專利名稱：繩狀青霉菌的abfB-1基因的制作方法
繩狀青霉菌的abffi-l基因本發(fā)明涉及自繩狀青霉菌(Penicillium funiculosum)分離的abffi-l 基因及由該基因編碼的具有oc-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的ABFB-1多肽。繩狀青霉菌為踝節(jié)菌屬(Talaromyces ),屬于Aspergilleae科。該微 生物從許多易受空氣或水污染的有機基質中分離，表明該真菌具有含量 豐富的水解酶。這種酶混合物在動物飼料中的使用有助于解聚天然有機 物，且可能改善其可消化性。因此W099/57325描述了稱為IMI378536 的產生酶混合物的繩狀青霉菌林，這些酶特別適用作動物飼料。然而， 繩狀青霉菌產生的酶混合物尚未作重要的生化定性。的確，對獲得的發(fā) 酵液通常僅測得有限量的酶活性，如木聚糖酶和P-葡聚糖酶。這些活性 僅反映了混合物中的 一部分酶類。農業(yè)上的半分解纖維素化合物構成了繼植物組織纖維素之后的第二 大多糖儲備物。該類特征是具有多種多樣的雜多糖，主要代表有木聚糖、 阿拉伯聚糖、半乳聚糖、葡聚糖和甘露聚糖?？啡┬问降陌⒗菑V泛 存在于雜多糖，如阿拉伯聚糖和阿拉伯木聚糖中。阿拉伯聚糖為聚合物， 以a-l-5 4定與阿拉伯呋喃糖殘基相連接，可在0-2或0-3位被1或2個 阿拉伯糖殘基取代。至于阿拉伯木聚糖，a-L-阿拉伯呋喃糖殘基通過a-l-3 和a-l-2鍵與主要的(3-l-4-吡喃木糖鏈連接。在這些側鏈上阿拉伯糖殘基 的存在可限制許多工業(yè)應用(如增強動物飼料可消化性)中的半分解纖 維素化合物的酶水解作用。裂解a-L-阿拉伯呋喃糖苷4囊的酶可與木聚糖 酶協(xié)作，以允許阿拉伯木聚糖和阿拉伯聚糖的水解。因此，阿拉伯糖酶活性(內切，外切阿拉伯糖酶以及,主要是a-L-阿拉 伯呋喃糖酶活性)可積極協(xié)同木聚糖酶有助于半分解纖維素化合物的解 聚。半分解纖維素化合物和果膠化合物可代表植物中高達50%的總糖， 它們構成動物的主要能源。這些化合物可消化性的增強與半分解纖維素 化合物中阿拉伯糖殘基取代程度的降低有關(Brice, R.E., Morrison, I.M. 1982, Carbohydr. Res. 101: 93-100)。
水解L-阿拉伯糖殘基之間鍵的酶已自微生物如細菌或絲狀真菌中分離。阿拉伯糖苷酶主要由a-L-阿拉伯呋喃糖酶(EC3.2.1.55)組成，該酶能 水解來自L-阿拉伯木聚糖或(如阿拉伯聚糖和阿拉伯半乳聚糖的)化合 物的非還原性的a-L-阿拉伯呋喃糖殘基。根據它們的蛋白質序列相似性，已將a-L-阿拉伯呋喃糖酶 (EC3.2.1.55)分為兩個糖苦水解酶的家族(GH51和GH 54)。這兩個家族 因其對包含于多糖中底物的特異性而不同。第 一族(GH 51)包含A型阿拉 伯呋喃糖酶，該酶僅對a-l-5連接的小線性結構阿拉伯呋喃低聚糖起作 用。第二族由B型阿拉伯呋喃糖酶(GH54)組成，該酶催化阿拉伯呋喃低 聚糖化合物側鏈的a-l,5、 a-l,3和a-l,2 4建的水解。已自許多細菌及絲狀真菌中將B型阿拉伯呋喃糖酶(ABFB)分離。 曲霉屬(Aspergillus )最具代表性，但也已將它們自木霉屬(Trichoderma ), 青霉菌屬(Penicillium)和鐮孢菌屬(Fusarium)中分離。WO 96/29416、 WO 96/06935、 WO 2004/018662和US 5,989,887描述 黑曲霉阿拉伯呋喃糖酶基因。蛋白質序列對比顯示黑曲霉abffi蛋白與繩 狀青霉素(P. funiculosum) ABFB-1蛋白的同一性為72.4%。這些申請 沒有描述任何 一 種多肽在動物營養(yǎng)中應用所必需的特征。Clinche et al. (J. Agric. Food Chem., 45, 2379-2383， 1997)已描述三種 來自土曲霉(Aspergillus terreus ) 的可能用于釀酒的a-L-阿拉伯呋喃糖 酶。Gielkens et al.(Microbiology, 145, 735-741, 1999)已描述了構巢曲 (Aspergillus nidulans ) abdb基因。白曲霉(Aspergillus kawachii)禾口泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 的abffi基因已#皮Koseki et al.描述(J. of Bioscience禾口 Bioengineering, Vol. 96， No. 3, 232-241， 2003)。這些酶在日本酒shochu的發(fā)酵中具有應 用。來自絲狀真菌里氏木霉(Trichoderma reesei) 的abffi基因已被 Margolles-Clark et al.描述(Applied and Environmental Microbiology, 3840-3846， 1996)。Panagiotou et al.也已描述了兩種來自尖3包鐮刀菌(Fusarium oxysporum)的細胞外o;-L-阿拉伯呋喃糖酶(Can J Microbiol. 2003: 49(10): 639-4)。Carvallo et al. (Mycol. Res" 107 (4)， 388-394, 2003)已描述了來自產 紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)的B型ot-L-阿拉伯呋喃糖酶。蛋 白質序列比對顯示產紫青霉菌abf-1蛋白與繩狀青霉菌ABFB-1蛋白的 同一性為85.6%。此文沒有描述任何一種多肽在動物營養(yǎng)應用中所必需的 特征。然而，Sakamoto et al. (FEBS Letters 560, 199-204, 2004)已描述了產 黃青霉菌(Penicillium chrysogenum) abnx基因，其仍編碼與ABFB活性 不同的阿拉伯糖酶活性。然而，這些ABFB酶不具備應用于動物飼料所需的最適特性。的確，為了可用于動物飼料，ABFB必須具有與處理相容的特性，可 預期用于該飼料的飼料接受所述處理。特別是，所用酶的活性在處理溫 度和pH條件下必須穩(wěn)定，而且，如果可能，其在制備這些飼料的過程中 以及在消化這些伺料的動物消化系統(tǒng)中的條件下是最佳的。此外，這些酶必須對雜多糖(阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半 乳聚糖)具有廣i普作用(去除分支)，以有效增強動物對飼料的可消化性。 增強飼料可消化性可能提高它們的營養(yǎng)價值。因此，對天然底物阿拉伯 木聚糖和阿拉伯聚糖具有增強的的特異性(立體特異性、對映選擇性)、活 性或親和力的酶對于動物飼料非常重要。本發(fā)明描述了 一種適用于動物營養(yǎng)的繩狀青霉菌L-阿拉伯呋喃糖酶B(ABFB-1)，及編碼該酶的基因。本發(fā)明還涉及保留相同催化特性的ABFB-1的同系物、變異體和片段。有利的是，根據本發(fā)明的ABFB酶具高最適溫度。 本發(fā)明的另一優(yōu)點在于繩狀青霉菌AFBF-1的表達在該真菌中在用于誘導纖維素水解酶和半纖維素水解酶的條件(用于生產纖維素水解酶和半纖維素水解酶的工業(yè)型培養(yǎng)基)下被天然高誘導。根據本發(fā)明的酶也具有其它工業(yè)或工農業(yè)用途。特別值得一提的是 通過發(fā)酵處理果汁、造紙、將半分解纖維素生物質轉變?yōu)槿剂匣蚧瘜W制 品、造酒。序列描述SEO ID No. 1:繩狀青霉菌abfB-l基因的基因組序列。 SEO ID No. 2:具有B型a-L-阿拉伯呋喃糖酶活性的繩狀青霉菌 ABFB-1多肽的序列。SEO ID No. 3: Xbal-abffi引物。 SEO ID No. 4: HindIII-abfB引物。發(fā)明描述本發(fā)明涉及一種適用于動物營養(yǎng)的多肽，其包括一種選自以下多肽 的多肽畫SEQ ID No. 2的多肽，畫序列介于SEQ ID No. 2的位置28和位置507之間的多肽，-SEQ ID No. 2的多肽片段，其具有a-L-阿拉伯吹喃糖酶B活性，-一種多肽，其具有a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性且顯示與SEQ IDNo. 2的多肽具有至少90%的同一性。本發(fā)明還涉及多核苷酸，其編碼a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性，選自以下多核苷酸-序列在SEQ ID No. 1的位置845與位置2368之間的多核苷酸， -序列包括在SEQ ID No. 1的位置927與位置2368之間的多核苷酸， -編碼上述多肽的多核苷酸。本發(fā)明的另一個對象為一種多核苷酸，其具有SEQ ID No. 1代表的 序列或與SEQ ID No. 1互補的序列。本發(fā)明還涉及表達盒，其在轉錄方向上包含 -在宿主生物中有功能的啟動子；
-根據本發(fā)明的多核苦酸；以及 -在相同宿主生物中有功能的終止序列。本發(fā)明另 一個對象為載體，其包含根據本發(fā)明的多核苷酸和/或根據 本發(fā)明的表達盒。本發(fā)明還涉及宿主生物，該生物被根據本發(fā)明的多核苷酸、根據本 發(fā)明的表達盒和/或根據本發(fā)明的載體轉化。在在本發(fā)明的一個實施方案中，宿主生物選自酵母和絲狀真菌。 優(yōu)選地，宿主生物為繩狀青霉菌^^。本發(fā)明還涉及動物的營養(yǎng)添加物，包括根據本發(fā)明的多肽、根據本 發(fā)明的宿主生物或根據本發(fā)明的宿主生物的發(fā)酵液。 優(yōu)選地，該營養(yǎng)添加物為液體形式或4分末形式。本發(fā)明的另 一 方面為飼料，其包含根據本發(fā)明的動物營養(yǎng)基質和動 物營養(yǎng)添加物。本發(fā)明還涉及根據本發(fā)明的ABFB多肽或根據本發(fā)明的宿主生物用 于制備動物營養(yǎng)添加物或飼料營養(yǎng)添加物的用途。本發(fā)明的另一個對象是根據本發(fā)明的ABFB多肽或根據本發(fā)明的宿 主生物用于水解阿拉伯呋喃低聚糖化合物的a - L -阿拉伯呋喃糖4囊的用途。多肽本發(fā)明因此涉及具有a-L-阿拉伯吹喃糖酶B活性的ABFB多肽。 優(yōu)選地，將這些多肽分離自繩狀青霉菌。表述"a-L-阿^立伯呋喃糖酶B"應,皮理解為a-L-阿拉伯呋喃并唐酶 (EC 3.2丄55)B型(GH 54)，其催化包含于阿拉伯呋喃低聚糖化合物側鏈的 a-l，5、 a-l,3和a-l,2 4建的水解。繩狀青霉菌抹IMI378536的a-L-阿拉伯呋喃糖酶B由SEQ ID No.2 表示。表述"適用于動物營養(yǎng)的多肽"應被理解為其特征使得其適于動物營養(yǎng)的多肽。用于動物營養(yǎng)必需的特;f正特別為pH及溫度，在此pH及溫度
下酶具有活性。的確，動物消化系統(tǒng)的pH為酸性，因此酶在此pH時必 須保持活性，這是為了在L-阿拉伯糖殘基的水解中保持其活性。此外， 控制營養(yǎng)添加物或動物飼料中的酶的條件包括處理及高于室溫的溫度。 所用的酶活性因此必須在處理條件下，特別是在所述溫度條件下穩(wěn)定。根據本發(fā)明的一個實施方案，多肽在酸性pH時，例如低于5,優(yōu) 選低于4時顯示a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。而且，根據本發(fā)明的一個 實施方案,多肽在pH 2與pH 3.5之間時顯示最佳的a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。根據本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，多肽在高于室溫的溫度時顯示a-L-阿 拉伯呋喃糖酶B活性。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽在40°C與70。C之間，更 優(yōu)選50°C與65°C之間的溫度下具有最佳的a-L-阿拉伯^^喃糖酶B活性。在優(yōu)選的實施方案中，將根據本發(fā)明的多肽糖基化。特別是，SEQID No. 2的多肽在氨基酸92和氨基酸376處具有N-糖基化位點。在優(yōu)選的 實施方案中，將SEQ ID No. 2多肽的位置92和376處的天冬酰胺殘基糖 基化。繩狀青霉菌的a-L-阿拉伯呋喃糖酶B是由真菌分泌到其細胞外環(huán)境 的酶。SEQIDNo. 2的多肽因此包括27個氨基酸的信號肽。本發(fā)明的對 象還為裂解信號肽后獲得的成熟多肽。特別是，本發(fā)明涉及序列介于SEQ ID No. 2的位置28與位置507之間的多肽。在另 一個實施方案中，SEQ ID No. 2多肽的信號肽可被異源信號肽取代，用于由異源宿主生物表達和分 泌SEQ ID No. 2的多肽。本發(fā)明還涉及具有a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的SEQ ID No. 2的 多肽的片段。術語多肽的"片段"指下述多肽，所述多肽包括其所來源的多肽的一 部分而不是全部。因此，本發(fā)明涉及一種多肽，其包括SEQ ID No. 2多 肽的至少100、 200、 300、 400或500個氨基酸的片段。SEQ ID No. 2的多肽的這一片段保持其a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。 本發(fā)明因此涉及SEQIDNo.2的多肽的生物學活性片段。術語"生物學 活性片段"指保持其所來源的多肽的功能的多肽片段。SEQ ID No. 2的 多肽的生物學活性片段因此保持繩狀青霉菌ABFB-1多肽的功能。這些 生物學活性片段具有a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。制備多肽片段的方法 和測定a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的技術為本領域技術人員所熟知。本發(fā)明的對象還為多肽，其具有L-阿拉伯呋喃糖酶B活性且顯示 與SEQIDNo. 2的多肽至少90%的同一性。優(yōu)選地，這些多肽具有與SEQ IDNo. 2的多肽相同的特性，特別是相同的催化特性。優(yōu)選地，這些多肽 分離自繩狀青霉菌的其它抹或其它絲狀真菌?；蛘?，這些多肽可通過例 如定點誘變技術獲得。本發(fā)明的對象為具有與SEQ ID No. 2的多肽至少90%, 95%, 98% 以及優(yōu)選至少99%相同的氨基酸的多肽。將表述相同的氨基酸理解為兩條序列之間不變的或無變化的氨基 酸。這些多肽與SEQ IDNo. 2的多肽相比可顯示至少一個氨基酸的缺失、 增加或取代。本發(fā)明的對象還為多肽，其顯示與SEQIDNo. 2的多肽的相似性為 至少90%、 95%、 98%,以及優(yōu)選至少99%。將表述相似性理解為蛋白質或核酸序列之間相似性的測量。這些多 肽與SEQ ID No. 2的多肽相比可顯示出至少一個氨基酸的缺失、增加或 取代。以分數定量的兩條序列之間的相似程度基于序列同一性和/或序列 保守取代的百分比。員所知?？墒褂美巛d體NTi 9.1.0，比對程序AlignX(聚類w算法(Clustal W algorithm) ) (Invitrogen INFORM AX, http:〃www. invitrogen.com)。優(yōu)選 地，使用默認參數。將根據本發(fā)明的多肽自其自然環(huán)境分離或純化。多肽可通過各種方 法制備。特別是，這些方法是從自然來源(如天然表達這些多肽的細胞) 中純化、通過合適的宿主細胞生產重組的多肽及其隨后的純化、通過化 學合成的生產或，最后，這些不同途徑的組合。這些不同生產方法為本 領域技術人員所熟知。因此，可將本發(fā)明的ABFB多肽自繩狀青霉菌分 離。在另一個實施方案中，本發(fā)明的ABFB多肽自表達根據本發(fā)明的 ABFB多肽的重組宿主生物中分離。
本發(fā)明的對象還為融合蛋白、重組蛋白或嵌合蛋白，包括根據本發(fā) 明的多肽。術語"多肽"也指被修飾的蛋白質和多肽。根據本發(fā)明的多肽具有ABFB活性并優(yōu)選地保留繩狀青霉菌 ABFB-1酶的催化特性。特別是，這些多肽在60。C和pH 3.4時具有最佳 活性。多核香酸本發(fā)明還涉及編碼a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的多核苷酸。優(yōu)選 地，這些多核香酸編碼繩狀青霉菌a-L-阿拉伯呋喃糖酶B。根據本發(fā)明，表述"多核苷酸"理解為單鏈核苷酸鏈或其互補鏈，其可 以是DNA或RNA型或可為互補或基因組DNA型的雙鏈核香酸鏈。優(yōu) 選地，本發(fā)明的多核芬酸為DNA型，特別是雙鏈DNA。術語"多核苷 酸"也指被修飾的多核苷酸?？蓪⒈景l(fā)明的多核苷酸自其自然環(huán)境分離或純化。優(yōu)選地，本發(fā)明 的多核苷酸可通過Sambrook et al描述的常規(guī)分子生物學技術(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989)或通過化學合成制備。在第一個實施方案中，本發(fā)明涉及多核苷酸，其序列介于SEQ ID No. 1的位置845與位置2368之間。該多核苷酸編碼SEQ ID No. 2的繩 狀青霉菌ABFB-1酶。在第二個實施方案中，本發(fā)明涉及多核苷酸，其序列介于SEQ ID No. 1的位置927與位置2368之間。該多核苷酸編碼繩狀青霉菌信號肽 裂解后的成熟的ABFB-多肽。本發(fā)明還涉及多核苷酸，其與序列介于SEQ ID No. 1的位置845與 位置2368之間的多核香酸和/或與序列介于SEQ ID No. 1的位置927與 位置2368之間的多核香酸具有至少70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 98%,優(yōu)選地至少99%的同一性。這些多核香酸編碼oc-L-阿^立伯呋喃糖酶 B活性。優(yōu)選地，這些多核香酸編碼繩狀青霉菌a-L-阿拉伯呋喃糖酶B。表述相同的核普酸理解為表示兩個核苷酸序列不變或無變化。這些 多核苷酸與對照多核苷酸相比顯示出至少一個核香酸的缺失、增加或取 代。
本發(fā)明還涉及多核苷酸，其與序列介于SEQ ID No. 1的位置845與 位置2368之間的多核苷酸和/或與序列介于SEQ ID No. 1的位置927與 位置2368之間的多核苷酸具有至少70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 98%，優(yōu)選至少99%的相似性。這些多核苷酸編碼ot-L-阿拉伯呋喃糖酶B 活性。優(yōu)選地，這些多核苷酸編碼繩狀青霉菌oc-L-阿拉伯呋喃糖酶B。表述相似性理解為蛋白質或核酸序列之間相同之處的測量。這些多 核苦酸與對照多核香酸相比可顯示出至少一個核苷酸的缺失、增加或取 代。以分數定量的兩條序列之間的相似程度基于序列同一性和/或序列保 守取代的百分比。測量和鑒定核酸序列之間的相同程度和相似程度的方法為本領域技 術人員所熟知?？墒褂美巛d體NTi載體NTi 9.1.0，比對程序AlignX (聚 類w算法)(Invitrogen INFORMAX, http:〃www.invitrogen. com)。優(yōu)選地, 使用默認參數。優(yōu)選地，與對照多核苦酸具有相似程度的多核苷酸保持對照序列的 功能。在本文情況下，多核苷酸編碼a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。本發(fā)明還涉及多核苷酸，其能與序列介于SEQ ID No. 1的位置845 與位置2368之間的多核苷酸和/或與序列介于SEQ ID No. 1的位置927 與位2368之間的多核苦酸選擇性雜交。優(yōu)選地，將選擇性雜交在一般嚴 格性條件下完成，優(yōu)選在高嚴格性條件下完成。這些多核苷酸編碼a-L-阿拉伯吹喃糖酶B活性。優(yōu)選地，這些多核苷酸編碼繩狀青霉菌a-L-阿拉伯呋喃糖酶B。表述"能選擇性雜交的序列"被理解為，根據本發(fā)明，在明顯高于背 景噪音的水平上與對照序列雜交的序列。由能選擇性雜交的序列與對照 序列之間的相互作用產生的信號水平比產生背景噪音的其它DNA序列 的相互作用的信號水平強，通常強10倍，優(yōu)選強100倍。允許選擇性雜 交的嚴格雜交條件為本領域技術人員所熟知。通常，在給定pH和給定離 子強度下，雜交和洗滌溫度比對照序列的Tm至少低5°C。通常，用于 15至50個核普酸的多核苷酸的雜交溫度至少為30。C，用于多于50個核 香酸的多核苦酸的雜交溫度至少為60。C。舉例說明，將雜交在以下緩沖 液中完成6x SSC、 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、 1 mM EDTA、 0.02% PVP、
0.02%Ficoll、 0.02% BSA、 500嗎/ml變性鮭魚精子DNA。例如在低嚴格 性的2x SSC、 0.1% SDS緩沖液中，一^殳嚴格性的0.5x SSC、 0.1% SDS 緩沖液中以及高嚴才各性的O.lx SSC、0.1% SDS緩沖液中成功地完成洗滌。 當然，可將雜交根據本領域技術人員所熟知的其它常用方法完成(特別 參見Sambrook et al.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989 )。優(yōu) 選地，與對照多核苦酸選擇性雜交的多核苷酸保持對照序列的功能。在 本文情況下，多核苷酸編碼ot-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性，其與序列介于 SEQ ID No. 1的位置845與位置2368之間的多核香酸和/或與序列介于 SEQ ID No. 1的位置927與位置2368之間的多核香酸選擇性雜交。本發(fā)明通常涉及編碼根據本發(fā)明的多肽的多核苷酸。由于遺傳密碼 的筒并，不同多核苷酸可編碼相同的多肽。本發(fā)明的另一對象為序列如SEQ ID No. 1所示的多核苷酸。SEQ ID No. 1的多核香酸包括位于繩狀青霉菌abffi-1基因開放讀碼框(ORF)側 翼的序列。特別是，它們是abffi-1基因的啟動子和終止序列?？蓪bfB 基因從其同源調控序列表達，特別是在繩狀青霉菌中或其它絲狀真菌中 過表達。在另一個實施方案中，例如可將abffi基因在各種宿主生物如細菌、 酵母和真菌中表達。在本發(fā)明的SEQ ID No. 1的啟動子控制下或在異源 啟動子的控制下，可將abffi基因在宿主生物中表達。表達盒根據本發(fā)明的 一個實施方案，使用本領域技術人員所熟知的克隆技 術，將編碼根據本發(fā)明的多肽的多核苷酸插入表達盒。該表達盒包括轉 錄和翻譯編碼根據本發(fā)明的多肽的序列所必需的元件。有利的是，該表達盒既包括可能引起宿主細胞產生多肽的元件，也 包括調節(jié)該表達所必需的元件。這些表達盒在轉錄方向上包含-在宿主生物中有功能的啟動子；-根據本發(fā)明的多核苷酸；-在相同宿主生物中有功能的終止序列。
啟動子的選擇將依賴于被選擇用于表達目的基因的宿主生物。 一些啟動 子允許組成型表達，而其它啟動子則相反為誘導型。在真菌中有功能的啟動子中，可特別提到構巢曲霉(Aspergillus nidulans )甘油醛-3-磷酸脫 氫酶的啟動子(Roberts et al., Current基因t. 15: 177-180, 1989)。在細菌 中有功能的啟動子中，可特別提到T7噬菌體RNA聚合酶的啟動子 (Studier et al.， Methods in enzymology 185: 60-89, 1990)。在酵母中有功能 的啟動子中，可提到GAL1基因(Elledge et al., Proc Natl Acad Sciences, USA. 88: 1731-1735， 1991)或釀酒酵母(S. cerevisiae ) GAL4的啟動子以 及ADH啟動子。所有這些啟動子已有文獻描述，且為本領域技術人員 所熟^p。將選擇表達盒用于繩狀青霉菌中的表達，所述表達盒例如包括組蛋 白H4.B啟動子、天冬氨酸蛋白酶啟動子或csl13啟動子(WO 00/68401)。根據本發(fā)明的表達盒可額外包括多肽或多核苷酸表達所必需的任何 其它序列，例如允許分泌宿主生物產生的多肽的調控元件或信號序列。 特別是，可能使用任何調控序列，所述調控序列可能提高插入到表達盒 中的編碼序列的表達水平。特別地，根據本發(fā)明，可與調控啟動子序列 組合使用其它調控序列，這些調控序列位于啟動子與編碼序列如轉錄激 活子("增強子")之間?？蓪⒏鞣N各樣的終止序列用于根據本發(fā)明的表達盒中，這些序列可終止轉錄及mRNA的多腺苷酸化?？墒褂迷谒x宿主生物中有功能的任 何終止序列。將選擇表達盒用于在繩狀青霉菌中的表達，所述表達盒例如包括組 蛋白H4.B終止子、天冬氨酸蛋白酶終止子或csl13終止子的 (WO 00/68401)。本發(fā)明的對象還為包含根據本發(fā)明的表達盒的多核苷酸，有利的是 將根據本發(fā)明的表達盒插入載體。載體
本發(fā)明因此還涉及復制或表達載體，所述載體用于轉化包含至少一 個多核香酸或一個根據本發(fā)明的表達盒的宿主生物。特別是，該載體可 對應為已插入根據本發(fā)明的多核苷酸或表達盒的質粒、粘粒、噬茵體或 病毒。構建這些載體和將本發(fā)明多核苷酸插入這些載體的技術為本領域 技術人員所熟知。通常，可能使用在宿主細胞中能保持自身、自主復制 或增殖的任何載體，以特別誘導多核苦酸或多肽的表達。本領域技術人 員將根據待轉化的宿主生物和根據所用的轉化技術選擇合適的載體。特別是，將本發(fā)明的載體用于轉化宿主生物，用于在宿主生物中復 制載體和/或表達根據本發(fā)明的多肽。本發(fā)明還涉及制備根據本發(fā)明的多肽的方法，該方法包括以下步驟-使用包含根據本發(fā)明的表達盒的表達載體和/或根據本發(fā)明的多 核苷酸轉化宿主生物，-分離宿主生物產生的多肽。宿主生物本發(fā)明的對象還為轉化宿主生物的方法，所述方法通過將至少 一個 根據本發(fā)明的多核苷酸或表達盒或載體整合入所述宿主生物來完成?？?將多核苷酸整合入宿主生物的基因組，或多核苷酸能在宿主生物中穩(wěn)定地復制。轉化宿主生物的方法為本領域:技術人員所熟知，且在文獻中被 4艮好地描述。本發(fā)明還涉及一種宿主生物，其可被根據本發(fā)明的多核苷酸、表達 盒或載體轉化。特別是，根據本發(fā)明，表述宿主生物理解為選自細菌、 酵母和真菌的任何單或多細胞、低等或高等的生物。表述宿主生物理解為非人生物。有利的是，酵母選自畢赤酵母(Pichiapastoris)、釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisae ) 、 Yarrowia lipolytica 和 Schwanniomyces occidentalis。真菌選自曲霉(Aspergillus)和青霉菌(Penicillium)，優(yōu)選 選自繩狀青霉菌、Trichoderma reesei、 黑曲霉(Aspergillus niger )、 泡盛 曲霉(Aspergillus awamori )、白曲霉(Aspergillus kawachii)禾口 Trichoderma koningii。在優(yōu)選的實施方案中，宿主生物為繩狀青霉菌抹，其中根據
本發(fā)明的ABFB多肽,皮表達或過表達。在這些生物中，用于構建載體、轉化宿主生物和表達異源蛋白質的:技術一皮廣泛描述于文獻中(Ausubel F.M. et al.， "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1和2, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, 1989; T. Maniatis, E.F. Fritsch， J. Sambrook, Molecular Cloning A laboratory Handbook, 1982)。食品添加劑和飼料-本發(fā)明因此涉及提供a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的食品添加劑。攝 入這種類型酶活性可能增強食品的可消化性并提高其營養(yǎng)價值。表述營養(yǎng)添加物理解為有意地、通常以小量添加至食品以改善其營 養(yǎng)特性或可消化性的物質。用于動物的營養(yǎng)添加物可包含例如維生素、 無機鹽、氨基酸和酶。通常，用于動物的營養(yǎng)添加物包括根據本發(fā)明的多肽,根據本發(fā)明的 宿主生物或根據本發(fā)明的宿主生物的發(fā)酵液。因此，可將具有根據本發(fā) 明的a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的多肽自繩狀青霉菌株或自用于制備 動物營養(yǎng)添加物的重組宿主生物中純化或分離?；蛘?，可將繩狀青霉菌 抹或產生AbfB多肽的宿主生物直接用于制備動物用營養(yǎng)添加物。在本 發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，將繩狀青霉菌抹或根據本發(fā)明的宿主生物的培 養(yǎng)上清液或發(fā)酵液用于制備動物用營養(yǎng)添加物。當將ABFB多肽通過繩 狀青霉菌株或宿主生物分泌時，該實施方案特別有利。通常，將該培養(yǎng) 上清液濃縮或凍干以制備營養(yǎng)添加物。因此，本發(fā)明還涉及制備ABFB酶的方法，該方法包括以下步驟a) 在用于誘導ABFB表達的條件下培養(yǎng)繩狀青霉菌株或根據本發(fā) 明的纟皮轉化的宿主生物，b) 分離包括ABFB酶的培養(yǎng)上清液。 然后可將該培養(yǎng)上清液或發(fā)酵液濃縮或凍干以形成食品添加劑或飼料。如果宿主生物在培養(yǎng)基中不分泌ABFB酶，增加打開細胞并純化細 胞提取物的步驟可能是必需的。 本發(fā)明的營養(yǎng)添加物包含(X-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性，但可能還包 含其它營養(yǎng)物質如維生素、氨基酸或無機鹽。根據本發(fā)明的添加劑增加飼料的可消化性，因此特別有助于更好地 增強基于谷類(小麥、大麥、玉米、燕麥、黑麥等)和基于油渣餅(大 豆、向日葵、油菜籽等)的食物的營養(yǎng)價值。本發(fā)明還涉及包含根據本發(fā)明的營養(yǎng)基質和營養(yǎng)添加物的飼料。通 常將這些飼料以膳食或顆粒形式提供，其中加入根據本發(fā)明的添加劑。表述飼料理解為可作為食物提供給動物的任何事物。飼料包含根據本發(fā)明的多肽、根據本發(fā)明的宿主生物或根據本發(fā)明 的宿主生物的發(fā)酵液。用于密集的動物育種，這些飼料通常包含營養(yǎng)基質和營養(yǎng)添加物。表述營養(yǎng)基質理解為構成動物飼料配給的主要部分的物質，例如由谷 類、蛋白和動物和/或植物來源的脂肪的混合物組成。動物用營養(yǎng)基質適合用作這些動物的食物，并為本領域技術人員所熟知。通常，這些營養(yǎng)基質包含例如玉米、小麥、豌豆和大豆。這些營養(yǎng)基質適于它們所指定的各種動物的需要。這些營養(yǎng)基質可能已經包含 營養(yǎng)添加物如維生素、無機鹽和氨基酸。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及用于單胃動物，特別是用于家禽和豬的祠料。家禽特別包括蛋雞、broilers、火雞和鴨子。豬特別包括成 豬和小豬。


附圖1:在40。C下，存在5 mM PNPAF時測定ABFB-1酶在Mcllvaine 緩沖系列(pH 2.2至8)中的最佳pH。附圖2:在5 mM PNPAF存在下，測定在最佳pH時ABFB-1酶的最佳溫度。附圖3:當PNPAF為0.5 mM至5 mM的范圍時，在pH 3.4和60°C 時，測定ABFB-1的動力學常數Km和Vm(l/Vi = f(l/S)。附圖4:根據繩狀青霉菌生長情況評價abffi-l和abffi-2基因的相對
定量差異表達。 實施例L-阿拉伯呋喃糖酶B活性測定的發(fā)展在包含0.15% provasoy和0.3%纖維素的混合添加劑的M2培養(yǎng)基上 將繩狀青霉菌培養(yǎng)40小時后，測定L-阿拉伯呋喃糖酶活性。在培養(yǎng)48 小時和72小時時收集樣品。培養(yǎng)在200ml錐形瓶中完成，使用了50ml 體積。通過在50 mM pH 5的乙酸鈉緩沖液中水解5 mM對硝基苯基-(L-阿拉伯呋喃糖苷(PNPAF)測定活性。將50 |ul培養(yǎng)上清液與在50。C預熱 的250 iil底物將育15分鐘。加入500 |id 0.5 MNaOH停止反應。在405 nm 處測定對硝基苯基(PNP)的釋放，使用的摩爾消光系數為 17 000M-l.cm-l。將酶單位定義為在上,述條件下每分鐘水解1 )umol PNPAF的酶的量。對于繩狀青霉菌培養(yǎng)物，在培養(yǎng)48 h后我們獲得 20mU.ml-l,在培養(yǎng)72 h后獲得112 mU.ml-l 。這些結果與文獻一致，的 確對于黑曲霉，根據培養(yǎng)中使用的誘導物，觀察到100至600mU.ml-l 等級的活性。將繩狀青霉菌abffi ORF克隆進釀酒酵母從繩狀青霉菌的基因組 DNA開始，借助引物 (HindlII-abfB/Xbal-abffi)通過PCR擴增abffi基因，應用以下條件(94。C 30 sec; 62°C 30 sec;在72。C 1 min 30 sec)進行30個循環(huán)。將PCR產物 克隆入商品化載體pGEM-T(tm)easy中。PCR引物對的序列XbaI陽abfB-l: >5，-TCTAGAATGTTTCCAAGAATAAAACCAG-3，<HindIII-abffi-1: >5，-AAGCTTTCATGCAAAGGCAGTCT-3，<將1534 bp的HindlII/Xbal片段自載體 pGEM-T切除，在 HindlII/Xbal位點亞克隆入穿梭載體pJL52(placl95-PGK/CYCl)。對于異 源表達，abffi基因因此受編碼磷酸甘油酸酯激酶(釀酒酵母)的基因的
組成性PGK啟動子和編碼細胞色素C氧化酶活性的基因的CYC1終止 子(釀酒酵母)的控制。將新的表達盒稱為pOT-Ol。酉良酒酵母林JF弁1194(CEN.PK113-5D)是來源于帶有ura 3-52營養(yǎng)缺 陷型的CEN.PK 122抹的克隆，以表達載體pOT-02轉化(乙酸鋰/熱激法)。 在無尿嘧啶的選擇性平板(URA3標記)上，以表型互補選擇轉化株。選捧6個轉化抹以測試培養(yǎng)上清液中阿拉伯呋喃糖酶B活性的存 在。在50ml無尿嘧啶的YNB培養(yǎng)基(除野生型對照株外)中，將轉化 才朱培養(yǎng)24小時。以上文描述的方法測定培養(yǎng)上清液中的阿拉伯呋喃糖酶 活性。最佳pH的確定將來源于繩狀青霉菌的編碼阿拉伯呋喃糖酶B活性的abffi-l基因 克隆入釀酒酵母中。在幾個轉化4朱中4企查阿拉伯呋喃糖酶B活性的存在 后，選擇一種轉化抹并在生長24h后測定培養(yǎng)上清液中的ABFB活性。 在200 ml錐形瓶(工作體積50 ml)中完成培養(yǎng)。在Mcllvaine緩沖系列(pH 2.2至8.0)中存在5 mM p-硝基苯基 -ot-L-阿拉伯呋喃糖苷(PNPAF)時測定活性。將80(il培養(yǎng)上清液與在 40。C預熱的320 |al底物孵育10 min。加入1 ml 1M Na2C03停止反應。在 405 nm"處測定p-硝基苯基的釋放。將一個酶單位定義為上述條件下每 分鐘水解1 iumol PNPAF的酶量?；钚郧€如圖1所示。在pH 3.4時 ABFB-1具有最佳活性，并且在pH 5時保持65%的活性。最佳溫度的測定使用相同的流程，我們確定了 ABFB-1活性的最佳溫度。在pH3.4 的各個溫度下將酶在Mcllvaine緩沖液中孵育10min?；钚郧€如圖2 所示。繩狀青霉菌ABFB-1在60。C時具有最佳活性。因此ABFB-1具有 高于所述ABFB的最適溫度。如果選擇酶ABFB-1的最適pH和溫度(pH3.4 和60。C),則觀察到ABFB-1的活性為在pH 5和40°C的乙酸鹽緩沖液中測定的活性的4倍(424 mU vs 102 mU)。 K^和V!的測定在上面確定的最佳條件下，通過測量PNPAF隨著時間的水解測定 ABFB-1的動力學常數(Km和Vm)。在pH 3.4緩沖液中，建立0.5與5 mM范圍的底物(PNPAF)濃度。 在60°C監(jiān)控水解的動力學10分鐘。將結果根據雙反推法(double inverse method ) (Lineweark和Burk)處理，如圖3所示。ABFB-1的Km值為1 mM。通過比較，文獻中這類酶的Km值根據 所研究的屬和真菌的種類在0.05至1.2 mM范圍變化。在上述條件下 ABFB-1具有521 mol PNPAF/mo1酶/min的最大水解速度(Vm)。測定ABFB-1酶的分子量為確定ABFB-1酶的分子量，將源于基本培養(yǎng)基的生長突變體(釀 酒酵母)的培養(yǎng)上清液濃縮200倍，在100°C煮沸5分鐘變性，然后儲 存于SDS-聚丙烯酰胺凝膠中。在野生型菌抹中觀察到細胞外蛋白質的量極低。對于突變體， ABFB-1酶被分泌在培養(yǎng)上清液中。主要是與釀酒酵母細胞外蛋白的基本 水平有關。分子量的確定借助于尺寸標記物SeeBlue (Invitrogen)完成。結果表示 于表1中。子貞測的MW在凝膠上評價的MWABFB-15365表1:以Kda計的ABFB-1分子量我們比較通過算法載體NTi預測的分子量與變性SDS-PAGE凝膠電
我們比較通過算法載體NTi預測的分子量與變性SDS-PAGE凝膠電 泳遷移獲得的分子量。我們觀察到SDS-PAGE對酶分子量預測過高。凝 膠上顯示的發(fā)散的電泳譜帶的確表明了酶的高度糖基化(O和N糖基化)。 糖基化發(fā)生在正在表達的生物中的蛋白質加工過程中。繩狀青霉菌中abffi-l基因的表達情況分析繩狀青霉菌具有兩種編碼B型a-L-阿拉伯呋喃糖酶的基因abffi-l 和abffi-2基因。比較了這些基因在各種繩狀青霉菌培養(yǎng)條件下的表達情 況。在誘導纖維素分解的和半纖維素分解酶(M2型工業(yè)生長培養(yǎng)基)的 條件下和非生產條件下(基本的葡萄糖培養(yǎng)基MO)培養(yǎng)繩狀青霉菌。在生 長40h后，停止培養(yǎng)，回收菌絲，然后提取總RNA。通過測定260nm 和280nm處的吸光度(260/280比率〉1.8),評價RNA的數量和質量。 在兩種各自的條件下(MO和M2),通過實時定量PCR定量編碼B型阿拉 伯呋喃糖酶(ABFB-1和ABFB-2)活性的轉錄物水平。在兩種條件下以編碼繩狀青霉菌微管蛋白(tub-l)的基因作為對照。該 基因編碼對細胞完整性必需的結構蛋白。通常將這個基因用作對照基因 是因為不管應用何種培養(yǎng)條件(普遍存在的)，其表達水平不變。為每種基因(abffi-l、 abffi-2和tub-l)設計用于定量PCR的特異引物。 在兩種生長條件(MO和M2)下，逆轉錄2|iig總RNA。為了確定用于擴 增目的基因的最佳條件(定量PCR法的限制以及這些引物對的效率)，連 續(xù)稀釋來自逆轉錄的互補DNA。標準化的結果如表2和圖4所示。
<formula>formula see original document page 22</formula>表2: abfB-1和abffi-2基因的差異表達值為繩狀青霉菌生長條件的函數編碼分解纖維素的和半分解纖維素活性的基因的轉錄調控已有描 述。這些基因的表達易受培養(yǎng)微生物的碳和氮源的性質和/或復雜性的影 響。已報道在葡萄糖存在時這些基因的轉錄受到高度抑制。此調控通過 分解代謝阻遏蛋白CreA完成，所述CreA特異地與這些基因的啟動子結 合并阻斷其轉錄。在我們通過PCR定量abffi-1和abffi-2信使的試驗中， 這兩種基因在葡萄糖(MO)條件下的表達水平非常低。這與文獻一致，因纖維素的底物)i有基礎表達水平。在mo、條件下:得的結果與:獻'一致:就abffi-1基因的表達而言，觀察到比MO條件下獲得的基底水平高107 倍的誘導因子，而abfb-2基因并未過表達。
權利要求
1.適用于動物營養(yǎng)的多肽，特征在于其包括一種選自以下多肽的多肽-SEQ ID No.2的多肽，-序列介于SEQ ID No.2的位置28和位置507之間的多肽，-SEQ ID No.2的多肽片段，具有α-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性，-一種多肽，其具有α-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性，且顯示與SEQ IDNo.2的多肽至少90％的同一性。
2. 編碼a-L-阿拉伯吹喃糖酶B活性的多核香酸，其特征在于其選 自以下多核苦酸-序列包括在SEQ ID No. 1的位置845與位置2368之間的多核苷酸，-序列包括在SEQ ID No. 1的位置927與位置2368之間的多核苷酸，-編碼根據權利要求1的多肽的多核苷酸。
3. 多核苷酸，特4正在于其具有SEQ ID No. 1的序列或與SEQ ID No. 1互補的序列。
4. 表達盒，特征在于在轉錄方向上包括 -在宿主生物中有功能的啟動子； -根據權利要求2的多核苷酸；以及 -相同宿主生物中的終止序列。
5. 包括根據權利要求2-3中任一項的多核苷酸和/或根據權利要求4 的表達盒的載體。
6. 用根據權利要求2-3中任一項的多核苷酸、根據權利要求4的表 達盒和/或根據權利要求5的載體轉化的宿主生物。
7. 根據權利要求6的宿主生物，特征在于宿主生物選自酵母和絲狀真菌。
8. 根據權利要求7的宿主生物，特征在于其為繩狀青霉菌株。
9. 動物用營養(yǎng)添加物，特征在于其包含根據權利要求l的多肽。
10. 動物用營養(yǎng)添加物，特征在于其包含根據權利要求6-8中任一 項的宿主生物和/或根據權利要求6-8中任一項的宿主生物的發(fā)酵液。
11. 根據權利要求9-10中任一項的動物營養(yǎng)添加物，特征在于其為 液體形式或粉末形式。
12. 飼料，特征在于其包含動物用營養(yǎng)基質和根據權利要求9-11 中任一項的動物用營養(yǎng)添加物。
13. 根據權利要求1的多肽或根據權利要求6-8中任一項的宿主生 物用于制備動物用營養(yǎng)添加物或飼料的用途。
14. 根據權利要求1的多肽或根據權利要求6-8中任一項的宿主生 物用于水解阿拉伯呋喃J氐聚糖化合物的ot-L-阿拉伯呋喃糖4囊的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼B型α-L-阿拉伯呋喃糖酶的繩狀青霉菌abfB-1基因。該α-L-阿拉伯呋喃糖酶可以摻入用于動物的營養(yǎng)添加物或食品中，因為其促進可消化性并從而促進營養(yǎng)價值。
文檔編號C12N15/56GK101171336SQ200680015044
公開日2008年4月30日 申請日期2006年5月3日 優(yōu)先權日2005年5月4日
發(fā)明者奧里佛·圖拉斯, 奧里佛·諾爾, 讓-瑪麗·弗朗索瓦, 讓-路克·帕羅 申請人:安迪蘇法國聯(lián)合股份有限公司