專利名稱：：產生l-氨基酸的細菌和用于產生l-氨基酸的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及使用微生物產生L-氨基酸的方法，更具體地，涉及用于產生L-氨基酸例如L-賴氨酸、L-蘇氨酸和L-谷氨酸等的方法。L-賴氨酸和L-蘇氨酸通常用作動物飼料添加劑、保健食品成分、氨基酸浸劑(infbsion)等，且L-谷氨酸通常用作調味品。因此，這些是工業(yè)上有用的L-氨基酸。
背景技術：
：在工業(yè)上采用發(fā)酵方法，使用短桿菌屬(5^WZ^"en'Mw)、棒桿菌屬(Co，e6"cteW扁)或埃希氏菌屬(&c/zm'c/^)等的微生物生產L-氨基酸(EP0857784、0999267,1170358、JP11-192088A、WO00/53726、W096A7930、WO03/04674)。野生型孩i生物、所述菌林的人工突變體和以通過重組DNA技術而將L-氨基酸生物合成酶的活性增強的方式修飾的微生物通常用于L-氨基酸的產生。用于增強各種菌抹產生L-氨基酸的能力的已知方法包括，修飾L-氨基酸的攝取(uptake)或輸出(export)。例如，為了修飾攝取，通過缺失或減少細胞中的L-氨基酸攝取來增強產生L-氨基酸的能力。例如，一種方法是通過缺失gluABCD操縱子或該操縱子的一部分來缺失或減少L-谷氨酸的攝取(EP1038970)等。用于修飾L-氨基酸輸出的方法之一是缺失或減少L-氨基酸生物合成中間物的輸出，而另一種方法是加強L-氨基酸的輸出。對于前者，如果目標氨基酸是L-谷氨酸，已知方法是通過突變或破壞a-酮戊二酸通透酶基因，減少L-谷氨酸生物合成中的中間物a-酮戊二酸的輸出(WO01/005959)。為了缺失或減少L-氨基酸生物合成中間物的輸出，已經報道了過量表達L-氨基酸輸出的方法，例如，使用將L-賴氨酸或L-精氨酸輸出基因(LysE)(JournalofMolecularMicrobiologyBiotechnology(JMolMicrobiolBiotechnol)1999Nov;l(2):327-36)的表達增強的棒桿菌屬微生物的細菌菌抹來產生L-賴氨酸(W097/23597)或L-精氨酸。另夕卜，報道了使用埃希氏菌屬的細菌產生L-氨基酸的方法，在所述細菌中表達rhtA、B和C基因(US6，303,348)或yfiK、yahN基因等(EP1013765)。除了如上所述修飾L-氨基酸生物合成途徑和修飾L-氨基酸的攝取和輸出，改進產生L-氨基酸能力的方法的其它實例是修飾攝和瞎的能力。例如，磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸轉移酶系統(tǒng)(在下文中也稱作PTS:磷酸轉移酶)是公知的攝取糖的轉運體。另外，將PTS歸類為非底物依賴性共有系統(tǒng)(commonsystem)EI(由ptsl編碼)、HPr(由ptsH編碼)，或底物特異性組分EII。葡萄糖特異性EII由ptsG和crr編碼，其中err基因與ptsH和ptsl—起是操縱子的一部分。用于產生L-氨基酸的一種已知方法使用將ptsG基因增強的埃希氏菌屬(W003/04670),而另一種方法使用將ptsH、ptsl和crr基因增強的埃希氏菌屬(W003/04674)。除了上述的葡萄糖PTS,已知bglF基因編碼P-糖苷特異性磷酸轉移酶(PTS)(JournalofBacteriology,1999，Vol.18，No.2,p462-468,Biochemistry,1998,Vol.37，pl7040-17047，Biochemistry,1998,Vol.37，p8714-8723)，但是尚未報道使用編碼除葡萄糖PTS之外的PTS的基因用于產生L-氨基酸。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供能夠有效產生L-氨基酸的細菌菌林，并且提供使用所述細菌菌抹產生L-氨基酸的方法。為了解決上述問題，已經發(fā)現(xiàn)使用經修飾而增加p-糖苦PTS活性的屬于腸桿菌科(familyEwfera6acfeW"ceae)的微生物能夠有效地產生L-氨基酸。即，本發(fā)明如下本發(fā)明的目的是提供產生L-氨基酸的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)腸桿菌科的微生物，所述微生物具有產生L-氨基酸的能力并且經修飾以使{3-糖苷PTS活性增強；和從所述培養(yǎng)基或細胞中收集L-氨基酸。本發(fā)明的目的是提供上述方法，其中通過增加基因的拷貝數(shù)，或修飾所述基因的表達調節(jié)序列，或它們的組合對所述微生物進行修飾以增強編碼卩-糖苷PTS的bglF基因的表達。本發(fā)明的目的是提供上述方法，其中所述bglF基因選自下組(a)包含SEQIDNo.5的核苷酸序列的DNA,(b)在嚴緊條件下與SEQIDNo.5的核苷酸序列的互補序列或與能夠從所述核苷酸序列制備的探針雜交的DNA，并且所述DNA編碼具有p-糖苷PTS活性的蛋白質。本發(fā)明的目的是提供上述方法，其中所述微生物是埃希氏菌屬或泛菌屬CPawtoea)的細菌。本發(fā)明的目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸選自下組L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-谷氨酸和它們的組合。附圖簡述圖1顯示質粒pMW118-attL-Tc-attR的構建。圖2顯示質粒pMW118-attL-Cm-attR的構建。圖3顯示質粒pMW-intxis-ts的構建。優(yōu)選實施方式詳述在下文中，將對本發(fā)明進行詳細說明。<1>本發(fā)明的微生物本發(fā)明的微生物是腸桿菌科的微生物，其具有產生L-氨基酸的能力，并且經修飾以增強(3-糖苷PTS活性。短語"產生L-氨基酸的能力"的意思是當在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物時，在培養(yǎng)基或所述微生物的細胞中產生和31起L-氨基酸積累的能力。本發(fā)明的微生物可具有產生多種L-氨基酸的能力。所述微生物可能天然具有產生L-氨基酸的能力，或可通過誘變或重組DNA技術進行修飾以賦予產生L-氨基酸的能力，例如下文所述的那些。L-氨基酸的類型無具體限制。L-氨基酸的實例包括堿性L-氨基酸例如L-賴氨酸、L-鳥氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸和L-瓜氨酸(L-citrulline);脂肪族L-氨基酸例如L-異亮氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸和L-甘氨酸；羥基L-氨基酸例如L-蘇氨酸和L-絲氨酸；環(huán)狀L-氨基酸例如L-脯氨酸；芳族L-氨基酸例如L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸；含硫L-氨基酸例如L-半胱氨酸、L-胱氨酸和L-曱硫氨酸；和酸性L-氨基酸例如L-谷氨酸、L-天冬氨酸；酸性L-氨基酸的酰胺例如L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺等。本發(fā)明的微生物可具有產生兩種或多種氨基酸的能力。<1-1〉賦予產生L-氨基酸的能力以下實例包括對賦予產生L-氨基酸能力的方法的描述，以及能夠用于本發(fā)明的被賦予產生L-氨基酸能力的微生物的實例。本發(fā)明的微生物不限于這些，只要它們具有產生L-氨基酸的能力，則可以是任何微生物。對用于本發(fā)明的微生物無具體限制，只要其屬于腸桿菌科，例如埃希氏菌屬、腸桿菌屬C&7tera6acfe。、泛菌屬、克雷伯氏菌屬(《/^^&//")、沙雷氏菌屬(&rra"a)、歐文氏菌屬CErvW"/a)、沙門氏菌屬(5"a/mowe〃a)、摩才艮氏菌屬(7Ww^a"e/fe)等，并且其具有產生L-氨基酸的能力。具體地，可以使用屬于如NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)凄史據(jù)庫中分類的腸4干菌科的任何微生物(http:〃www.genome.ad.jp/dbget誦bin/get一htextOrganisms+-e+L+A+-s+F+-f+F+A2—A#L2)。作為能夠被修飾的腸桿菌科的親本菌林，特別期望使用屬于埃希氏菌屬、腸4干菌屬或泛菌屬的細菌。對于用以獲得本發(fā)明的細菌的埃希氏菌屬細菌的親本菌株不進行具體限制，但可以使用Neidhardt等所列的菌抹(Neidhardt,F.C.etal.,^Esc/zer/c/z/aco//andSa/,Me〃a3)^/z/畫n'騰,AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,D.C.,1029表1)。一個實例是大腸#菌。大腸桿菌的具體實例是大腸桿菌W3110(ATCC27325)、大腸桿菌MG1655(ATCC47076)等，其是源自K12的野生型菌抹的原型(prototype)。這些可以從例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection(地址P.O.Box1549Manassas,VA20108，USA》獲得。它們可以通過使用給予每個菌林的登錄號來獲得(參見http:/www.atcc.org)。所述登錄號相應于每個細菌菌林，并且列于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄。腸桿菌屬細菌的實例包括成團腸桿菌(五wtera6a"eragg/omera似)和產氣腸4干菌era6acter。f乏菌屬纟田菌的實4列是P"打。在近幾年中，基于16SrRNA核苷酸序列分析，有時將成團腸桿菌重分類為成團泛菌(尸朋/oeaa欲/o附era"力、和斯氏泛菌(戶a"toe(3他而W,)。對于本發(fā)明，可以4吏用歸類在腸桿茼科中的任何細菌，無論屬于腸桿菌屬或泛菌屬。菌抹尸a"toeaAJ13355(FERMBP-6614)、AJ13356(FERMBP-6615)、AJ13601(FERMBP-7207)或它們的任何衍生物可用于通過基因工程方法培育P朋toea朋。朋to。在分離時，將這些菌抹鑒定并且保藏為成團腸桿菌。如上所述，通過使用16SrRNA核苷酸序列的分析，已將這些細菌重分類為尸朋toeaa"a朋fe。對于本發(fā)明，可以使用屬于腸桿菌屬或泛菌屬的任何細菌，只要所述細菌歸類于腸桿菌科中。下文將描述用于將產生L-氨基酸的能力賦予屬于腸桿菌科的微生物的方法。為了賦予產生L-氨基酸的能力，可以獲得營養(yǎng)缺陷突變體、類似物抗性菌抹或代謝調節(jié)突變體，或可以產生將L-氨基酸生物合成酶的表達增強的重組菌一朱。也可使用在棒狀桿菌型細菌(coryneformbacteria)或埃希氏菌屬細菌的培育中常規(guī)使用的方法(參見"AminoAcidFermentation",GakkaiShuppanCenter(Ltd.),1stEdition,publishedMay30,1986，pp,77-100)。在本文中，在產生L-氨基酸的細菌的培育中，可貝武予一種或多種性質，例如營養(yǎng)缺陷突變、類似物抗性或代謝調節(jié)突變。也可使用將一種或多種L-氨基酸生物合成酶的表達的增強。另外，可以將賦予性質與增強生物合成酶的活性組合進行，所述性質例如營養(yǎng)缺陷突變、類似物抗性或代謝調節(jié)突變。具有產生L-氨基酸的能力的營養(yǎng)缺陷突變體菌林、L-氨基酸類似物抗性菌抹或代謝調節(jié)突變體菌林可如下獲得對親本或野生型菌林施以常規(guī)突變處理，例如用X-射線或UVB照射處理，或用誘變劑例如N-曱基-N，-硝基-N-亞硝基胍處理等；其后選擇顯示營養(yǎng)缺陷突變、類似物抗性或代謝調節(jié)突變并且還具有產生L-氨基酸的能力的那些菌林。L-賴氨酸類似物抗性菌林或代謝調節(jié)突變體的實例包括但不限于，大腸桿菌AJ11442菌林(FERMBP-1543、'NRRLB-12185、JP56-18596A和美國專利No.4,346,170)、大腸桿菌VL611菌林(EP1016710A)等。也可以使用大腸桿菌WC196菌抹(WO96/17930)作為產生L-賴氨酸的細菌。通過將AEC(S-(2-氨乙基)-半胱氨酸)抗性賦予源自大腸桿菌K-12的W3110菌林來培育WC196菌株。將這種菌抹命名為大腸桿菌AJ13069,并且在1994年12月6日以登錄號FERMP-14690保藏在工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所(theNationalInstituteofBioscienceandHuman-TechnologyoftheAgencyofIndustrialScienceandTechnology)(目前為，獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所特許微生物保藏中心(InternationalPatentOrganismDepositary,NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology);Chuo6，1-1,Higashil陽chome,Tsukuba-shi，Ibaraki-ken305_8566，Japan),并且根據(jù)布達佩斯條約(BudapestTreaty)在1995年9月29日轉為國際保藏，并給予登錄號FERMBP-5252。也可通過增加L-賴氨酸生物合成酶活性來構建產生L-賴氨酸的細菌。編碼L-賴氨酸生物合成酶的基因的實例是二氫吡啶二羧酸合酶基因(dapA)(EP0733710B)、天冬氨酸激酶基因(lysC)(EP0733710、US5,932，453)、二氫吡咬二羧酸還原酶基因(dapB)、二氨基庚二酸脫羧酶基因(lysA)、二氨基庚二酸脫氫酶基因(ddh)(WO96/40934)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)(JP60-87788A)、天冬氨酸氨基轉移酶基因(aspC)(JP6-102028A)、二氨基庚二酸差向異構酶基因(dapF)(WO00/56858)、天冬氨酸半醛脫氫酶基因(asd)(WO00/61723)和二氨基庚二酸途徑酶的其它基因；以及高烏頭酸水合酶基因(JP2000-157276)和氨基己二酸途徑酶的其它基因。這些基因的縮寫在各自名稱之后的括號內給出。此外，已知野生型二氫吡啶二羧酸合酶(DDPS)和天冬氨酸激酶(AK)受到L-賴氨S吏反饋抑制的阻抑；因此，當使用dapA和lysC時，優(yōu)選分別使用編碼對L-賴氨酸反饋抑制有抗性的二氫吡啶二羧酸合酶和天冬氨酸激酶的突變基因(EP0733710、US5，932,453)。編碼對L-賴氨酸反饋抑制有抗性的突變二氫吡啶二羧酸合酶的DNA的實例包括編碼具有以下氨基S臾序列的DDPS的DNA,在所述氨基酸序列中用酪氨酸取代第118位的組氨酸殘基(U.S.5,661,012和6,040,160)。另外，編碼對L-賴氨酸反饋抑制有抗性的突變AK的DNA的實例包括編碼具有以下氨基酸序列的AK的DNA,在所述氨基酸序列中用異亮氨酸取代352-蘇氨酸殘基(U.S.5,661,012和6,040,160)。這些突變DNA能夠通過使用PCR的定點誘變等獲得。以下是通過將編碼L-賴氨酸生物合成酶的基因引入宿主中來賦予產生L-賴氨酸的能力的實例。即，通過將編碼L-賴氨酸生物合成基因的基因片段與在用于產生L-賴氨酸的宿主微生物中發(fā)揮功能的載體連接來制備重組DNA,所述載體優(yōu)選是多拷貝型載體，并且使用這種重組DNA來轉化所述宿主。通過所述轉化，在宿主細胞中編碼L-賴氨酸生物合成酶的基因的拷貝數(shù)增加，使表達增強并且從而增加酶活性。不具體指定編碼L-賴氨酸生物合成酶的基因，只要它們能夠在宿主^f鼓生物中表達。實例包括源自大腸桿菌的基因，和源自棒狀桿菌型細菌的基因。由于大腸桿菌和谷氨酸^奉桿菌(Co^y"e6acfen'wmg/wtom/cww)的全基因組序列已經確定，所以能夠基于這些基因的核苷酸序列合成引物，并且使用PCR方法獲得這些基因，在所述PCR方法中將微生物(例如大腸桿菌K12)的染色體DNA等用作模板。為了克隆這些基因，可以使用在腸桿菌科中自主復制的質粒。實例包括pBR322、pTWV228(TakaraBioInc.)、pMW119(NipponGeneCo"Ltd.)、pUC19、pSTV29(TakaraBioInc.)、RSF1010(Genevol.75(2),pp.271-288,1989)等。此外，也可使用噬菌體DNA的載體。為了將耙基因連接至上述載體，將載體用限制酶消化，所述限制酶與含有輩巴基因的DNA片段末端匹配。連接通常用連接酶例如T4DNA連接酶進行。靶基因可能分別存在于不同的載體上，或存在于相同的載體上?？梢允褂帽绢I域技術人員已知的常規(guī)方法來消化和連接DNA,以及制備染色體DNA、進行PCR、制備質粒DNA、轉化、確定用作引物的寡核苷酸等。這些方法在Sambrook,丄,andRussell,D.W.MolecularCloningALaboratoryManual/ThirdEdition.NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)等中描述?？梢允褂眠_到充分轉化效率的任何方法將如上所述制備的重組DNA引入樣i生物。實例包括電穿孔(CanadianJournalofMicrobiology,43，197(1997))。使用電穿孔制備的質粒的實例是pCABD2,所述質粒含有dapA、dapB和LysC基因(WO01/53459)。也可通過將靶基因的多拷貝引入微生物的染色體DNA來實現(xiàn)增強編碼L-賴氨酸生物合成酶的基因的表達?？赏ㄟ^使用以多拷貝存在于所述染色體DNA上的序列作為同源重組中的靶來將靶基因的多拷貝引入微生物的染色體DNA中。對這種以使用同源重組的基因取代為基礎位點特異性地引入突變已有描述。已經描述使用線性DNA或含有溫度敏感復制起點的質粒的方法(美國專利6,303,383和5,616,480)。可以使用重復DNA和存在于可轉座元件末端的反向重復序列作為以多拷貝存在于染色體DNA上的序列。可將L-賴氨酸生物合成基因與天然存在于染色體上的基因串聯(lián)(intandem)連接，或可將其引入染色體上的非必需區(qū)或引入如果缺失將使L-賴氨酸產率得到改進的基因區(qū)。此外，如US5，595,889中披露，還可將耙基因定位于轉座子上，其后轉移所述轉座子以將多拷貝引入染色體DNA。用任一方法，將轉化體中輩巴基因的拷貝數(shù)增加，從而使L-賴氨酸生物合成的酶活性增加。除了上述基因擴增外，可通過用較強的啟動子取代靶基因的表達調節(jié)序列(如啟動子等)來實現(xiàn)L-賴氨酸生物合成酶活性的增加(參見JP1-215280A)。例如，lac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、tac啟動子、X噬菌體PR啟動子、PL啟動子和tet啟動子是公知的強啟動子。使用這些啟動子取代使靶基因的表達增加，由此增強酶活性。強啟動子的實例和用于評估啟動子強度的方法的實例在Goldstein等的文章等中描述(Prokaryoticpromotersinbiotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.，1995,1，105-128)。也可通過修飾在耙基因表達的調節(jié)中涉及的元件來實現(xiàn)L-賴氨酸生物合成酶活性的增加，所述元件例如操縱基因或阻抑物(Hamiltonetal,;JBacteriol.1989Sep;171(9):4617-22)。如WO00/18935中披露，能夠在靶基因啟動子的-35、-10區(qū)中引入幾個堿基的取代以修飾和增強所述基因。另外，已知在核糖體結合位點(RBS)和起始密碼子之間的間隔區(qū)中，特別在起始密碼子的緊鄰上游序列中取代幾個核苷酸，對mRNA翻譯效率具有強烈的影響。能夠通過啟動子探針載體和基因分析軟件(例如GENETYX)等確定靶基因啟動子的表達調節(jié)區(qū)等。例如，能夠以與上述使用溫度^:感質粒的基因取代相同的方式進行表達調節(jié)序列的取代。也可^f吏用'Red-驅動整合方法(Red-drivenintegrationmethod(WO2005細175))。此外，在本發(fā)明的產生L-賴氨酸的細菌中，可將下述酶的活性減少或缺失催化從L-賴氨酸生物合成途徑分支的L-賴氨酸之外化合物產生的酶，或對L-賴氨酸的產生具有負效應的酶。這些酶包括高絲氨酸脫氫酶(thrA)、賴氨酸脫羧酶(cadA、lysC)和蘋果酸酶(sfcA、b2463)。在WO95/23864、WO96/17930、WO2005/010175等中提供酶活性減少或缺陷的菌抹。為了在細胞中減少或缺失所述酶活性，可使用常規(guī)和已知的方法，對編碼上述酶的基因進行誘變。這可以通過如下方法實現(xiàn)例如，-使用遺傳重組來缺失在染色體上編碼酶的基因，或修飾啟動子或Shine-Dalgamo(SD)序列等表達調節(jié)序列。這也可通過如下方法實現(xiàn)在染色體上編碼酶的區(qū)中引入氨基酸:取代(錯義突變)或終止密碼子(無義突變)，引入添加或缺失l-2個^成基的移碼突變，或缺失基因的部分或完整區(qū)(JournalofBiologicalChemistry272:8611-8617(1997);JournalofAntimicrobialChemotherapy20046，793-796;BiotechnolProg1999,15,58-64;J.BiologicalChemistryvol272NO.13pp8611-8617)。同樣，通過如下方法將酶活性減少或缺失構建缺失編碼區(qū)的編碼突變酶的基因，其后通過同源重組等用這種基因取代染色體上的野生型基因，或將轉座子或IS元件引入所述基因?？梢允褂靡韵路椒ㄍㄟ^遺傳重組來引入使上述酶活性減少或缺失的突變。將含有靶基因的分離的DNA突變，以使所得突變基因不產生正常發(fā)揮功能的酶。隨后，使用含有所述基因的DNA，將這種突變基因轉化至屬于腸桿菌科的微生物中，并且產生突變型基因與染色體上基因的重組。對于使用這種同源重組的基因取代，存在使用線性DNA的方法，例如稱為"Red-驅動整合，，的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97，No.12,pp.6640-6645)，或將Red-驅動整合方法與人噬菌體切除系統(tǒng)(Xphageexcisivesystem)組合的方法(J.Bacteriol.2002Sep;184(18):5200-3,Interactionsbetweenintegraseandexcisionaseinthephage入excisivenucleoproteincomplex.ChoEH,GumportRI,GardnerJF)(參見WO2005/0101乃)等；還存在使用含有溫度敏感復制起點的質粒的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000，vol.97,No.12，pp.6640-6645、美國專利No.6,303,383或5,616,480)。這種如上所述使用同源重組通過基因取代位點特異性地引入突變也可使用在宿主中不具有復制能力的質粒進行。上述用于增加L-賴氨酸生物合成中涉及的酶活性的方法和用于減少酶活性的方法同樣可以用來培育產生其它L-氨基酸的細菌。以下將說明用來培育其它L-氨基酸細菌的方法。作為本發(fā)明中使用的產生L-谷氨酸的細菌，存在例如屬于腸桿菌科的微生物，所述微生物經修飾而將編碼L-谷氨酸生物合成中涉及的酶的基因的表達增加。L-谷氨酸生物合成中涉及的酶包括谷氨酸脫氫酶(gdh)、谷氨酰胺合成酶(gltAB)、谷氨酸合酶(glnA)、異檸檬酸脫氫酶(icd)、烏頭酸水合酶(acn)、檸檬S臾合酶(gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸羧化酶(pycA)、丙酮酸脫氫酶(pdhA)、丙酮酸激酶(pykA)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(pps)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油酸變位酶(pgm)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)、丙糖磷酸異構酶(tpi)、果糖二磷酸醛縮酶(fba)、磷酸果糖激酶(pfk)、葡糖磷酸異構酶(gpi)等。在這些酶之中，檸檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、谷氨酸脫氫酶和它們的組合是優(yōu)選的，并且使用全部三種是更優(yōu)選的。使用上述方法修飾而將檸檬酸合酶基因、磷酸烯醇丙酮酸脫羧酶基因和/或谷氨酸脫氬酶基因的表達增強的,于腸桿菌科的微生物的實例在美國專利Nos.6,197,559和6,331,419、EP0999282、WO2006/051660中提供。此外，還可以使用經修飾而將6-磷酸葡糖酸脫水酶或2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸醛縮酶中任一的活性增加或將二者的活性都增加的屬于腸桿菌科的孩爻生物(EP1352966B)?？梢允褂玫木哂挟a生L-谷氨酸能力的腸桿菌科^t生物包括下述細菌，在所述細菌中，將催化L-谷氨酸之外化合物的產生的酶活性減少或降低，而所述化合物的產生從L-谷氨酸的生物合成途徑分支。催化從L-谷氨酸生物合成途徑分支的除L-谷氨酸之外的化合物產生的酶的實例是2-酮戊二酸脫氫酶(sucA)、異檸檬酸裂合酶(aceA)、乙酰鞋酸合酶(ilvG)、乙酰乳酸合酶(ilvN)、甲酸乙酰轉移酶(pflB)、乳酸脫氬酶(ldh)、谷氨酸脫羧酶(gadA)和1』比咯啉脫氫酶(l-pyrrolinedehydrogenase)(putA)等。在這些之中，特別優(yōu)選減少或缺失2-酮戊二酸脫氳酶的活性。用于在屬于腸桿菌科的微生物中缺失或減少2-酮戊二酸脫氫酶的活性的方法在美國專利5,573,945、美國專利No.6,197,559和美國專利No.6,331,419中描述。將2-酮戊二酸脫氫酶活性缺失或減少的屬于腸桿菌科的微生物的實例包括以下iW麵朋畫泡AJ13601(FE腿BP-7207)才直生克雷伯氏菌(〖/eZ^/e〃a;/a油'co/a)AJ13410菌才朱(FERMBP-6617)大腸桿菌AJ12949(FERMBP-4881)等等。AJ12949菌林是將a-酮戊二酸脫氫酶活性減少的細菌菌株，并且在1993年12月28日以登錄號FERMP-14039保藏在工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所(目前為，獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所特許微生物保藏中心(Chuo6,1-1，Higashil-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken305-8566，Japan),并且根據(jù)布達佩斯條約在1994年11月11日轉為國際保藏，并給予登錄號FERMBP-4881。本發(fā)明中優(yōu)選使用的產生L-色氨酸的細菌是以下酶中一種或多種的活性增強的細菌即鄰氨基苯曱酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脫氫酶(serA)或色氨酸合酶(trpAB)。由于鄰氨基苯曱酸合酶和磷酸甘油酸脫氫酶均受到L-色氨酸和L-絲氨酸的反饋抑制，能夠通過保留(retain)脫敏的突變酶來增加這些酶的活性(US5,618，716、US6,180,373)。例如，通過將鄰氨基苯曱酸合酶基因(trpE)和/或磷酸甘油酸脫氬酶基因(serA)突變以防止反饋抑制，再將所述突變基因引入屬于腸桿菌科的微生物，可獲得具有脫敏的酶的細菌。這種細菌的具體實例是大腸桿菌SV164，所述細菌保留脫敏的鄰氨基苯曱酸合酶，并且用具有突變serA的質粒pGH5轉化所述細菌，所述突變的serA編碼脫每文的磷酸甘油酸脫氬酶(W094/08301)。用含有色氨酸操縱子的重組DNA轉化的細菌也是優(yōu)選的產生L-色氨酸的細菌。具體實例是用含有編碼脫敏鄰氨基苯甲酸合酶(trpAB)的基因的色氨酸操縱子轉化的大腸桿菌(JapanesePatentApplicationPublicationNo.JP57-71397、JapanesePatentApplicationPublicationNo.JP62-244382、美國專利No.4,371,614)。另外，在色氨酸操縱子中，能夠通過增加編碼色氨酸合酶的基因(trpBA)的表達來增強產生L-色氨酸的能力。色氨酸合酶含有分別由trpA和trpB編碼的a和p亞基(W02005/103275)。產生L-色氨酸的細菌的實例是生長需要L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的大腸桿菌AGX17(pGX44)[NRRLB-12263]，和保留包含色氨酸操縱子的質粒pGX50的AGX6(pGX50)aroP[NRRLB-12264](參見美國專利No.4,371,614)。缺乏色氨酸操縱子阻抑物(trpR)的菌抹和具有突變trpT的菌株也是理想的產生L-色氨酸的細菌(美國專利No.4,371,614WO2005/056776)。其它優(yōu)選的產生L-色氨酸的細菌是結構性表達蘋果酸合酶(aceB)、異檸檬酸裂合酶(aceA)和異檸檬酸脫氫酶/磷酸酶(icl)操縱子(ace操縱子)的細菌，或將所述操縱子的表達增強的細菌(W02005/103275)。L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸均為芳族氨基酸，并且共享生物合成系統(tǒng)。編碼芳族氨基酸生物合成酶的基因的實例包括脫氧阿拉伯-庚酮糖酸磷酸合酶(deoxyarabino-heptulosonatephosphatesynthase)(aroG)、3-脫氬查寧酸合酶(aroB)、莽草酸脫水酶、莽草酸激酶(aroL)、5-烯醇丙酮酰莽草酸[-]3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate[-]3-phosphatesynthase)(aroA)和分支酸合酶(aroC)(EuropeanPatentApplicationPublicationNo.763127)。因此，通過a奪編碼這些酶的基因多重拷貝(multi-copy)至質?；蚧蚪M上，能夠改進產生芳族氨基酸的能力。已知這些基因由酪氨酸抑制子(tyrR)調控，所以也可通過缺失tyrR基因來增加芳族氨基酸的生物合成酶活性(EP763127)。產生L-蘇氨酸的細菌優(yōu)選是屬于腸桿菌科的微生物，其中已將所述L-蘇氨酸生物合成酶增強。編碼L-蘇氨酸生物合成酶的基因的實例包括天冬氨酸激酶III基因(lysC)、天冬氨酸半醛脫氫酶基因(asd)、編碼thr操縱子的天冬氨酸激酶I基因(thrA)、高絲氨酸激酶基因(thrB)和蘇氨酸合酶基因(thrC)。這些基因的縮寫在它們的名稱之后的括號內給出?？梢脒@些基因中的兩種以上?？蓪-蘇氨酸生物合成基因引入已將蘇氨酸降解阻抑的埃希氏菌屬的細菌。已將蘇氨酸降解阻抑的埃希氏菌屬的細菌實例包括將蘇氨酸脫氫酶活性缺失的TDH6菌4朱(JapanesePatentApplicationPublicationNo.2001-346578)等等。某些L-蘇氨酸生物合成酶的活性受產生的L-蘇氨酸抑制。因此，為了構建產生L-蘇氨酸的細菌，優(yōu)選對L-蘇氨酸生物合成酶進行修飾以使所述酶不受到L-蘇氨酸的反饋抑制。上述thrA、thrB和thrC基因組成蘇氨酸操縱子，所述操縱子以弱化子(attenuator)結構的形式存在。蘇氨酸操縱子的表達受到培養(yǎng)中存在的異亮氨酸和蘇氨酸的抑制，并且使表達減弱?？赏ㄟ^去除弱化區(qū)中的前導序列或弱化子來實現(xiàn)蘇氨酸操縱子的這種修飾(WO02/26993;BiotechnologyLettersVol.24，No.21，November2002;WO2005/049808)。98/04715)?；蛘撸蓸嫿ㄌK氨酸操縱子而使蘇氨酸生物合成中涉及的基因的表達受到X噬菌體的阻抑物和啟動子的調控(EP0593792)。同樣，為了防止L-蘇氨酸的反饋抑制，對埃希氏菌屬細菌的修飾也可通過選擇a-氨基-(3-羥基戊酸(AHV)抗性的細菌菌一朱來獲得(JP45026708B)。經修飾以防止L-蘇氨酸的反饋抑制的蘇氨酸操縱子優(yōu)選在宿主中具有增加的拷貝數(shù)或連接至強啟動子。除了使用質粒擴增所述基因的拷貝數(shù)，還可通過使用轉座子、Mu噬菌體等在染色體上引入蘇氨酸操縱子來增加基因的拷貝數(shù)。對于天冬氨酸激酶III基因(lysC)，期望的是使用經修飾的基因以防止L-賴氨酸的這種反饋抑制。能夠使用在美國專利No.5,932,453中描述的方法獲得經修飾以防止反饋抑制的lysC基因。除了L-蘇氨酸生物合成酶，期萬的是將糖酵解系統(tǒng)、TCA循環(huán)和呼吸鏈中涉及的基因、調控基因表達的基因和誘導糖攝取的基因增強。在L-蘇氨酸產生中有效的這些基因的實例包括轉氫酶基因(pntAB)(EP733712)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)(WO95/06114)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps)(EP877090)、棒狀桿菌型細菌或芽孢桿菌屬(Bacillus)細菌中的丙酮酸羧化酶基因(W099A8228、EP1092776)。還優(yōu)選增強賦予對L-蘇氨酸的抗性的基因和賦予對L-高絲氨酸的抗性的基因的表達，或賦予宿主L-蘇氨酸抗性和L-高絲氨酸抗性。這些基因的實例是rhtA基因(ResMicrobiol.2003Mar;154(2):123-35)、rhtB基因(EP0994190)、rhtC基因(EP1013765)和yfiK、yeaS基因(EP1016710)。對于賦予宿主L-蘇氨酸抗性，參考EuropeanPatentApplicationPublicationNo.0994190、WO術04636。產生L-蘇氨酸的細菌另外的實例是大腸桿菌VKPMB-3996菌抹(美國專利No.5,175,107)。這種VKPMB-3996菌株在1987年11月19日以登錄號VKPMB-3996保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(theRussianNationalCollectionoflndustrialMicroorganisms)(VKPM)，GNIIGenetika?！坟跋Σ?，VKPMB-3996菌4朱保留質粒pVIC40(WO90/04636),所述質粒pVIC40通過將蘇氨酸生物合成基因(蘇氨酸操縱子thrABC)插入包含鏈霉素抗性標記的廣宿主(wide-host)載體質粒pAY32中而獲得(Chistorerdov，A.Y.,Tsygankov，Y.D.，Plasmid，1986，16，161-167)。在這種pVIC40中，已將L-蘇氨酸對蘇氨酸操縱子中thrA編碼的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I的反饋抑制脫敏。進一步的實例是大腸桿菌B-5318菌林(參見EuropeanPatentNo.0593792)。B-5318菌林在1990年5月3日以登錄號VKPMB-5318保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM),GNIIGenetika(Russia,117545Moscow,1DorozhnyProezd，1)。這種VKPMB-5318菌抹是異亮氨酸非營養(yǎng)缺陷型菌林，并且保留重組質粒DNA，將所述重組質粒DNA構建成使蘇氨酸生物合成中涉及的基因，即將弱化子區(qū)和天然轉錄調節(jié)區(qū)缺失的蘇氨酸操縱子位于X噬菌體溫度每文感CI阻抑物、PR啟動子和X噬菌體的Cro蛋白N末端的下游，并且蘇氨酸生物合成中涉及的所述基因的表達由所述X噬菌體阻抑物和啟動子調控。在本發(fā)明中使用的優(yōu)選的L-組氨酸的實例包括大腸桿菌FERMP-5038和5048菌林，其含有的載體中并入了L-組氨酸生物合成中涉及的基因信息(JP56-005099A);引入了氨基酸輸出基因Rht的細菌菌林(EP1016710);對磺胺胍(sulfaguanidine)、D,L-l,2，4-三唑-3-丙氨酸和鏈霉素具有抗性的大腸桿菌80菌抹(VKPMB-7270,RussianPatentPublicationNo.2U9536)等。可使用表達L-組氨酸生物合成途徑酶的編碼基因的微生物來產生L-組氨酸。L-組氨酸生物合成酶的實例是ATP磷酸核糖轉移酶(hisG)、磷S吏核糖AMP環(huán)化水解酶(hisl)、磷酸核糖-ATP焦磷酸水解酶(hisIE)、磷酸核糖亞胺曱基-5-氨基。米哇氨曱酰核普酸異構酶(phosphoribosylformimino-5-aminoimidazolecarboxamideribotideisomerase)(hisA)、酰胺轉移酶(hisH)、磷酸組氨醇氨基轉移酶基因(hisC)、組氨醇磷酸酶基因(hisB)和組氨醇脫氫酶基因(hisD)等。優(yōu)選的本發(fā)明產生L-半胱氨酸的細菌是將胱硫醚P-裂合酶活性減少的細菌(JP2003-169668)，和保留絲氨酸乙酰轉移酶的埃希氏菌屬細菌，所述絲氨酸乙酰轉移酶具有減少的L-半胱氨^饋抑制(JP11-155571)。優(yōu)選的本發(fā)明產生L-脯氨酸的細菌包括大腸桿菌702(VKPMB-8011)，其對3,4-脫輕基脯氨酸和氮雜環(huán)丁烷-2-羧酸(azetidine-2-carboxylate)有抗性，和702ilvA(VKPMB-8012菌才朱)，其缺乏ilvA并且源自702(JP2002-300874A)。產生L-苯丙氨酸的細菌的實例包括具有tyrA、tyrR缺陷的AJ12739(tyrA::Tn10,tyrR)(VKPMB-8197),和具有擴增的編碼苯丙氨酸輸出蛋白的基因例如yddG和yedA的菌抹。產生L-精氨酸的細菌的實例包括對a-曱基曱硫氨酸、p-氟苯丙氨酸、D-精氨酸、精氨酸氧肟酸、S-(2-氨乙基)-半胱氨酸、a-曱基絲氨酸(a-methyleserine)、|3-2-謹:吩丙氨酸或石黃胺胍有抗性的大腸桿菌突變菌才朱(JP56-106598)等。大腸桿菌237菌林是產生L-精氨酸的細菌，所述細菌具有對L-精氨酸的反饋抑制有抗性的突變體并且保留高活性的N-乙酰谷氨酸合酶，并且其也是優(yōu)選的產生L-精氨酸^J菌林(EP1170361B)。所述編號為VKPMB-7925的菌林在2000年4月10日保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)，GNIIGenetika，并且根據(jù)布達佩斯條約在2001年5月18日轉化成國際保藏。也可以使用大腸桿菌382菌抹，其是237菌林的衍生物并且是產生L-精氨酸的細菌，所述細菌具有改進的乙酸同化能力(US6,841，365)。編號為VKPMB-7926的大腸桿菌382菌抹在2000年4月10日保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)。同樣，作為具有產生L-精氨酸能力的微生物，可以使用具有改進的基因表達的微生物，所述基因編碼L-精氨酸生物合成中涉及的酶。L-精氨酸生物合成酶的實例包括N-乙酰谷氨酸合酶(argA)、N-乙酰-谷氨酰-磷酸還原酶(argC)、鳥氨酸乙酰轉移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鳥氨酸氨基轉移酶(argD)、乙酰鳥氨酸脫乙酰酶(argE)、鳥氨S吏氨曱酰轉移酶(argF)、精氨琥珀酸合酶(argG)、精氨琥珀酸裂合酶(argH)和氨曱酰磷酸合酶(carAB),和它們的組合。在每種酶名稱之后，在圓括號內提供編碼該酶的基因的名稱。期望的是使用N-乙酰谷氨酸合酶基因(argA)的突變，其中通過取代對應于野生型中位置15-19的氨基酸序列將L-精氨酸反饋抑制去除(EPEP1170361)?？梢允褂玫漠a生L-亮氨酸的細菌包括大腸桿菌屬的細菌，在所述細菌中將由ilvE基因編碼的支鏈氨基酸氨基轉移酶失活，并且將由tyrB基因編碼的芳族氨基酸氨基轉移酶的活性增強(EP1375655A);大腸桿菌H-9068菌林(ATCC21530)，所述菌林對4-氮亮氨酸或5，5,5-三氟亮氨酸有抗性；大腸桿菌H-9070菌林(FERMBP-4704);大腸桿菌H-9072菌抹(FERMBP-4706)(美國專利No.5,744,331);大腸桿菌菌林，在所述菌抹中將L-亮氨酸對異丙基蘋果酸合酶的反饋抑制脫敏(EuropeanPatentNo.1067191);大腸桿菌AJ11478菌抹，所述菌抹對(3-2噻吩丙氨酸和P-羥、亮氨酸有抗性(美國專利No.5,763,231),等等。產生L-異亮氨酸的細菌包括6-二曱基氨基噪呤抗性的大腸桿菌突變菌林(JP5-304969A)、L-異亮氨酸氧將酸抗性的大腸桿菌突變菌林(JP5-130882A)、硫代異亮氨酸抗性的(thiaisoleucine-resistant)大腸桿菌突變菌林(JP5-130882A)、DL-乙基硫氨酸抗性的大腸桿菌突變菌抹(JP5-130882A)和精氨酸氧肟酸抗性的突變菌抹(JP5-130882A)，所述全部菌株均具有產生L-異亮氨酸的能力。埃希氏菌屬的重組細菌的實例是以下細菌菌林，在所述菌抹中將編碼L-異亮氨酸生物合成酶蘇氨酸脫氨基酶或乙酰羥酸合酶的基因的表達增加(JP2-458A,JP2-42988A，JP8-47397A),等等。用于衍生本發(fā)明產生L-纈氨酸的細菌的親本菌林的實例包括但不限于，經修飾而過量表達ilvGMEDA操縱手的菌抹(美國專利No.5,998,178)。期望的是將ilvGMEDA操縱子中弱化所需的區(qū)去除，從而使所述操縱子的表達不被L-纈氨酸弱化。此外，期望地將操縱子中的ilvA基因破壞，以使蘇氨酸脫氨基酶活性減少。用于衍生本發(fā)明產生L-纈氨酸的細菌的親本菌抹的實例包括在氨基-?；鵷-RNA合成酶中具有突變的突變體(美國專利No.5,658,766)。例如，可以使用大腸桿菌VL1970，其在編碼異亮氨酸t(yī)RNA合成酶的ileS基因中具有突變。大腸桿菌VL1970已經在1988年6月24日以登錄號VKPMB-4411保藏在俄羅斯國立工業(yè)孩i生物保藏中心(VKPM)(Russia,113545Moscow,1DorozhnyProezd，1)。此外，生長需要硫辛酸(lipoic&(^)和/或缺乏11+-八丁？酶的突變體也可用作親本菌4朱(W096/06926)。在本發(fā)明中使用的產生L-氨基酸的細菌中，除編碼天然生物合成酶的基因之外，可將糖攝取、糖代謝(糖酵解系統(tǒng))和能量代謝中涉及的基因增強。糖代謝中涉及的基因的實例是編碼攝取糖的糖酵解酶或蛋白的基因，例如編碼葡糖-6-磷酸異構酶的基因(pgi;W001/02542)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps)、磷酸葡糖變位酶基因(pgm;WO03/04598)、果糖二磷酸醛縮酶基因(fba;WO03/04664)、丙酮酸激酶基因(pykF;WO03/008609)、轉醛醇酶(transaldolase)基因(ta舊；WO03/008611)、延胡索酸酶基因(fbm;WOO1/02545)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps;EP877090)、非-PTS蔗糖攝取系統(tǒng)基因(csc;EP149911)和蔗糖同化基因(scrAB操縱子；WO90/04636)。能量代謝中涉及的基因的實例包括轉氫酶基因(pntAB;美國專利No.5，830，716)和細胞色素bo型氧化酶基因(cyoABCD;EP1070376)。<1-2>用于增加p-糖苷PTS的活性的方法能夠通過修飾如上所述具有產生L-氨基酸的能力并且屬于腸桿菌科的微生物，以增加p-糖苦PTS的酶活性從而獲得本發(fā)明的微生物。然而，可以在增加p-糖苦PTS的酶活性的修飾之后賦予產生L-氨基酸的能力。能夠通過修飾編碼p-糖苷PTS的bglF基因的表達來實現(xiàn)P-糖苦PTS的酶活性的增加(稍后描述)。這可以是通過修飾表達調節(jié)區(qū)(包括啟動子修飾)使內源bglF基因表達增加；或這可以是通過引入含有bglF基因的質粒，通過擴增染色體上的bglF基因來增加拷貝數(shù)等使外源bglF基因表達增加。另外，可以采用這些技術的組合。本發(fā)明中的(3-糖苷PTS指將糖攝取至細胞質中，同時將磷酸烯醇丙酮酸(此后稱為PEP)中的磷S吏基團轉移至P-糖苷的通透酶活性。在本文中，P-糖苷是以(3-D-葡萄糖作為糖組分的糖苷，例如，與水楊醇糖苷連接(glucoside-linked)的水楊苦，或糖苷連接至氫醌(hydroquinone)的熊果苷(arbutin),并且通常意指糖衍生物，在所述糖書f生物中多種化合物例如醇、酚、花色素苷(anthocyanin)等連接至(3-D-葡萄糖的還原基團。本發(fā)明的P-糖苷PTS還可發(fā)揮轉移磷酸基團的功能，不僅是轉移至P-糖苷，還同時轉移至葡萄糖。(E.coli&Salmonella2ndEditionAmericansocietyforMicrobiology)。能夠通過使用Chen等的方法體外測試磷酸化活性來確認卩-糖苷PTS的酶活性的增力口(Biochemistry199837:8714-8723)(EC2.7.1.69)。當與親本菌才朱例如野生菌抹或未經修飾的菌林比較時，也能夠通過與所述野生型或未經修飾的菌4朱比較bglF的mRNA量來確認bglF表達的增強。Northern雜交和RT-PCR也可用來確認表達(MoleculafCloning(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor(USA)，2001))。只要活性與野生型或未經修^飾的菌抹相比增加，對酶活性的增加程度不進行限制，但是期望的是，例如是野生或未經修飾的菌抹的1.5或更多倍，優(yōu)選2或更多倍，或更優(yōu)選3或更多倍。如果靶蛋白量相對于未經修飾的或野生型菌株增加，則能夠確認酶活性的增加。這能夠通過例如使用抗體的Western印跡來檢測(MolecularCloning(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdspringHarbor(USA)，2001》。本發(fā)明的bglF基因是埃希氏菌屬細菌的bglF基因和它們的同源物。例如，大腸桿菌的bglF基因編碼具有SEQIDNo.6的氨基酸序列的蛋白質。所述基因登記為GenbankNP_418178，而W3110的序列登記為GenbankPTV3B—ECOLI[P08722],二者均與SEQIDNO.5相同。大腸桿菌的bglF基因在SEQIDN0.5中顯示，而氨基酉餅列示于SEQIDNO.6中。bglF基因的同源物包括源自其它微生物的，與大腸桿菌的bglF基因在結構上具有高相似性的，當引入宿主時改進產生L-氨基酸的能力并且顯示(3-糖苷PTS活性的那些。bglF同源物的實例是來自胡蘿卜軟腐歐文氏菌(五nWm'acaratovora)的bglF基因(GenbankAccessionNo.YP—050260)、來自無乳鏈球菌(&w;tococc^aga/ac"ae)的bglF基因(NP—735260)和來自發(fā)光光桿菌亞種(尸/2otor/2aZ^w/ww/"&sceraswZwp.)的bglF基因(NP一927931)。另外，基于與以上實例中提供的基因的同源性，可以從以下細菌中克隆bglF基因棒狀桿菌型細菌組(coryneformgroupofbacteria),例如谷氨酸棒桿菌、乳發(fā)酵短桿菌(Srev/6acten^w/"c/q/^/7we"&w)等；j叚單月包菌屬的細菌(/^ewdowoway)，例如銅纟錄有支單月包菌(戶sewcfowo"osaerwg/"c^a)等；分才支才干菌屬(AfycoZ"cfen'w附)的細菌，例3口結斗亥分^支4干菌(Afyco6acfen-wwrt^)ercw/os&)等；等等。例^口，可以4吏用合成的寡核苷酸SEQIDNos.1和2來束隆bglF基因。本發(fā)明中使用的編碼P-糖苷PTS的基因不限于野生型基因，只要編碼的卩-糖苷PTS蛋白的功能(即，p-糖苷PTS活性)不受損。它們也可以是編碼蛋白質的突變體或人工修飾的產物，所述蛋白質包含在SEQIDNo.6的氨基酸序列中的一個或多個位置含有幾個氛基酸取代、缺失、插入、添加等的序列。在本文中，術語"幾個"才艮據(jù)蛋白質立體結構中氨基酸殘基的位置和類型而變化。具體地，幾個的意思是1-20，優(yōu)選地1-10，并且更優(yōu)選地1-5。以上一個或幾個氨基酸的取代、缺失、插入或添加是保持P-糖苷PTS活性的保守突變。在保守突變中，如果取代位置是芳族氛基酸，則取代相互發(fā)生在Phe、Trp、Tyr之間；如果取代位置是疏水氨基酸，則在Leu、Ile、Val之間；如果是極性氨基酸，則在Gln、Asn之間'；如果是堿性氨基酸，則在Lys、Arg、His之間；如果是酸性氨基酸，則在Asp、Glu之間；并且如果是具有羥基的氨基酸，則在Ser、Thr之間。常規(guī)的保守突變是保守取代。優(yōu)選的保守取代包括用Ser或Thr取代Ala;用Gln、His或Lys取代Arg;用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn;用Asn、Glu或Gin取代Asp;用Ser或Ala取代Cys;用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gin;用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu;用Pro取代Gly;用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His;用Leu、Met、Val或Phe取代Ile;用Ile、Met、Val或Phe取代Leu;用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys;用Ile、Leu、Val或Phe取代Met;用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe;用Thr或Ala取代Ser;用Ser或Ala取代Thr;用Phe或Tyr取代Trp;用His、Phe或Trp取代Tyr;和用Met、Ile或Leu取代Val。上述氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等包括依賴于保留bglF基因的微生物的種間差異或個體差異而天然存在的那些(突變體或變體)。能夠通過如下方法獲得這些基因使用例如位點特異性突變方法來修飾SEQIDNo.5中顯示的核苷酸序列，從而使編碼的蛋白質中位點特異性的氨基酸殘基包含耳又代、缺失、插入或添加。此外，作為bglF基因，同源物可與SEQNo.6的氨基酸序列具有80%或以上，優(yōu)選90%或以上，更優(yōu)選95%或以上，甚至更優(yōu)選97%或以上的同源性。由于基因的簡并密碼性質根據(jù)引入所述基因的宿主變化，用宿主更容易使用的密碼子取代的基因是期望的。同樣，只要bglF基因具有(carry)P-糖苷PTS的功能，可以將所述基因的N末端或C末端延伸或去除。例如，延伸或去除的長度可以是50或更少，優(yōu)選20或更少，更優(yōu)選10或更少，并且甚至更優(yōu)選5或更少的氨基酸殘基。更具體地，可以使用編碼以下蛋白質的基因，所述蛋白質具有從N末端延伸或去除50-5個氨基酸的SEQIDNo.6,從C末端延伸或去除50-5個氨基酸的SEQIDNo.6。同樣，能夠通過以下常規(guī)突變處理獲得基因的變體。突變處理方法之一是使用羥胺等，體外突變具有如SEQIDNo.5的核苷酸序列中所示核苷^列的基因。另一種方法使用紫外線或突變處理中通常使用的突變劑例如N-曱基-N，-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或曱磺酸乙酯(EMS)來處理具有所述基因的微生物，例如，埃希氏菌屬的細菌。這些基因是否編碼具有p-糖普PTS活性的蛋白質能夠通過如下方法確認例如在適當?shù)募毎斜磉_這些基因，并且研究攝取(3-糖苷的能力是否增加，或釆用Chen等的方法研究體外磷酸化活性(Biochemistry199837:8714-8723)。bglF基因還可以是在嚴緊條件下與SEQIDNo.5中核苷酸序列的互補核香酸序列或與從這些序列制備的探針雜交的DNA。在本文中，術語"嚴緊條件"指形成所謂的特異性雜合體(hybrid)，并且不形成非特異性雜合體的條件。盡管難以以數(shù)字清楚地表述這些條件，但是可將這些條件例舉為如下條件在該條件下高度同源的DNA片^a,例如，具有不少于80%、90%或95%同源性的DNA相互雜交，并且具有低于以上同源性的DNA不相互雜交。或者，嚴緊條件的示例是Southern雜交洗滌條件中的常規(guī)條件，所述條件為在相應于60。C、1xSSC、0.1%SDS,優(yōu)選0.1xSSC、0.1%SDS，并且更優(yōu)選68。C、0.1xSSC、0.1%SDS的溫度和鹽濃度，洗滌一次或優(yōu)選2-3次。含有SEQIDNo.5的核苷酸序列或部分所迷序列的DNA也可用作〗笨針。這種探針可以使用PCR制備，其中將含有SEQIDNo.5的核苷酸序列的DNA片段用作模板，并且將基于SEQIDNo.5的核苷酸序列制備的寡核苷酸用作引物。例如，當使用大約300bp長的DNA片段作為探針時，雜交洗滌條件是50。C、2xSSC和0.1。/。SDS。能夠通過使用例如增加細胞中上述bglF基因拷貝數(shù)的遺傳重組技術來進行增強bglF基因表達的修飾。例如，將含有bglF基因的DNA片段與在宿主微生物中發(fā)揮功能的載體(優(yōu)選多拷貝型載體)連接，以制備重組DNA，其后將所述重組DNA引入該微生物以將其轉化。當使用大腸桿菌的bglF基因時，能夠使用PCR(PCR:聚合酶鏈式反應；參見White,T丄etal.，TrendsGenet.5，185(1989))來獲得所述bglF基因，在所述PCR中大腸桿菌的染色體DNA是模板，并且基于SEQIDNo.5的核香酸序列制備引物，例如，SEQIDNos.1和2中所示的引物。使用基于BglF蛋白質的序列信息制備引物的PCR方法，或使用基于上述序列信息制備探針的雜交方法，也可從那些微生物中已知的bglF基因或其它種微生物中的bglF基因，或從微生物的染色體DNA或染色體DNA文庫獲得屬于腸桿菌科的其它微生物的bglF基因。另外，染色體DNA可從DNA供體微生物制備。例如，可以4吏用Saito禾口Miura的方法等(H.SaitoandK.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72,619(1963),SeibutsuKogakuJikkenshoeditedbyTheSocietyofBiotechnology,Japan,pp.97-98,Baiftikan，1992)。其后，通過將通過PCR方法擴增的bglF基因與能夠在宿主微生物的細胞中發(fā)揮功能的載體DNA連接來制備重組DNA。能夠在宿主微生物的細胞中發(fā)揮功能的載體是在所述宿主微生物的細胞中可自主復制的載體。在大腸桿菌的細胞中可自主復制的載體的實例包括pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184(pHSG和pACYC可從TakaraBioInc.獲得)、RSF1010、pBR322、pMW219(pMW可從NipponGeneCo"Ltd.獲得)、pSTV29(可從TakaraBioInc.獲得)等?？蓪⑷缟纤鲋苽涞闹亟MDNA依照迄今已經報導的任何轉化方法引入-徵生物。例如，一種方法是通過用氯化釣處理受體細菌來增加DNA的透過性，如關于大腸桿菌K-12所報導的(Mandel,M.andHiga,A"J.Mol.Biol.,53，159(1970))。另一種方法是在從生長期的細胞制備感受態(tài)細胞之后引入DNA,如關于枯草芽孢桿菌(5a"7/wswto'to)所報導的(Duncan,CH.，Wilson,G.A.andYoung,F.E.，Gene,1，153(1977))。同樣，另一種方法是當已知宿主孩i生物涉及枯草芽孢桿菌、放線菌類和酵母時，將其改變?yōu)槟軌蛉菀椎財z取重組DNA的原生質體或原生質球狀態(tài)，隨后將所述重組DNA引入該DNA受體細菌中(Chang,S.andChoen,S.N.,Molec.Gen.Genet"168,111(1979);Bibb，M.J.,Ward,J.M.andHopwood,O.A.，Nature,274，398(1978);Hinnen,A.，Hicks,J.B.andFink,G.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.l)SA,751929(1978))。能夠通過將如上所述的bglF基因的多拷貝引入微生物的染色體DNA中來增加bglF基因的拷貝數(shù)。使用以多拷貝存在于所述染色體DNA上的序列作為靶，通過同源重組將bglF基因的多拷貝引入微生物的染色體DNA?？梢允褂弥貜虳NA和存在于可轉座元件末端的反向重復序列作為所述以多拷貝存在于染色體DNA上的序列。同樣，可以將這些基因與存在于染色體上的bglF基因串聯(lián)連接，或可以將這些基因通過在染色體上的非必需基因上的復制(duplication)來并入?？梢允褂脺囟让舾休d體或整合載體來引入這些基因。如JP2-109985A所披露，可以將bglF基因并入轉座子，再將所述轉座子轉移以將多拷貝并入染色體DNA。所述基因是否已經轉移至染色體上能夠通過使用部分bglF基因作為探針進行Southern雜交來確認。除了上述的增加拷貝數(shù)，bglF基因的表達還可通過使用WO00/18935中描述的方法來增強，例如將染色體DNA或質粒上的bglF基因啟動子等表達調節(jié)序列用更強的取代，使-35、-IO區(qū)接近共有序列，擴增能夠增強bglF基因表達的調節(jié)基因，和缺失或減弱將減少bglF基因表達的調節(jié)基因。例如，lac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、tac啟動子、araBA啟動子、X噬菌體PR啟動子、PL啟動子、tet啟動子、T7啟動子、cpl0啟動子等是^^知的強啟動子。還可將堿基取代等引入bglF基因的啟動子區(qū)和SD區(qū)以實現(xiàn)更強的啟動子強度。用于評估啟動子強度的方法的實例和強啟動子的實例在Goldstein等的文章(Prokaryoticpromotersinbiotechnology.Biotechnol.Annu.Rev"1995，1,105-128)等中描述。另外，已知在核糖體結合位點(RBS)和起始密碼子之間的間隔區(qū)中取代幾個核苷酸，特別在起始密碼子的緊鄰上游的序列中取代幾個核苷酸，對mRNA翻i奪效率具有強烈影響?？蓪@些進行》務飾?？赏ㄟ^啟動子搜索載體和基因分析軟件如GENETYX等確定bglF基因的啟動子等表達調節(jié)區(qū)。能夠通過取代或修飾這些啟動子來增強bglF基因的表達。能夠例如通過使用溫度敏感質?；騌ed-驅動整合方法來進行表達調節(jié)序列的取代(WO2005/010175)。為了增加由bglF基因編碼的蛋白質的活性，也可以將增加(3-糖苷PTS活性的突變引入bglF基因。增加由bglF基因編碼蛋白質的活性的突變實例包括增加bglF基因轉錄的啟動子序列中的突變，和增加BglF蛋白比活性的所述基因編碼區(qū)內的突變?！?〉產生L-氨基酸的方法本發(fā)明的用于產生L-氨基酸的方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物，在所述培養(yǎng)基或微生物中產生和積累L-氨基酸，和從所述培養(yǎng)基或微生物中收集L-氨基酸。在使用微生物的L-氨基酸的發(fā)酵和產生中通常使用的培養(yǎng)基可用于本發(fā)明。即，可以使用含有碳源、氮源、非有機離子和所需的其它有機組分的普通培養(yǎng)基。碳源包括糖，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉水解物等；醇，例如甘油、山梨糖醇(solbitol)等；有機酸，例如延胡索酸、檸檬酸、琥珀酸等。在這些中，優(yōu)選使用葡萄糖作為碳源。氮源包括無機銨鹽，例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨等；有機氮，例如大豆水解產物等；氨氣；氨水等。期望的是有機微量營養(yǎng)物源含有適當量的營養(yǎng)缺陷物質(auxotrophicsubstance),例如維生素B1、L-高絲氨酸等，或酵母提取物等。除這些之外，根據(jù)需要，可以添加小量的磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基可以是天然的或合成的培養(yǎng)基，只要其含有碳源、氮源、無機離子和需要的其它有機微量營養(yǎng)物。建議將培養(yǎng)在需氧條件下，在24。C-37。C的培養(yǎng)溫度進行l(wèi)-7天，培養(yǎng)期間的pH為5-9?？梢允褂脽o機或有機酸或堿物質和氨氣等來調節(jié)pH。使用常規(guī)離子交換樹脂方法、沉淀方法和其它已知方法的組合可從發(fā)酵液中收集L-氨基酸。如果L-氨基酸積累在微生物的細胞內，可通過超聲等將細胞破碎，隨后通過離心分離去除以獲得上清，使用離子交換樹脂方法等可從所述上清中收集L-氨基酸。還可使用適合于以沉淀產生L-谷氨酸的液體培養(yǎng)基，并且進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)的同時將L-谷氨酸產生在培養(yǎng)基中。用于產生L-谷氨酸的條件包括，例如，pH為5.0-4.0，優(yōu)選pH為4.5-4.0，更優(yōu)選pH為4.3-4.0，并且甚至更優(yōu)選pH為4.0。在培養(yǎng)完成之后，可以使用任何已知的回收方法,人培養(yǎng)液中收集L-谷氨酸。例如，可以在將細胞從培養(yǎng)液中去除之后使用濃縮結晶法收集L-谷氨酸，或通過離子交換層析等收集L-谷氨酸。當在產生L-谷氨酸的條件下進行培養(yǎng)時，也可通過離心分離、過濾等收集沉淀在培養(yǎng)液中的L-谷氨酸。在這種情況下，可以將溶解在培養(yǎng)液中的L-谷氨酸結晶之后再分離。此外，可以通過以下分離方法制備以本發(fā)明產生的發(fā)酵液為基礎的動物飼料添加劑。可以使用L-氨基酸分離方法例如離心、過濾、傾析、絮凝或這些的組合來去除或減少生物質?？梢允褂靡阎椒ɡ缧D蒸發(fā)器、薄層蒸發(fā)器、反滲透或納米過濾(FR8613346B、US4，997,754、EP410005B，JP1073646B)來濃縮由本發(fā)明獲得的培養(yǎng)液。'隨后J吏用冷凍干燥、噴霧干燥、噴霧制粒(spraygranulation),或產生作為動物飼料添加劑使用的優(yōu)選為自由流動、細碎的粉末的任何其它過程的方法處理濃縮的培養(yǎng)液。通過使用合適的壓實或制粒方法，可將這種自由流動的細碎粉末轉變成粗粒的、流動非常自由的、穩(wěn)定并且基本上無塵的產品?？偠灾?，以這種方法將多于90%的水去除，以使動物祠料添加劑中的水濃度按重量計少于10%,優(yōu)選少于5°/0。所述飼料添加劑中的蛋白質含量按重量計可少于10%,優(yōu)選少于5%,并且L-蘇氨酸的濃度可多于50%,優(yōu)選多于85%，更優(yōu)選多于95%(US5，431,933、JP1214636B、US4，956，471、US4，777，051、US4946654、US5，840358、US6,238,714、US2005艦5878)。上述分離步驟不必一定進行，而是可以按照在技術上有利的方式組合。實施例參考實施例l:構建產生L-賴氨酸的細菌<1-1>構建破壞了編碼賴氨酸脫羧酶的cadA和ldcC基因的菌才朱首先，構建不產生賴氨酸脫羧酶的菌林。使用WOWO2005/010175中描述的Red-驅動整合方法和X噬菌體切除系統(tǒng)(J.Bacteriol.2002Sep;184(18):5200-3.InteractionsbetweenintegraseandexcisionaseinthephageXexcisivenucleoproteincomplex.ChoEH，GumportRI,GardnerJF)來構建將賴氛酸脫疑酶基因破壞的菌抹。賴氨酸脫羧酶由cadA基因(GenbankAccessionNo.NP—418555.SEQIDNo.42)和ldcC基因(GenbankAccessionNo.NP—414728.SEQIDNo.44)編碼(W096/17930)。將WC196菌抹用作親本菌抹。將WC196菌才朱命名為大腸桿菌AJ13069,并且在1994年12月6日以登錄號FERMP-14690保藏在工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所(目前為，獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所特許微生物保藏中心；Chuo6,1-1,Higashil-chome，Tsukuba-shi,Ibaraki-ken305-8566，Japan)),并且根據(jù)布達佩斯條約在1995年9月29日轉為國際保藏，并給予登錄號FERMBP-5252。使用最初由Datsenko和Wanner開發(fā)的稱為"Red-驅動整合"的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000，vol.97,No.12，pp.6640-6645)和X噬菌體切除系統(tǒng)(J.Bacteriol.2002Sep;184(18):5200-3)，將編碼賴氨酸脫羧酶的cadA和ldcC基因缺失。根據(jù)"Red-driven整合"方法，通過使用以源自靶基因的5，末端和抗生素抗性基因的3'末端的合成寡核苷酸引物獲得的PCR產物，可以在單一的步驟中構建基因破壞的菌抹。另外，通過X噬菌體切除，可將整合在染色體中的抗生素抗性基因從菌林中去除。(l)破壞cadA基因將下文描述的pMW118-attL-Cm-attR質粒用作PCR才莫板。通過將X噬菌體的attL和attR附著位點和抗生素抗性基因cat基因以attL-cat-attR的順序插入pMW118(TakaraBioInc.)來獲得pMW118-attL-Cm-attR(參見WO2005/010175)。attL序列示于SEQIDNo.11,而且attR序列示于SEQIDNo.12。使用SEQIDNos.46和47中所示合成寡核苷酸作為引物進行PCR，其中相應于attL和attR兩個末端的序列位于所述引物的3'端，并且相應于靶基因cadA基因的一部分的序列位于所述引物的5，端。用瓊脂糖凝膠純化擴增的PCR產物，其后通過電穿孔引入含有質粒pKD46的大腸桿菌WC196菌抹，所述質粒具有溫度敏感復制能力。質粒pKD46(Proc,Natl.Acad.Sci.USA,2000，vol.97，No.12,pp.6640-6645)包含X噬菌體DNA片段(2154堿基)，并且其包含編碼XRed同源重組系統(tǒng)中Red重組酶的基因(Y、卩和exo)，所述基因受阿拉伯糖誘導的ParaB啟動子調控(GenBank/EMBLAccessionNo.J02459,31088th—33241st)。如下制備用于電穿孔的感受態(tài)細胞。將在含有100mg/L氨千青霉素的LB培養(yǎng)基中在30°C培養(yǎng)過夜的大腸桿菌WC196菌4朱在含有氨芐青霉素(20mg/L)和L-阿拉伯糖(lmM)的5mLSOB培養(yǎng)基中稀釋100倍(MolecularCloning:LabManual2ndedition,Sambrook,J.，etal"ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))。將稀釋產物在30°C培養(yǎng)直到OD600增長至大約0.6,之后將其濃縮100倍并用10%甘油洗滌三次準備電穿孔。使用70pl感受態(tài)細胞和大約100ngPCR產物進行電穿孔。添加1mLSOC培養(yǎng)基(MolecularCloning:LabManual2ndedition,Sambrook,J.，etal.，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))并且在37°C培養(yǎng)2.5小時，其后在含有Cm(氯霉素)(25mg/L)L-瓊脂的平板培養(yǎng)基上在37°C培養(yǎng)，并且選擇Cm抗性的重組體。接下來，為了去除pKD46質粒，將細胞在含有Cm的L-瓊脂培養(yǎng)基上在42°C傳代培養(yǎng)兩次，檢測所得菌落的氨千青霉素抗性，并且獲得了無pKD46的氨千青霉素敏感性菌抹。使用PCR確認通過氯霉素抗性基因鑒定的突變體中cadA基因的缺失。將cadA缺陷型菌林命名為WC196AcadA::att-cat。其后，為了去除cadA基因中引入的att-cat基因，使用在下文描述的輔助質粒pMW-intxis-ts。pMW-intxis-ts含有編碼X噬菌體整合酶(Int)的基因(SEQIDNo.13)和編碼切除酶(Xis)的基因(SEQIDNo.15),并且具有溫度每文感復制能力。通過引入pMW-intxis-ts,識別染色體上的attL(SEQIDNo.1l)和attR(SEQIDNo.12),引起重組，并且將attL和attR之間的基因切除，只保留attL或attR序列在染色體上。使用常規(guī)方法制備如上所述獲得的WC196AcadA::att-cat菌抹的感受態(tài)細胞，并且用輔助質粒pMW-intxis-ts轉化，在含有50mg/L氨芐青霉素的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上在30。C培養(yǎng)，由此選擇氨爺青霉素抗性菌株。其后，為了去除pMW-intxis-ts質粒，將轉化體在L-瓊脂培養(yǎng)基上在42°C傳代培養(yǎng)，檢測所得菌落的氨爺青霉素抗性和氯霉素抗性，并且獲得了將att-cat和pMW-intxis-ts去除的氯霉素和氨節(jié)青霉素敏感性菌林。將這種菌株命名為WC196AcadA。(2)在WC196AcadA菌林中缺失ldcC基因按照上文描述的技術，使用具有SEQIDNos.48和49的序列的引物作為ldcC破壞引物將WC196AcadA菌林中的ldcC基因缺失。由此產生將cadA和ldcC兩者都破壞的WC196AcadAAldcC。(3)制備PCR沖莫板和輔助質粒如下制備PCR模板pMWl18-attL-Cm-attR和輔助質粒pMW-intxis-ts。(3-1)pMWl18-attL-Cm-attR基于pMW118-attL-Cm-attR構建pMW118-attL-Tc-attR。制備以下四種DNA片段1)含有attL的BglII-EcoRIDNA片段(120bp)(SEQIDNo.11),其通過PCR擴增相應于大腸桿菌W3350菌抹(含有X原噬菌體的ATCC31278)染色體的序列而獲得，使用寡核苷酸P1和P2(SEQIDNos.17&18)作為引物(這些引物額外地含有BglII和EcoRI內切核酸酶的識別位點)，2)含有attR的PstI-HindIIIDNA片段(182bp)(SEQIDNo.12)，其通過PCR擴增相應于大腸桿菌W3350菌抹(含有人原噬菌體)染色體的序列而獲得，使用寡核苷酸P3和P4(SEQIDNos.19&20)作為引物(這些引物額外地含有Pstl和HindIII內切核酸酶的識別位點)，3)pMW118-ter—rrnB的BglII-HindIII大片#爻(3916bp):所述pMWl18-ter—rrnB通過連接以下三個片)爻獲得i)含有來自pMW118的AatII-EcoRIpol片段的大片段(2359bp),如下獲得用EcoRI限制性內切核酸酶消化pMW118,將其用DNA聚合酶I的Klenow片段處理，其后用AatII限制性內切核酸酶消化所述片段，ii)含有氨千青霉素抗性的(ApR)bla基因的pUC19的AatII-BglII小片段(1194bp)，如下獲得PCR擴增相應于pUC19質粒的序列，使用寡核苷酸P5和P6(SEQIDNos.21&22)作為引物(這些引物額外地含有AatII和BglII內切核酸酶的識別位點)，iii)含有轉錄終止子ter—rrnB的小BglII-PstIpol片段(363bp)，如下獲得PCR擴增相應于大腸桿菌MG1655菌抹的染色體的區(qū)域，使用寡核苷酸P7和P8(SEQIDNos.23&24)作為引物(這些引物額外地含有BglII和Pstl內切核酸酶的識別位點)，4)含有四環(huán)素抗性基因和轉錄終止子ter—thrL的pML-Tc-ter—thrL的小EcoRI-PstI片段(1388bp)(SEQIDNo、29)。如下獲得pML-Tc-ter—thrL。將pML誦MSC(MolBiol(Mosk).2005Sep-Oct;39(5):823-31;Biotechnologiya(Russian)No.5:3-20.))用Xbal和BamHI限制性內切核酸酶消化，并且將它的大片段(3342bp)與含有終止子ter—thrL的Xbal-Bamffl片段(68bp)連接。所述XbaI-BamHI片段(68bp)相應于大腸桿菌MG1655的染色體，并且通過PCR擴增獲得，使用寡核苷酸P9和P10(SEQIDNos.25&26)作為引物(這些引物額外地含有Xbal和Bamffl內切核酸酶的識別位點)。將連接反應產物命名為質粒pML-ter一thrL。將pML-ter—thrL用Kpnl和Xbal限制性內切核酸酶消化，用DNA聚合酶I的Klenow片段處理，其后與含有四環(huán)素抗性基因的pBR322的小EcoRI-Van91I片^爻(1317bp)連接(將用EcoRI和Van911限制性內切核酸酶消化的pBR322用DNA聚合酶I的Klenow片段處理)。將這種連接的產物命名為質粒pML-Tc-ter—thrL。'其后，通過連接大Bamffl-XbaI片段(4413bp)、PA2啟動子(T7噬菌體的原始啟動子)、氯霉素抗性的(CmR)cat基因、含有轉錄終止子ter_thrL的人工BglII-XbaIDNA片段(1162bp)和attR構建了pMW118-attL-Cm-attR。如下獲得所述人工DNA片段(SEQIDNo.30)。將pML-MSC(MolBiol(Mosk).2005Sep-Oct;39(5):823-31;Biotechnologiya(Russian)No.5:3-20.))用Kpnl和Xbal限制性內切4亥酸酶消化，并且與含有PA2啟動子(T7噬菌體的早期啟動子)的小Kpnl-Xbal片段(120bp)連接。Kpnl-Xbal片段通過擴增相應于T7噬菌體DNA的區(qū)域來獲得，使用寡核苷酸Pll和P12(SEQIDNos.27&28)作為引物(這些引物額外地含有Kpnl和Xbal內切核酸酶的識別位點)。將所述連接的產物命名為質粒pML畫PA2-MCS。將Xbal位點從pML-PA2-MCS去除。將產物命名為質粒pML畫PA2-MCS(Xbal畫)。將含有PA2啟動子(T7噬菌體的原始啟動子)和氯霉素抗性的(CmR)cat基因的pML-PA2-MCS(Xbal-)的小BglII-HindIII片段(928bp)與含有轉錄終止子ter一thrL和attR的pMWl18-attL-Tc-attR的小HindIII-HindIII片段(234bp)連接。使用寡核苷酸P9和P4(SEQIDNos.25&20)作為引物(這些引物含有HindIII和Xbal內切核酸酶的識別位點)，通過PCR擴增所述連4妄混合物獲得目標人工DNA片段(1156bp)。(3-2)pMW-intxis-ts首先，基于X噬菌體DNA(Fermentas)作為模板擴增了兩個DNA片段。第一片段由X噬菌體DNA基因組中的nt37168-38046區(qū)(SEQIDNo.39)組成，并且含有cl阻抑物、Prm和Pr啟動子，以及cro基因的前導序列。此片段通過擴增獲得，使用寡核苷酸Pl，和P2，(SEQIDNos.31&32)作為引物。第二片段由人噬菌體DNA基因組中的nt27801-29100區(qū)(SEQIDNo.40)組成，其含有來自X噬菌體DNA的xis-int基因。此片段通過PCR獲得，使用寡核苦酸P3，和P4，(SEQIDNos.33&34)作為引物。全部所述引物含有適當?shù)膬惹泻怂崦缸R別位點。第一PCR擴增片段含有cl阻抑物，將所述片段用Clal限制性內切核酸酶消化，其后用EcoRI限制性內切核酸酶消化。將第二PCR片段用EcoRI和Pstl內切核酸酶消化。將質粒pMWPlaclacI-ts用BglII內切核酸酶消化，用DNA聚合酶I的Klenow片段處理，其后用Pstl限制性內切核酸酶消化。從瓊脂糖凝膠中洗脫pMWPlaclacI-ts的載體片段，并且與切割的PCR擴增片段連接。質粒pMWPlaclacI-ts是pMWPlaclacI的衍生物，含有以下部分l)人工Bgin-HindIIIDNA片段，其含有PlacUV5啟動子和在噬菌體T7基因10的RBS控制下的lacl基因；2)含有氨卡青霉素抗性的(ApR)基因的AatII-BglII片段，其通過PCR擴增相應于pUC19質粒的區(qū)域來獲得，使用寡核苷酸P5，和P6，(SEQIDNos.35&36)作為引物(這些引物含有AatII和BglII內切核酸酶的識別位點)；3)AatII-HindIII片段，其含有重組質粒pMW118-ter—rrnB的AatII-PvuI片段。如下構建所述質粒pMW118-ter—rrnB。4吏用含有適當?shù)膬惹泻怂崦缸R別位點的寡核苷酸P7，和P8，(SEQIDNos.37&38)作為引物，通過PCR擴增相應于大腸桿菌MG1655菌抹中染色體的區(qū)來獲得含有終止子ter—rrnB的Pstl-Hindlll片段。在連接之前，將pMW118和ter—rrnB片段(SEQIDNo.41的互補鏈)分別用Pvul或Pstl消化，用DNA聚合酶I的Klenow片段處理以將末端平端化，其后用AatII或Hindlll內切核酸酶消化。在pMWPlaclacI-ts突變體的構建中，將質粒pMWPlaclacI的AatII-EcoRV片段用質粒pMAN997的AatII-EcoRV片段取代，所述AatII-EcoRV片段含有pSClOl復制子的par、ori和repAts基因(AppliedandEnvironmentalMicrobiology,June2005,p.3228-32)。實施例1:構建用于bglF過量表達的質粒已經測定大腸桿菌(大腸桿菌K-12菌抹)染色體的全基因組序列(Science,277,1453-1474(1997))?；赽glF基因的核苦酸序列，使用具有Hindlll位點的SEQIDNo.l的合成寡核苷酸作為5'引物，和具有Xbal位點的SEQIDNo.2的合成寡核苷酸作為3'引物，使用大腸桿菌MG1655菌林的染色體DNA作為^f莫板進行PCR。將所述PCR產物用限制性內切核酸酶Hindlll和Xbal處理，獲得了含有bglF基因的基因片段。將純化的PCR產物與已經用Hindlll和Xbal消化的載體pMW219(NipponGeneCo.,Ltd.)連接，以構建用于bglF過量表達的質粒pM-bglF。這種質粒受lac啟動子的調控，并且將bglF基因置于所述lac啟動子的下游。將pM-bglF用Hindlll和EcoRI消化，收集和純化bglF基因片段，并且連接至已經用Hindlll和EcoRI消化的載體pSTV29(TakaraShuzo)。以這種方法，構建了用于bglF過量表達的質粒pS-bglF。按照與上文所述bglF基因的相同方式，構建了用于表達ptsG基因的質粒作為對照。ptsG的序列示于SEQIDNo.7，并且將氨基酸的序列提供于SEQIDNo.8;ptsG序列可參考GenbankAccessionNo.NP—415619獲得。使用含有HindIII位點的SEQIDNo.3的合成寡核香酸作為5，引物，和含有Xbal位點的SEQIDNo.4的合成寡核苷酸作為3，引物，使用大腸桿菌MG1655菌林的染色體DNA作為模板進行PCR,再用限制性內切核酸酶HindIII和Xbal處理所述PCR片段，并且獲得了含有ptsG的基因片段。將純化的PCR產物與已經用HindIII和Xbal消化的載體pMW219連接，以構建用于ptsG過量表達的質粒pM-ptsG。這種質粒受lac啟動子的調控，并且將ptsG基因置于所述lac啟動子的下游。按照與bglF相同的方式，將ptsG基因片段從pM-ptsG中切除，并且連接至載體pSTV29。以這種方法，構建了用于ptsG過量表達的質粒pS-ptsG。實施例2:構建過量表達bglF基因的菌抹和評估所述菌抹的L-賴氨酸產生作為產生L-賴氨酸的大腸桿菌菌抹，將WC196AldcCAcadA(pCABD2)菌林用作親本菌林。將含有dapA、dapB和lysC基因的產生Lys的質粒pCABD2(WO01/53459)引入WC196AldcCAcadA菌抹。用實施例1中構建的bglF過量表達質粒pM-bglF和ptsG過量表達質粒pM-ptsG，和對照質粒pMW219轉化WC196AldcCAcadA(pCABD2)菌林，并且獲得了卡那霉素抗性菌株。在確認已將這些質粒引入后，將引入了bglF過量表達質粒pM-bglF的菌抹命名為WC196AldcCAcadA(pCABD2，pM-bglF);將引入了ptsG過量表達質粒pM-ptsG的菌抹命名為WC196AldcCAcadA(pCABD2，pM-ptsG);并且將S1入了對照質粒pMW219的菌抹命名為WC196AldcCAcadA(pCABD2，pMW219)。將如上所述構建的菌林在含有25mg/L卡那霉素的L培養(yǎng)基中在37°C培養(yǎng)至最終成為OD6000.6。其后，將等體積的40。/。甘油溶液添加至所述培養(yǎng)物并攪動，再吸取適量并且貯藏在-80°C。將其稱為甘油原種(glycerolstock)。在將這些菌林的甘油原種融化之后，將各100pL均勻地鋪在含有25mg/L卡那霉素的L平板上，并且將其在37°C培養(yǎng)24小時。將平板上大約1/8的細胞接種至500mLSakaguchi搖瓶中具有25mg/L卡那霉素的20mL發(fā)酵培養(yǎng)基(下文所示)中，并且使用往復搖動培養(yǎng)裝置在37°C培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)之后，使用Biotech-analyzerAS210(SakuraSeiki)測量培養(yǎng)基中積累的賴氨酸的量。在第24小時的OD和已經積累的L-賴氨酸示于表1。從表1中顯而易見，與不含bglF基因的WC196AldcCAcadA(pCABD2，pMW219)菌株相比，在WC196AldcCAcadA(pCABD2，pM-bglF)菌抹中積累了大量的L-賴氨酸。在積累的L-賴氨酸量上的改進還在與不含ptsG基因的WC196AldcCAcadA(pCABD2，pM-ptsG)菌株的比較中得到確認。這樣的數(shù)據(jù)顯示在賴氨酸的產生中bglF基因的過量表達比ptsG的過量表達更有效。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>用于L-賴氨酸產生的培養(yǎng)基:葡萄糖40g/L硫酸銨24g/L磷酸二氫鉀1.0g/L硫酸鎂7-水合物1.0g/L硫酸亞鐵小7-水合物0.01g/L硫酸錳令7-水合物0.01g/L酵母提取物2.0g/L碳酸鉀30g/L用KOH調節(jié)至pH7.0，并且在115。C滅菌IO分鐘。將葡萄糖和MgS04.7H20單獨滅菌。實施例3:bglF過量表達對產生'L-谷氨酸的大腸桿菌菌抹的影響將產生L-谷氨酸的大腸桿菌菌抹AJ12949菌抹用作親本菌抹。AJ12949菌林是已將a-酮戊二酸脫氫酶活性減少的細菌菌林，并且在1993年12月28曰以登錄號FERMP-14039保藏在工業(yè)4支術院生命工學工業(yè)技術研究所(目前為，獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所特許微生物保藏中心；Chuo6，1-1，Higashil-chome,Tsukuba-shi，Ibaraki-ken305-8566,Japan),并且才艮據(jù)布達佩斯條約在1994年11月11日轉為國際保藏，并給予登錄號FERMBP-4881。用實施例1中使用的bglF過量表達質粒pS-bglF，和對照質粒pSTV29轉化AJ12949菌林，并且獲得了氯霉素抗性菌株。在確認已將所述質粒引入之后，將引入了bglF過量表達質粒pS-bglF的菌林命名為AJ12949(pS-bglF);并且將引入了對照質粒pSTV29的菌林命名為AJ12949(pSTV29)。將AJ12949(pS-bglF)菌林和AJ12949(pSTV29)菌林在含有20mg/L氯霉素的L培養(yǎng)基中在37。C培養(yǎng)至最終成為OD6000.6。此后，將等體積的40%溶液添加至所述培養(yǎng)物并攪動，再吸取適量以獲得甘油原種并且貯藏在-80。C。在將這些菌林的甘油原種融化之后，將各100pL均勻地鋪在含有20mg/L氯霉素的L平板上，并將其在37。C培養(yǎng)24小時。將平板上大約1/8的細胞接種至500mLSakaguchi搖瓶中具有20mg/L氯霉素的20mL發(fā)酵培養(yǎng)基(下文所示)中，并且使用往復搖動培養(yǎng)裝置在37。C培養(yǎng)40小時。培養(yǎng)之后，使用Biotech-analyzerAS210(SakuraSeiki)測量培養(yǎng)基中積累的L-谷氨酸的量。在第40小時的OD和已經積累的L-谷氨酸示于表2。如表2所示，與不含bglF基因的AJ12949(pSTV29)菌林相比，在AJ12949(pS-bglF)菌林中積累了大量的L-谷氨酸。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>用于L-谷氨酸產生的培養(yǎng)基葡萄糖40g/L硫酸銨20g/L磷酸二氫鉀1.0g/L硫酸鎂7-水合物1.0g/L硫酸亞鐵4.7-水合物0.01g/L硫酸錳4;水合物0.01g/L酵母提取物2.0g/L碳酸4丐30g/L用KOH調節(jié)至pH7.0,并且在115。C滅菌IO分鐘。將葡萄糖和MgS04.7H20單獨滅菌。另外，培養(yǎng)物溫度在60°C或以下時，添加已用DISMIC-25cs0.2mm濾器(ADVANTEC)滅菌的鹽酸硫胺素溶液，以獲得O.Olg/L的終濃度。實施例4:bglF過量表達對產生L-蘇氨酸的埃希氏菌屬細菌菌林的影響作為用于產生L-蘇氨酸的bglFit量表達的親本菌抹，使用B-5318菌株。將B-5318菌株在1990年5月3日以登錄號VKPMB-5318保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM),GNIIGenetika(Russia,117545Moscow,1DorozhnyProezd,1)。從B-5318構建bglF過量表達菌株，所述構建使用如實施例1中描述的質粒進行。用實施例1中使用的bglF擴增質粒pS-bglF和對照質粒pSTV29轉化B-5318菌抹，并且獲得了氯霉素抗性菌林。在確認了將指定的質粒引入后，將引入了bglF過量表達質粒pS-bglF的菌抹命名為B-5318(pS-bglF);并且將引入了對照質粒pSTV29的菌抹命名為B-5318(pSTV29)。將B-5318(pS-bglF)菌林和B-5318(pSTV29)菌林在含有20mg/L氯霉素的L培養(yǎng)基中在37°C培養(yǎng)至最終成為OD6000.6。此后，將等體積的40%溶液添加至所述培養(yǎng)物并攪動，再吸:取適量以獲得甘油原種并且貯藏在-80。C。在將這些菌株的甘油原種融化之后，將各lOOpL均勾地鋪在含有20mg/L氯霉素的L平板上，并且將其在37°C培養(yǎng)24小時。將平板上大約1/8的細胞接種至500mLSakaguchi搖瓶中具有20mg/L氯霉素的20mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，并且使用往復搖動培養(yǎng)裝置在37。C培養(yǎng)16小時。培養(yǎng)之后，使用高效液相層析測量培養(yǎng)基中積累的L-蘇氨酸的量。在第16小時的OD和已經積累的L-蘇氨酸示于表3。如該表中所示，與不含bglF基因的B-5318(pSTV29)菌抹相比，在B-5318(pS-bglF)菌林中積累了大量的L-蘇氨酸。表3細菌菌抹OD600L-蘇氨酸(g/L)B-5318(pSTV29)8.03.6B-5318(pS國bglF)10.34.4用于L-蘇氨酸的產生的培養(yǎng)基:葡萄糖60g/L硫酸銨16g/L硫酸二氬鉀0.7g/L硫酸鎂7-水合物1.0g/L硫酸亞鐵7-水合物0.01g/L硫酸錳7-水合物0.01g/L酵母提取物0.5g/L鹽酸硫胺素0.2mg/LL-異亮氨酸0.05g/L碳酸釣30g/L用KOH調節(jié)至pH7.0,在115°C滅菌IO分鐘。然而，將葡萄糖和MgSCV7H20單獨滅菌。將氫氧化鉀在180。C干熱滅菌3小時。在培養(yǎng)物溫度降低至60。C或更低之后，添加已用DISMIC-25cs0.2mm濾器(ADVANTEC)滅菌的鹽酸硫胺素溶液以獲得0.2mg/L的終濃度。實施例5bglF過量表達對產生L-谷氨酸的泛菌屬細菌菌抹的影響作為bglF擴增產生L-谷氨酸的菌抹的親本菌林，可以使用尸a"toeaa朋""toAJ13601菌4朱。所述尸朋toea朋朋atoAJ13601菌抹在1999年8月18曰以登錄號FERMP-17516保藏在通商產業(yè)省工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所(NationalInstituteofBioscienceandHumanTechnology,AgencyofIndustrialScienceandTechnology,MinistryofEconomy,TradeandIndustry)(l-3,Higashil-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken305-8566),并且根據(jù)布達佩斯條約在2000年7月6日轉為國際保藏，并獲得登錄號FERMBP-7207。使用實施例1中描述的質粒能夠從產生L-谷氨酸的細菌構建bglF擴增的菌株。將bglF過量表達的菌抹在L-谷氨酸產生培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且使用往復搖動培養(yǎng)設備進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)之后，使用Biotech-analyzerAS210(SakuraSeiki)測量培養(yǎng)基中積累的L-谷氨酸的量以確認L-谷氨酸的積累是否增加。通過這種方法，能夠獲得具有改進的產生L-谷氨酸能力的bglF過量表達的菌林。權利要求1.用于產生L-氨基酸的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)腸桿菌科的微生物，所述微生物具有產生L-氨基酸的能力，并且經修飾而將β-糖苷PTS活性增強；和從所述培養(yǎng)基或微生物中收集L-氨基酸。2.根據(jù)權利要求1的方法，其中通過增加編碼P-糖苷PTS的bglF基因的拷貝數(shù)、修飾該基因的表達調節(jié)序列或它們的組合來修飾所述微生物以增強該基因的表達。3.根據(jù)權利要求1或2的方法，其中所述bglF基因選自下組(a)包含SEQIDNO.5的核芬酸序列的DNA，(b)在嚴緊條件下，與SEQIDNO.5的核苷酸序列的互補序列或能夠從所述核苷酸序列制備的探針雜交的DNA,并且所述DNA編碼具有(3-糖苷PTS活性的蛋白質。4.根據(jù)權利要求1或2的方法，其中所述bglF基因編碼選自下組的蛋白質(A)由SEQIDNO.6的氨基S^f列組成的蛋白質，(B)包含SEQIDN0.6的氨基酸序列的蛋白質，其包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位，并且所述蛋白質具有(3-糖苷PTS活性。5.根據(jù)權利要求1-4中任一項的方法，其中所述微生物是埃希氏菌屬或泛菌屬的細菌。6.根據(jù)權利要求1-4中任一項的方法，其中所述L-氨基酸選自下組L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-谷氨酸和它們的組合。全文摘要提供用于產生L-氨基酸的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有產生L-氨基酸的能力并且經修飾而將β-糖苷PTS活性增強的腸桿菌科的微生物，和從所述培養(yǎng)基或細胞中收集L-氨基酸。文檔編號C12P13/00GK101273138SQ20068003568公開日2008年9月24日申請日期2006年9月25日優(yōu)先權日2005年9月27日發(fā)明者城永佑志,植田拓嗣申請人:味之素株式會社