化coPAI基因片段，隨后在15。C用T4DNA連接酶按供應(yīng)商說明(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，MAUSA(NEB))進(jìn)行連接反應(yīng)。構(gòu)建體在圖1中顯示。用同樣的酶對重組質(zhì)粒進(jìn)行兩次消化，從而驗(yàn)證正確的克隆，然后通過電穿孔轉(zhuǎn)入乳酸乳桿菌NZ9800。在確i^人序列正確之后，用Pstl和Xbal限制性內(nèi)切酶(圖1)將基因從pNZ8048-coPAI切出，并連接到乳酸桿菌乳鏈菌肽可誘導(dǎo)的載體pMSP3535的相同位點(diǎn)。制備乳酸乳桿菌電感受態(tài)細(xì)胞，并根據(jù)Ruyter等人所述方法轉(zhuǎn)化，而用3.5xSMEB(1M蔗糖，3.5mMMgCl2)按Luchansky等人所述制備副千酪乳桿菌NFBC338電感受態(tài)細(xì)胞。用DNAStar軟件(DNAStar，Madison,Wisconsin,USA)進(jìn)行序列分析。實(shí)施例3:CLA產(chǎn)品的篩選。標(biāo)準(zhǔn)順-9，反-11和反-10，順-12CLA購自Matreya(MatreyaInc.,PA，USA)，亞油酸購自希格瑪(希格瑪化學(xué)(sigmachemical),MO，USA)。測試乳酸乳桿菌、副干酪乳桿菌和大腸桿菌克隆將游離亞油酸(0.1-0.5mg/ml)轉(zhuǎn)化為反-10，順-12CLA的能力如下；將過夜培養(yǎng)物的1%接種物轉(zhuǎn)移到10ml液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到OD6()。nm約為0.5。然后加入亞油酸(0.1-0.5mg/ml)，并用30-50ng/ml乳鏈菌肽(從含2.5%(w/v)乳鏈菌肽的固體乳中制備，希格瑪，N-5764)誘導(dǎo)培養(yǎng)物，再繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。使進(jìn)行時(shí)間實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)物在更大體積的液體培養(yǎng)基中生長，每隔12小時(shí)取IOml樣品。培養(yǎng)48-72小時(shí)以后，將培養(yǎng)物離心，從上清中提取脂肪酸，在氮?dú)庀赂稍锝又M(jìn)行甲基化，并用氣液層析(GLC)分析(Coakley等人，2003)。以百培養(yǎng)物培養(yǎng)后從培養(yǎng)基中回收和提取的亞油酸的量有關(guān)，其代表100%的可利用的亞油酸。實(shí)施例4:發(fā)酵油的制備。將大腸桿菌pNZ44-coPAI和乳酸乳桿菌pNZ44-coPAI克隆(1%過夜培養(yǎng)物)接種于500ml各自培養(yǎng)基中并生長到OD6W)=0.5，然后加入亞油酸(0.5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。由含亞油酸(0.5mg/ml)的未接種培養(yǎng)基組成的亞油酸對照也在37。C培養(yǎng)72小時(shí)，然后提取脂肪酸。從各發(fā)酵中制備三個(gè)對照樣品，未發(fā)酵的亞油酸對照也進(jìn)行甲基化并如(Coakley等人，2003)所述在GLC分析，從而計(jì)算樣品中CLA/亞油酸的比值。實(shí)施例5:發(fā)酵油對人SW480結(jié)腸癌細(xì)胞的抗增殖活性。為了檢測培養(yǎng)物(乳酸乳桿菌pNZ44-coPAI和大腸桿菌pNZ44-coPAI)在含亞油酸(0.5mg/ml)的各自培養(yǎng)基中發(fā)酵后提取的油的抗增殖活性，將人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480在不同濃度的發(fā)酵油中培養(yǎng)。開始在孔中接種1x104細(xì)胞，并在37。C培養(yǎng)24小時(shí)從而使細(xì)胞粘附到預(yù)先用每毫升培養(yǎng)基5-20Hgtl0，cl2CLA(來自發(fā)酵油和乙醇中的標(biāo)準(zhǔn)tl0，cl2CLA)和5-25ng亞油酸(對照未發(fā)酵油和希格瑪標(biāo)準(zhǔn))處理的表面上。來自乳酸乳桿菌和大腸桿菌的發(fā)酵油包含1.35:1比例的亞油酸和tlO，cl2CLA。對照瓶用乙醇補(bǔ)充到終濃度為0.1%(v/v)。培養(yǎng)5天以后，測量細(xì)胞活力，并用MTS方法(PromegaCorporation,Madison,Wl，USA)確定相對細(xì)胞數(shù)，該方法是在用MTS四氮唑化合物處理以后的增殖或細(xì)胞毒性測定中測定有活力細(xì)胞數(shù)的比色法。用MTS處理2小時(shí)，用96孔板讀數(shù)器在492nm紀(jì)錄吸光度。處理后的細(xì)胞活力(。/。)以相對于乙醇對照(代表100%)來表示。對各個(gè)處理進(jìn)行一式三份的三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，而cl2CLA標(biāo)準(zhǔn)(Matreya)除外，進(jìn)行一式三份的兩次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，并且用Student'st檢驗(yàn)確定各處理之間的顯著性差異(p〈0.001)。實(shí)施例6:序列分析。來自痤瘡丙酸桿菌的1278bp基因(登錄號CQ766028)編碼亞油酸異構(gòu)酶蛋白質(zhì)，產(chǎn)生425個(gè)氨基酸的tl0，cl2產(chǎn)物(SEQIDNo.1)。該異構(gòu)酶分子量為4卯77Da。與數(shù)據(jù)庫中的序列比^JC現(xiàn)克隆的異構(gòu)酶蛋白質(zhì)與已知氨基氧化酶的多數(shù)序列具有顯著同源性(~25-400個(gè)氨基酸；NCBI保守結(jié)構(gòu)域研究，Marchler-Bauer等人，2005)。該異構(gòu)酶的145-423氨基酸與來自痤瘡丙酸桿菌的假定氨基氧化酶(登錄號Q6A8X5—PROAC;EXPASY/UniProtKB數(shù)據(jù)庫)顯示96%的同一性，而與其次的最佳匹配-來自植物稻(Oryzasativa)的蛋白質(zhì)(日本產(chǎn)植物栽培變種組，登錄號Q7XR12—ORYSA;EXPASY/UniProtKB數(shù)據(jù)庫)僅有26%同一性。這些蛋白質(zhì)的比對區(qū)包括黃素結(jié)合位點(diǎn)。含黃素的胺氧化酶家族也包含八氫番茄紅素氫化酶和相關(guān)酶。已鑒定了位于氨基酸殘基10-39之間區(qū)域的NAD/FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PROSITE數(shù)據(jù)庫)。該異構(gòu)酶蛋白質(zhì)是可溶的，預(yù)測該蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)(PSORTb，英屬哥倫比亞，加拿大；SOSUI，MitakuGroup，東京，日本)。在10-26氨基酸位置檢測到假定的跨膜螺旋(HMMTOP;Tmpred)。然而，由于來自不同數(shù)據(jù)庫的結(jié)果沒有清楚的一致性，因》匕結(jié)果仍然有爭i義。除InterProScan(EuropeanBioinformaticsInstitute,Cambridge,UK)在1-23氨基酸之間鑒定出假定的信號肽以外，沒有檢測到信號肽。實(shí)施例7:亞油酸的生物轉(zhuǎn)化。攜帶構(gòu)建體pNZ44-coPAI的乳酸乳桿菌能夠?qū)⒂坞x亞油酸轉(zhuǎn)化為tl0，cl2CLA，而只含載體pNZ44的對照乳酸乳桿菌不能檢測到轉(zhuǎn)化為CLA(表1)。乳酸乳桿菌pNZ44-coPAI可以將大于50%的游離亞油酸轉(zhuǎn)化為tl0，cl2CLA(表1，圖3)。如果開始時(shí)與亞油酸(0.4-0.5mg/ml)共同培養(yǎng)，則乳酸乳桿菌生長不好，因此在培養(yǎng)物OD6。o-0.5時(shí)加入脂肪酸。在該點(diǎn)，培養(yǎng)物仍然顯示對該濃度的亞油酸的敏感性。較低濃度的游離亞油酸(O.l和0.2mg/ml)觀察到更高的轉(zhuǎn)化為CLA的轉(zhuǎn)化率。含有乳酸桿菌載體和coPAI基因(pMSP3535-coPAI)的副干酪乳桿菌NFBC338在OD600=0.5用50ng/ml乳鏈菌肽誘導(dǎo)并在脂肪酸(0.5mg/ml)中培養(yǎng)48小時(shí)以后，可以轉(zhuǎn)化接近30%的LA(從無培養(yǎng)物的對照培養(yǎng)基中回收)。然而，未誘導(dǎo)的副千酪乳桿菌NFBC338pMSP3535-coPAI細(xì)胞產(chǎn)生的tl0，cl2CLA與裔導(dǎo)細(xì)胞中獲得的量接近，未誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生24.4%，而乳鏈菌肽誘導(dǎo)的培養(yǎng)物為28.9%。攜帶構(gòu)建體pNZ44-coPAI的大腸桿菌細(xì)胞在脂肪酸(0.5mg/ml)存在下培養(yǎng)72小時(shí)以后，可以轉(zhuǎn)化約40%的回收的對照LA，而大腸桿菌pNZ44(對照載體)不產(chǎn)生任何CLA(表1，圖2和4)。表1.從培養(yǎng)液中回收的亞油酸至tl0，cl2CLA的轉(zhuǎn)化百分?jǐn)?shù)。培養(yǎng)物質(zhì)粒/構(gòu)建體誘導(dǎo)/未談導(dǎo)的加入的LA量(mg/ml培養(yǎng)液)從培養(yǎng)液中回收的亞油酸至U0，cl2CLA的轉(zhuǎn)化百分?jǐn)?shù)副干酪乳桿菌pMSP3535-coPAI50ng乳鏈菌肽/ml0.528.9+/-0.5NFBC338pMSP3535-coPAI未誘導(dǎo)0.524.4+/-0.4pMSP353550ng乳鏈菌肽/ml0.50pMSP3535未誘導(dǎo)0.50乳酸乳桿菌NZ9800pNZ44-coPAI-0.2(在OD6()。=0.5)52.2+/-1.0(沉淀中+60.1+/-0.5)pNZ44-0.2(在OD600=0.5)0大腸桿菌pNZ44-eoPAI-0.539.1+/-1.6pNZ44-0.50*百分比形式的全部轉(zhuǎn)化率涉及在沒有培養(yǎng)物和有培養(yǎng)物的情況下培養(yǎng)相同的時(shí)間后從培養(yǎng)基中回收和提取的亞油酸的量，其代表100%的可利用亞油酸。實(shí)施例8:從微生物中分離脂類。雙歧桿菌菌林(2。/。接種物)在加入0.5mg/ml亞油酸(希格瑪化學(xué)公司)的500mlcys-MRS(將0.05%(w/v)L-鹽酸半胱氨酸(純度98%;希格瑪化學(xué)公司St.Louis，MO，USA)加入MRS培養(yǎng)基中)中生長，來評估底物的生物轉(zhuǎn)化率。亞油酸以30mg/ml儲存溶液加入含2%(v/v)吐溫80的蒸餾水中。亞油酸儲存溶液預(yù)先用0.45mmMinisart濾器過濾除菌，并且避光儲存于-20。C。菌林在37。C厭氧培養(yǎng)42小時(shí)。孵育后，提取在細(xì)菌上清中的脂肪酸如下在450ml細(xì)菌上清中加入225ml異丙醇(純度99%;Alkem化學(xué)藥物公司，Cork,愛爾蘭)，渦旋30秒。在該混合物中加入己烷(開始加入170ml，渦旋混合，再力口入340ml)(純度99%;LabScanLtd"都柏林，愛爾蘭)，渦旋并在960xg離心5分鐘。將得到的上清(含脂類的己烷層)轉(zhuǎn)移到玻璃管中，在45。C氮?dú)鈼l件下將己烷干燥到2-3ml。脂類在氮?dú)鈼l件下儲存于-20。C。如先前所述(Stanton等人，1997)，加入內(nèi)標(biāo)物((:13:0十三烷酸(純度99%，希格瑪化學(xué)公司))、甲基化和氣液層析(GLC)后評估細(xì)菌上清的脂肪酸組成和亞油酸轉(zhuǎn)化為CLA的轉(zhuǎn)化水平。實(shí)施例9:甲基脂肪酸酯(FAME)的制備和GLC分析。如前述(Stanton等人，1997)在酸催化的甲基化以后通過GLC來分析己烷中的脂類提取物。計(jì)算在油(葵花籽油和豆油)中的游離脂肪酸作為酸和堿催化的甲基化以后脂肪酸濃度的差異，用2N甲醇KOH(希格瑪化學(xué)公司)在室溫下進(jìn)行。參考內(nèi)標(biāo)物C13:0進(jìn)行GLC。在ChrompackCPSil88柱(Chrompack，Middleburg,荷蘭，100mx0.25mm內(nèi)徑，0.20"m薄膜厚度)使用氦作為載氣在37psi(磅力/平方英寸)壓力下進(jìn)行FAME的分離。注射器溫度在225。C下保持恒溫10分鐘，檢測器溫度為250°C。層析柱恒溫器最初在140。C保持8分鐘，然后以程序設(shè)計(jì)每分鐘增加8.5。C直到最終溫度為200。C并保持41分鐘。用MinichromPC系統(tǒng)(VG數(shù)據(jù)系統(tǒng)，Manchester,UK)記錄和分析收集的數(shù)據(jù)。參考CLA混合物(Nu-Chek-Prep.Inc.,Elysian，MN)通過保留時(shí)間來鑒定反-10，順-12CLA異構(gòu)體。用以多種培養(yǎng)物接種和培養(yǎng)后在培養(yǎng)液中存在的CLA和亞油酸的量除以培養(yǎng)前培養(yǎng)液中存在的亞油酸量，來計(jì)算CLA轉(zhuǎn)化百分比和培養(yǎng)液中剩余的亞油酸。實(shí)施例10:上清中的脂類提取。將接種了CLA或LA的10ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到15ml離心管(Sarstedt,Numbrecht，德國)中，然后用三洋Mistral2000R離心機(jī)在2197xg室溫(20。C)離心20分鐘。提取前在4ml上清中加入0.75mgC13:0(十三烷酸，希格瑪，純度99%)作為內(nèi)標(biāo)物，提取方法如下在上清中加入2ml異丙醇(Alkem化學(xué)藥品公司Cork，愛爾蘭，純度99%)和1.5ml己烷(LabScanLtd.都柏林，愛爾蘭，純度99%),渦旋混合，然后再加入3ml己烷，再一次渦旋混合，然后將混合物在2197xg離心5分鐘。將所有的上層(含脂肪酸的己烷層)轉(zhuǎn)移到螺旋蓋玻璃管中，在N2氣流下干燥。然后在制備用于GLC(氣液層析)分析的甲基脂肪酸酯(FAME)之前，將玻璃管儲存于-2(TC。進(jìn)行GLC以后，以每毫升培養(yǎng)液中的脂肪酸毫克數(shù)計(jì)算結(jié)果。實(shí)施例ll:沉淀中的脂類提取。除去上清以后，通過在10ml生長培養(yǎng)基中的細(xì)菌細(xì)胞(沉淀)中加入1ml鹽溶液(0.137MNaCl、7.0mMK2HPO4、2.5mMKH:jP04)洗滌，將沉淀重懸并渦旋混合，然后在3632xg離心30分鐘。除去上清以后，再在lml鹽溶液中重懸沉淀，然后在3632xg離心15分鐘，和再一次除去上清。將細(xì)胞再一次重懸于1ml鹽溶液中，在制備用于GLC分析的FAME之前，向其中加入0.75mg<:13:0(如上對于上清所述)作為內(nèi)標(biāo)物。進(jìn)行GLC以后，以每毫升完全生長培養(yǎng)基中的脂肪酸毫克數(shù)計(jì)算結(jié)果，并表示為mg脂肪^7ml。實(shí)施例12:曱基脂肪酸酉旨(FAME)的制備。酸催化的甲基化獲得游離脂肪酸和甘油三酯結(jié)合脂肪酸的衍生物，其如下迷進(jìn)行在螺旋蓋玻璃管中的從上清和沉淀中提取的脂類(在2.4.1和2.4.2部分中描述)重懸于12ml的溶于甲醇中的4%甲醇HC1(v/v)(SupelcoInc.Bellefonte，PA，USA),渦旋混合10秒。甲醇HC1中的脂類在60。C培育1小時(shí)，每10分鐘渦旋混合一次。然后向溶液中加入2ml水飽和的己烷和5ml己烷，渦旋30秒，然后靜置30分鐘。隨后將含F(xiàn)AME的澄清上層轉(zhuǎn)移到一個(gè)管中，加入2ml水飽和的己烷，再次渦旋混合溶液，并靜置30分鐘。此后，將上層轉(zhuǎn)移到一個(gè)新管中，向該層加入0.5g無水疏酸鈉(希格瑪，純度99%)終止曱基化反應(yīng)，并渦旋混合5秒。1小時(shí)以后除去上層，在進(jìn)行GLC分析之前儲存于-20。C。實(shí)施例13:GLC分析。用配以火焰電離檢測器(FID)和Septun程序控制注射器(SPI)的氣液層析(GLC-Varian3400，Varian，HarborCity,CA，USA)分析作為甲基脂肪酸酯(FAME)的游離脂肪酸。參考內(nèi)標(biāo)物(C,3:。)進(jìn)行脂肪酸的定量。在ChrompackCPSil88柱(Chrompack，Middleburg,TheNetherlands)(100mx0.25mm內(nèi)徑，0.20m薄膜厚度)上用He作為載氣在33psi壓力下進(jìn)行脂肪酸的分離。注射器溫度225。C下保持恒溫IO分鐘，檢測器溫度為250°C。層析柱維持器最初在140。C保持8分鐘，然后以程序設(shè)計(jì)每分鐘增加8.5°C，直到最終溫度為200。C并保持41分鐘。用MinichromPC系統(tǒng)(VG數(shù)據(jù)系統(tǒng)，Manchester,UK)記錄和分析收集的數(shù)據(jù)。參考CLA標(biāo)準(zhǔn)(MatreyaInc.PA，USA)通過保留時(shí)間來鑒定反-10，順-12CLA異構(gòu)體，參考其標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸來鑒定反-ll-C18:1和硬脂酸(希格瑪化學(xué)公司St.Louis，MO，USA)。用內(nèi)標(biāo)物C13:0計(jì)算CLA異構(gòu)體峰的校正系數(shù)，乂A式如下Cfi-(AisXWti)/(AjXWtis)。其中Cfj是實(shí)際CLA異構(gòu)體的校正系數(shù)，Ais指內(nèi)標(biāo)物(C，3:。)峰的面積，Ai指CLA峰的面積，Wtj指CLA異構(gòu)體的重量，Wtjs指內(nèi)標(biāo)物的重量。CLA量表示為mg/ml培養(yǎng)液。通過相對于C^Q的面積來計(jì)算各脂肪酸的響應(yīng)系數(shù)，其設(shè)定為響應(yīng)系數(shù)l.O。用使用培養(yǎng)物接種以后培養(yǎng)液中存在的CLA和亞油酸的量除以培養(yǎng)前培養(yǎng)液中存在的亞油酸的量，來計(jì)算CLA轉(zhuǎn)化百分比和培養(yǎng)液中剩余的亞油酸的百分比。百分比形式的全部轉(zhuǎn)化率涉及在沒有培養(yǎng)物和實(shí)施例14:發(fā)酵油對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的抗增殖活性。為了研究乳酸乳桿菌pNZ44-coPAI和大腸桿菌pNZ44-coPAI亞油酸發(fā)酵以后產(chǎn)生的油的抗增殖作用，在提取的由亞油酸和U0，cl2CLA以1.35:1比例的混合物組成的發(fā)酵油存在下培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480。從37。C培養(yǎng)72小時(shí)之后的LB培養(yǎng)液中提取的亞油酸對照、亞油酸(希格瑪，95%)和純化的合成tl0，cl2CLA異構(gòu)體(Matreya)也與SW480細(xì)胞一起培養(yǎng)，從而比較發(fā)酵油和純化異構(gòu)體的作用，同時(shí)確定加入油的濃度低于亞油酸開始對癌細(xì)胞有細(xì)胞毒作用的濃度。由于亞油酸在42.8叫/ml培養(yǎng)基(152.5jiM)時(shí)對SW480癌細(xì)胞具有抗增殖作用，而且在16.9ng/ml培養(yǎng)基(60.2jiM)濃度具有輕微的促增殖作用(Miller等人，2003)，因此選擇tl0，cl2CLA(發(fā)酵油樣品)濃度在5-20ng/ml培養(yǎng)基(等于相同油樣品中6.7-27ng亞油^/ml培養(yǎng)基)之間，從而不超過亞油酸抑制細(xì)胞生長的闊濃度。以在5-20jig/ml之間濃度的tl0，cl2CLA培養(yǎng)5天以后，與對照亞油酸未發(fā)酵油相比，SW480癌細(xì)胞的生長有顯著的減少(p0.001)。用5-20照/mltl0，cl2CLA處理以后，與99.1%+/曙10.0%(5jig/ml)-95.40/o+/-7.8%(20Hg/ml)(對照未發(fā)酵的LA)相比，細(xì)胞活力減少到72.6%+/-13.6%(5ng/ml)-7.9%+/-4.5%(20jig/ml)(乳酸乳桿菌CLA)和80.7%+/-6.8%(5ng/ml)-19.6%+/-11.8%(20pg/ml)(大腸桿菌CLA)(圖5和6)。用最大濃度(25jig/ml)的亞油酸培養(yǎng)以后，對癌細(xì)胞具有顯著的抗增殖作用，以未發(fā)酵的對照亞油酸處理時(shí)細(xì)胞活力為76%+/-18.4%，而當(dāng)使用純化(95%)希格瑪亞油酸時(shí)細(xì)胞活力為93.2%+/-20.8%。所有的圖中乙醇對照=100%細(xì)胞活力。在所有濃度都觀測到對照油(未發(fā)酵的亞油酸)和來自乳酸乳桿菌和大腸桿菌的發(fā)酵油(tl0，c12CLA)之間細(xì)胞活力的顯著性差異(pO.OOl)。以對照亞油酸(未發(fā)酵油)和純化的亞油酸處理以后沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力的顯著性差異。同樣，以任意濃度的大腸桿菌tl0，cl2CLA(發(fā)酵油)和純化的tl0，cl2CLA(Matreya)處理后均未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力的顯著性差異。然而，在以10-15Hg/ml(pO.001)和20fig/ml(pO.01)濃度的乳酸乳桿菌tl0，cl2CLA和純化的tl0，cl2CLA處理時(shí)細(xì)胞活力有顯著性差異。參考文獻(xiàn)Alo膽，L.，Cuesta，E.P.andGilliland，S.E.2003.ProductionoffreeconjugatedlinoleicacidbyLactobacillusacidophilusandLactobacilluscaseiofhumanintestinalorigin.J.Dairy.Sci.86:1941-1946.Baumgard，L.H".Corl，B.A.，Dwyer，D.A.,Saeb02，A.andBauman，D.E.2000.Identi打cationoftheconjugatedlinoleicacidisomerthatinhibitsmilkfatsynthesis.Am.J,Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol.278:179-184.Belury，M.2002,Dietaryconjugatedlinoleicacidinhealth:Physiologicaleffectsandmechanismsofaction.Annu.Rev.Nutr.22:505-531.Blankson,H.，Stakkestad,J.A.，F(xiàn)agertun，H.，Thorn,E,Wadstein,J.andGudmimdsen,O,2000.ConjugatedLinoleicAcidReducesBodyFatMassinOverweightandObeseHumans.J.Nutr.130:2943-2948.Brown,J.M.，Boysen，M.S.，Je雄n，S.S,，Morrison,R.F"Storkson，J.，Currie,R.L，Pariza，M.，Mandmp，S.andMcintosh,M.K.2003.Trans-10,cis-12conjugatedlinoleicaciddecreasesglucoseandfa"yadduptakeandoxidationandinhibitsPPARgamma-dependentgeneexpressioninhumanpreadipoicytes.J.LipinRes.44:1287-1300.Coakley,M.，Ross,R.P"Nordgren，M.，F(xiàn)itgerald,G"Devery,DandStanton,C.2003.Conjugatedlinoleicacidbiosynthesisbyhuman-derivedBifidobacteriumspecies.J，Appl.Microbiol.94:138-145.Chin，S.E，Storksson,J.M.，Liu，W"Albright,K.J.andPariza，M.W.1994.Conjugatedlinoleicacid(9，11-and10,12-octa-decadienoicacid)isproducedinconventionalbutnotgerm-freeratsfedlinoleicacid.J.Nutr.124:694-701.Choi,Y"Kim，Y-C，Han，Y-B.，Park,Y"ParizaM.W.andNtambi，J.M.2000.Thetrans-10,cis-12isomerofconjugatedlinoleicaciddownregulatesStearoyl-CoAdesaturase1geneexpressionin3T3-L1adipocytesJ.Nutr.130:1920-1924.deRuyter,P.G"Kuipers,O.P"anddeVos，W.M.1996.ControlledgeneexpressionsystemsforLactococcuslactiswiththefood-gradeinducernisin.ApplEnvironMicrobiol.62:3662-3667.Jiang,J.，Bjorck，LandFonden，化1998.Productionofconjugatedlinoleicacidbydairystartercultures.J.Appl.Microbiol.85:95-102.Jenkins,J.K.andCourtney,P.D.2003.Lactobacillusgrowthandmembranecompositioninthepresenceoflinoleicorconjugatedlinoleicacid.Can.J.Microbiol.49:51-57.Jensen,R.G.2002.Thecompositionofbovinemilklipids.J.DairySci.85:295-350.Kankaanpaa,P.E.,Salminen,S.J.，lsolauriE.andLee，Y.K.2001.Theinfluenceofpolyunsaturatedfattyacidsonprobioticgrowthandadhesion.FEMSMicrobiol.Lett.194:149-153.Khulusi,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10，順-12共軛亞油酸異構(gòu)酶是從痤瘡丙酸桿菌中分離。7.根據(jù)權(quán)利要求1到6的方法，其特征在于在權(quán)利要求1的步驟(a)中所用的微生物選自乳酸桿菌科、鏈球菌科、丙酸桿菌科、腸桿菌科和雙歧桿菌科組成的組。8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于轉(zhuǎn)基因微生物選自乳球菌屬、乳酸桿菌屬、丙酸桿菌屬、大腸桿菌屬和雙歧桿菌屬組成的組。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其特征在于轉(zhuǎn)基因微生物選自乳酸乳球菌種、副干酪乳桿菌種和大腸桿菌種組成的組。10.根據(jù)權(quán)利要求1到9的方法，其中將亞油酸加入到具有光密度(ODM0)至少為0.1的微生物培養(yǎng)物中。11.根據(jù)權(quán)利要求1到10的方法，其中亞油酸的生物轉(zhuǎn)化率高于10%。12.根據(jù)權(quán)利要求1到11的方法，用于生產(chǎn)富含共軛亞油酸的飼料產(chǎn)品或食品產(chǎn)品。13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，用于生產(chǎn)富含共軛亞油酸的營養(yǎng)制品。14.富含共軛亞油酸的飼料產(chǎn)品、食品產(chǎn)品和營養(yǎng)制品，其特征在于共輒亞油酸是根據(jù)權(quán)利要求1到13的任一項(xiàng)所定義的方法產(chǎn)生。15.表達(dá)核酸分子的轉(zhuǎn)基因微生物，該核酸分子編碼根據(jù)權(quán)利要求2到6的反-10，順-12共軛亞油酸異構(gòu)酶，其中所述核酸分子功能性連接于至少一種異源啟動子序列。16.根據(jù)權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)基因微生物用作食品和伺料中的益生菌的用途。17.根據(jù)權(quán)利要求16的用途，其特征在于微生物選自乳球菌屬、乳酸桿菌屬、丙酸桿菌屬、大腸桿菌屬和雙歧桿菌屬組成的組。18.根據(jù)權(quán)利要求17的用途，其特征在于微生物選自短雙歧桿菌、齒雙歧桿菌和假鏈狀雙歧桿菌組成的組。19.根據(jù)權(quán)利要求1到11所述方法產(chǎn)生的發(fā)酵油。20.根據(jù)權(quán)利要求19的發(fā)酵油在生產(chǎn)治療癌癥的藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及在轉(zhuǎn)基因微生物中產(chǎn)生反-10，順-12共軛亞油酸的方法，其包括步驟(a)向所述微生物中引入至少一種編碼反-10，順-12共軛亞油酸異構(gòu)酶的核酸分子，(b)培養(yǎng)(a)中獲得的轉(zhuǎn)基因微生物，(c)通過向培養(yǎng)物中加入亞油酸來誘導(dǎo)反-10，順-12共軛亞油酸的產(chǎn)生，(d)孵育誘導(dǎo)的培養(yǎng)物至少12小時(shí)，和(e)從培養(yǎng)基和/或轉(zhuǎn)基因微生物中分離共軛亞油酸。文檔編號C12N1/20GK101341254SQ200680047911公開日2009年1月7日申請日期2006年11月29日優(yōu)先權(quán)日2005年12月24日發(fā)明者C·斯坦頓申請人:蒂加斯克乳制品研究中心