專利名稱：：繩狀青霉菌的abfB-2基因的制作方法繩狀青霉菌的abffi-2基因本發(fā)明涉及自繩狀青霉菌(Penicilliumfuniculosum)分離的abffi-2基因及由該基因編碼的具有a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的ABFB-2多肽。繩狀青霉菌為踝節(jié)菌屬(Talaromyces),屬于Aspergilleae科。該微生物從許多易受空氣或水污染的有機(jī)基質(zhì)中分離，表明該真菌具有含量豐富的水解酶。這種酶混合物在動(dòng)物飼料中的使用有助于解聚天然有機(jī)物，且可能改善其可消化性。因此W099/57325描述了稱為IMI378536的產(chǎn)生酶混合物的繩狀青霉菌林，這些酶特別適用作動(dòng)物祠料。然而，繩狀青霉菌產(chǎn)生的酶混合物尚未作重要的生化定性。的確，對(duì)獲得的發(fā)酵液通常僅測(cè)得有限量的酶活性，如木聚糖酶和p-葡聚糖酶。這些活性僅反映了混合物中的一部分酶類。農(nóng)業(yè)上的半分解纖維素化合物構(gòu)成了繼植物組織纖維素之后的第二大多糖儲(chǔ)備物。該類特征是具有多種多樣的雜多糖，主要代表有木聚糖、阿拉伯聚糖、半乳聚糖、葡聚糖和甘露聚糖。糠醛形式的阿拉伯糖廣泛存在于雜多糖，如阿拉伯聚糖和阿拉伯木聚糖中。阿拉伯聚糖為聚合物，以a-l-5鍵與阿拉伯呋喃糖殘基相連接，可在0-2或0-3位被1或2個(gè)阿拉伯糖殘基取代。至于阿拉伯木聚糖，a-L-阿拉伯呋喃糖殘基通過(guò)a-l-3和oc-l-2鍵與主要的(3-l-4-吡喃木糖鏈連接。在這些側(cè)鏈上阿拉伯糖殘基的存在可限制許多工業(yè)應(yīng)用(如增強(qiáng)動(dòng)物飼料可消化性)中的半分解纖維素化合物的酶水解作用。裂解a-L-阿拉伯呋喃糖苷鍵的酶可與木聚糖酶協(xié)作，以允許阿拉伯木聚糖和阿拉伯聚糖的水解。因此，阿拉伯糖酶活性(內(nèi)切，外切阿拉伯糖酶以及,主要是a-L-阿拉伯呋喃糖酶活性)可積極協(xié)同木聚糖酶有助于半分解纖維素化合物的解聚。半分解纖維素化合物和果膠化合物可代表植物中高達(dá)50%的總糖，它們構(gòu)成動(dòng)物的主要能源。這些化合物可消化性的增強(qiáng)與半分解纖維素化合物中阿拉伯糖殘基取代程度的降低有關(guān)(Brice，R.E.，Morrison,I.M.1982,Carbohydr.Res.101:93-100)。水解L-阿拉伯糖殘基之間鍵的酶已自微生物如細(xì)菌或絲狀真菌中分離。阿拉伯糖苷酶主要由oc-L-阿拉伯呋喃糖酶(EC3.2.1.55)組成，該酶能水解來(lái)自L-阿拉伯木聚糖或(如阿拉伯聚糖和阿拉伯半乳聚糖的)化合物的非還原性的a-L-阿拉伯呋喃糖殘基。根據(jù)它們的蛋白質(zhì)序列相似性，已將a-L-阿拉伯呋喃糖酶(EC3.2.1.55)分為兩個(gè)糖苷水解酶的家族(GH51和GH54)。這兩個(gè)家族因其對(duì)包含于多糖中底物的特異性而不同。第一族(GH51)包含A型阿拉伯呋喃糖酶，該酶僅對(duì)a-l-5連接的小線性結(jié)構(gòu)阿拉伯吹喃低聚糖起作用。第二族由B型阿拉伯呋喃糖酶(GH54)組成，該酶催化阿拉伯吹喃低聚糖化合物側(cè)鏈的ot-l,5、a畫l,3和a陽(yáng)1,2鍵的水解。已自許多細(xì)菌及絲狀真菌中將B型阿拉伯呋喃糖酶(ABFB)分離。曲霉屬(Aspergillus)最具代表性，但也已將它們自木霉屬(Trichoderma),青霉菌屬(Penicillium)和鐮孢菌屬(Fusarium)中分離。WO96/29416、WO96/06935和US5,989,887描述黑曲霉(Aspergillusniger)阿拉伯呋喃糖酶基因。Gielkensetal.(Microbiology,145，735-741,1999)已描述了構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)abffi基因。WO96/29416、WO96/06935、WO2004/018662和US5,989,887描述黑曲霉阿拉伯呋喃糖酶基因。蛋白質(zhì)序列對(duì)比顯示黑曲霉abffi蛋白與繩狀青霉素(P.funiculosum)ABFB-2蛋白的同一性為50.9。/o。這些申請(qǐng)沒(méi)有描述任何一種多肽在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中應(yīng)用所必需的特征。Clincheetal.(J.Agric.FoodChem.,45,2379-2383,1997)已描述三種來(lái)自土曲霉(Aspergillusterreus)的可能用于釀酒的a-L-阿拉伯呋喃糖酶。白曲霉(Aspergilluskawachii)和泡盛曲霉(Aspergillusawamori)的abffi基因已尋皮Kosekietal.4^述(J.ofBioscience禾口Bioengineering,Vol.96,No.3,232-241,2003)。這些酶在日本酒shochu的發(fā)酵中具有應(yīng)用。來(lái)自絲狀真菌里氏木霉(Trichodermareesei)的abffi基因已被Margolles-Clarketal.描述(AppliedandEnvironmentalMicrobiology,3840-3846,1996)。Panagiotouetal.也已描述了兩種來(lái)自尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)的細(xì)胞外ce-L-阿拉伯呋喃糖酶(CanJMicrobiol.2003:49(10):639-4)。Carvalloetal.(Mycol.Res"107(4),388-394,2003)已描述了來(lái)自產(chǎn)紫青霉菌(Penicilliumpurpurogenum)的B型a-L-阿拉伯呔喃糖酶。蛋白質(zhì)序列比對(duì)顯示產(chǎn)紫青霉菌abf-1蛋白與繩狀青霉菌ABFB-2蛋白的同一性為51.2%。此文沒(méi)有描述任何一種多肽在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)應(yīng)用中所必需的特征。然而，Sakamotoetal,(FEBSLetters560，199-204,2004)已描述了產(chǎn)黃青霉菌(Penicilliumchrysogenum)abnx基因，其仍編碼與ABFB活性不同的阿拉伯糖酶活性。然而，這些ABFB酶不具備應(yīng)用于動(dòng)物祠料所需的最適特性。的確，為了可用于動(dòng)物銅料，ABFB必須具有與處理相容的特性，可預(yù)期用于該伺料的飼料接受所述處理。特別是，所用酶的活性在處理溫度和pH條件下必須穩(wěn)定，而且，如果可能，其在制備這些伺料的過(guò)程中以及在消化這些飼料的動(dòng)物消化系統(tǒng)中的條件下是最佳的。此外，這些酶必須對(duì)雜多糖(阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖)具有廣語(yǔ)作用(去除分支)，以有效增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)飼料的可消化性。增強(qiáng)飼料可消化性可能提高它們的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。因此，對(duì)天然底物阿拉伯木聚糖和阿拉伯聚糖具有增強(qiáng)的的特異性(立體特異性、對(duì)映選擇性)、活性或親和力的酶對(duì)于動(dòng)物飼料非常重要。此外，在水解阿拉伯呋喃糖鍵之前，完全有必要預(yù)先解聚復(fù)合物分子如纖維素。真菌的纖維素分解酶(纖維素酶)通常具有fCDB結(jié)構(gòu)域(真菌型纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域)，該結(jié)構(gòu)域在纖維素的解聚中起主要作用。本發(fā)明描述了一種適用于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)的繩狀青霉菌L-阿拉伯呋喃糖酶B(ABFB-2)，及編碼該酶的基因。本發(fā)明還涉及保留相同催化特性的ABFB-2的同系物、變異體和片^:。有利的是，根據(jù)本發(fā)明的ABFB酶具有極酸的最適pH(pH2.6)，且在pH1.5時(shí)保持其55%的活性。有利的是，ABFB-2酶具有真菌型纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(fCBD)。已見(jiàn)這種類型的結(jié)構(gòu)域描述于其它酶中，但未見(jiàn)對(duì)真菌的阿拉伯呋喃糖酶進(jìn)行描述。已可能通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)繩狀青霉菌ABFB-2酶的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的功能。該結(jié)合結(jié)構(gòu)域的存在增加酶對(duì)其底物的親和性，從而可能增強(qiáng)對(duì)不能溶解的纖維素的降解。因此，由于其對(duì)纖維素的催化特性和親和性，因此繩狀青霉菌ABFB-2特別適用于動(dòng)物飼料。然而，根據(jù)本發(fā)明的酶也具有其它工業(yè)或工農(nóng)業(yè)用途。特別值得一提的是通過(guò)發(fā)酵處理果汁、造紙、將半分解纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)槿剂匣蚧瘜W(xué)制品、造酒。序列描述SEOIDNo.1:繩狀青霉菌abffi-2基因的基因組序列。SEQIDNo.2:具有B型a-L-阿拉伯呋喃糖酶活性的繩狀青霉菌ABFB-2多肽的序列。SEOIDNo.3:繩狀青霉菌ABFB-2的fCBD結(jié)構(gòu)域。SEOIDNo.4:繩狀青霉菌ABFB-2的低復(fù)雜性結(jié)構(gòu)域。SEQIDNo.5:繩狀青霉菌藍(lán)色復(fù)合體酯酶(cyanomylesterase)fCBD結(jié)構(gòu)域。SEOIDNo.6:繩狀青霉菌1,4-D-木聚糖內(nèi)切酶的fCBD結(jié)構(gòu)域。SEOIDNo.7:繩狀青霉菌木聚糖酶纖維生物水解酶的fCBD結(jié)構(gòu)域。SEQIDNo.8:XbaI-abfB-2PCR引物。SEOIDNo.9:HindIII-abfB-2PCR引物。發(fā)明描述本發(fā)明涉及一種多肽，其包括一種選自以下多肽的多肽-SEQIDNo.2的多肽，-序列介于SEQIDNo.2的位置28和位置400之間的多肽，-SEQIDNo.2的多肽片段，其具有a-L-阿拉伯吹喃糖酶B活性，畫一種多肽，其具有a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性且顯示與SEQIDNo.2的多肽具有至少80%的同一性。本發(fā)明還涉及多核苷酸，其編碼oc-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性，選自以下多核苷酸-序列包括在SEQIDNo.1的位置268與位置1470之間的多核苷酸，-序列包括在SEQIDNo.1的位置349與位置1470之間的多核苷酸，-編碼根據(jù)權(quán)利要求1的多肽的多核苷酸。本發(fā)明的另一個(gè)對(duì)象為一種多核苷酸，其具有SEQIDNo.1代表的序列或與SEQIDNo.1互補(bǔ)的序列。本發(fā)明還涉及表達(dá)盒，其在轉(zhuǎn)錄方向上包含-在宿主生物中有功能的啟動(dòng)子；-根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸；以及-在相同宿主生物中有功能的終止序列。本發(fā)明另一個(gè)對(duì)象為載體，其包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸和/或根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒。本發(fā)明還涉及宿主生物，該生物被根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸、根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒和/或根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化。在在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，宿主生物選自酵母和絲狀真菌。優(yōu)選地，宿主生物為繩狀青霉菌抹。本發(fā)明還涉及動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)添加物，包括根據(jù)本發(fā)明的多肽、根據(jù)本發(fā)明的宿主生物或根據(jù)本發(fā)明的宿主生物的發(fā)酵液。優(yōu)選地，該營(yíng)養(yǎng)添加物為液體形式或4分末形式。本發(fā)明的另一方面為伺料，其包含根據(jù)本發(fā)明的動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)添力o物。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的ABFB多肽或根據(jù)本發(fā)明的宿主生物用于制備動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)添加物或飼料營(yíng)養(yǎng)添加物的用途。本發(fā)明的另一個(gè)對(duì)象是根據(jù)本發(fā)明的ABFB多肽或根據(jù)本發(fā)明的宿主生物用于水解阿拉伯呋喃低聚糖化合物的a-L-阿拉伯呋喃糖鍵的用途。多肽本發(fā)明因此涉及具有a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的ABFB多肽。優(yōu)選地，將這些多肽分離自繩狀青霉菌。表述"a-L-阿拉伯呋喃糖酶B"應(yīng)纟皮理解為a-L-阿拉伯呋喃糖酶(EC3.2丄55)B型(GH54)，其催化包含于阿拉伯呋喃低聚糖化合物側(cè)鏈的a-l，5、a-l,3和a-l,24建的水解。本發(fā)明的多肽適用于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)。表述"適用于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)的多肽"應(yīng)被理解為其特征使得其適于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)的多肽。用于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)必需的特征特別為pH及溫度，在此pH及溫度下酶具有活性。的確，動(dòng)物消化系統(tǒng)的pH為酸性，因此酶在此pH時(shí)必須保持活性，這是為了在L-阿拉伯糖殘基的水解中保持其活性。此外，控制營(yíng)養(yǎng)添加物或動(dòng)物飼料中的酶的條件包括處理及高于室溫的溫度。所用的酶活性因此必須在處理?xiàng)l件下，特別是在所述溫度條件下穩(wěn)定。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，多肽在酸性pH時(shí)，例如低于4.5,優(yōu)選低于4時(shí)顯示a-L-阿拉伯呋喃糖酶活性。而且，才艮據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案,多肽在pH1.5與pH3.5之間時(shí)顯示最佳的a-L-阿拉伯呋喃糖酶活性。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，多肽在高于室溫的溫度時(shí)顯示a-L-阿拉伯呋喃糖酶活性。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽在30。C與70°C之間，更優(yōu)選40°C與60°C之間的溫度下具有最佳的a-L-阿拉伯呋喃糖酶活性。繩狀青霉菌沖朱IMI378536的a-L-阿拉伯呋喃糖酶B如SEQIDNo.2所示。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將根據(jù)本發(fā)明的多肽糖基化。特別是，SEQIDNo.2的多肽在氨基酸123和氨基酸127處具有N-糖基化位點(diǎn)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將SEQIDNo.2多肽的位置123和127處的天冬酰胺殘基糖基化。繩狀青霉菌的a-L-阿拉伯呋喃糖酶B是由真菌分泌到其細(xì)胞外環(huán)境的酶。SEQIDNo.2的多肽因此包括27個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。本發(fā)明的對(duì)象還為裂解信號(hào)肽后獲得的成熟多肽。特別是，本發(fā)明涉及序列介于SEQIDNo.2的位置28與位置400之間的多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，SEQIDNo.2多肽的信號(hào)肽可被異源信號(hào)肽取代，用于由異源宿主生物表達(dá)和分泌SEQIDNo.2的多肽。本發(fā)明還涉及具有a-L-阿拉伯呋響糖酶B活性的SEQIDNo.2的多肽的片段。術(shù)語(yǔ)多肽的"片^a"指下述多肽，所述多肽包括其所來(lái)源的多肽的一部分而不是全部。因此，本發(fā)明涉及一種多肽，其包括SEQIDNo.2多肽的至少100、200或300個(gè)氨基酸的片段。SEQIDNo.2的多肽的這一片段保持其a-L-阿拉伯^^喃糖酶活性。本發(fā)明因此涉及SEQIDNo.2的多肽的生物學(xué)活性片段。術(shù)語(yǔ)"生物學(xué)活性片段"指保持其所來(lái)源的多肽的功能的多肽片段。SEQIDNo.2的多肽的生物學(xué)活性片段因此保持繩狀青霉菌ABFB-2多肽的功能。這些生物學(xué)活性片段具有ot-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的ABFB片段具有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有SEQIDNo.3中描述的序列。優(yōu)選地，這些片段在pH2.6時(shí)顯示最佳a(bǔ)-L-阿拉伯呋喃糖酶活性。制備多肽片段的方法和測(cè)定a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。本發(fā)明的對(duì)象還為多肽，其具有L-阿拉伯呋喃糖酶B活性且顯示與SEQIDNo.2的多肽至少90%的同一性。優(yōu)選地，這些多肽具有與SEQIDNo.2的多肽相同的特性，特別是相同的催化特性。優(yōu)選地，這些多肽分離自繩狀青霉菌的其它株或其它絲狀真菌?；蛘撸@些多肽可通過(guò)例如定點(diǎn)誘變技術(shù)獲得。本發(fā)明的對(duì)象為具有與SEQIDNo.2的多肽至少80%，90%,95%,98%以及優(yōu)選至少99%相同的氨基酸的多肽。將表述相同的氨基酸理解為兩條序列之間不變的或無(wú)變化的氨基酸。這些多肽與SEQIDNo.2的多肽相比可顯示至少一個(gè)氨基酸的缺失、增加或耳又代。本發(fā)明的對(duì)象還為多肽，其顯示與SEQIDNo.2的多肽的相似性為至少90%、95%、98%,以及優(yōu)選至少99%。將表述相似性理解為蛋白質(zhì)或核酸序列之間相似性的測(cè)量。這些多肽與SEQIDNo.2的多肽相比可顯示出至少一個(gè)氨基酸的缺失、增加或取代。以分?jǐn)?shù)定量的兩條序列之間的相似程度基于序列同一性和/或序列保守取代的百分比。測(cè)量和鑒別多肽之間的相同程度和相似程度的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知?？墒褂美巛d體NTi9.1.0，比對(duì)程序AlignX(聚類w算法(ClustalWalgorithm))(InvitrogenINFORMAX,http:〃www.invitrogen.com)。優(yōu)選地，使用默認(rèn)參數(shù)。將根據(jù)本發(fā)明的多肽自其自然環(huán)境分離或純化。多肽可通過(guò)各種方法制備。特別是，這些方法是從自然來(lái)源(如天然表達(dá)這些多肽的細(xì)胞)中純化、通過(guò)合適的宿主細(xì)胞生產(chǎn)重組的多肽及其隨后的純化、通過(guò)化學(xué)合成的生產(chǎn)或，最后，這些不同途徑的組合。這些不同生產(chǎn)方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。因此，可將本發(fā)明的ABFB多肽自繩狀青霉菌分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的ABFB多肽自表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的ABFB多肽的重組宿主生物中分離。本發(fā)明的對(duì)象還為融合蛋白、重組蛋白或嵌合蛋白，包括根據(jù)本發(fā)明的多肽。術(shù)語(yǔ)"多肽"也指被修飾的蛋白質(zhì)和多肽。才艮據(jù)本發(fā)明的多肽具有ABFB活性。優(yōu)選地，才艮據(jù)本發(fā)明的多肽具有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有SEQIDNo.3中描述的序列。優(yōu)選地，多肽在pH2.6時(shí)顯示最佳a(bǔ)-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。優(yōu)選地，多肽在50°C時(shí)顯示最佳a(bǔ)-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。多核苦酸本發(fā)明還涉及編碼a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的多核苦酸。優(yōu)選地，這些多核香酸編碼繩狀青霉菌a-L-阿拉伯呋喃糖酶B。根據(jù)本發(fā)明，表述"多核苷酸"理解為單鏈核苦酸鏈或其互補(bǔ)DNA或RNA鏈，或可為互補(bǔ)或基因組DNA型的雙鏈核芬酸鏈。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸為DNA型，特別是雙鏈DNA。術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"也指被修飾的多核普酸。可將本發(fā)明的多核苷酸自其自然環(huán)境分離或純化。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸可通過(guò)Sambrooketal描述的常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)(MolecularCloning:ALaboratoryManual,1989)或通過(guò)化學(xué)合成制備。在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及多核苷酸，其序列介于SEQIDNo.1的位置268與位置1470之間。該多核苷酸編碼SEQIDNo.2的繩狀青霉菌ABFB-2酶。在第二個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及多核苷酸，其序列介于SEQIDNo.1的位置349與位置1470之間。該多核香酸編碼繩狀青霉菌信號(hào)肽裂解后的成熟的ABFB-2多肽。本發(fā)明還涉及多核苷酸，其與序列介于SEQIDNo.1的位置268與位置1470之間的多核苦酸和/或與序列介于SEQIDNo.1的位置349與位置1470之間的多核苷酸具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%，優(yōu)選地至少99%的同一性。這些多核苦酸編碼a-L-阿拉伯吹喃糖酶B活性。優(yōu)選地，這些多核苷酸編碼繩狀青霉菌ot-L-阿拉伯呋喃糖酶B。表述相同的核苷酸理解為表示兩個(gè)核苷酸序列不變或無(wú)變化。這些多核苷酸與對(duì)照多核苷酸相比顯示出至少一個(gè)核苷酸的缺失、增加或取代。本發(fā)明還涉及多核苷酸，其與序列介于SEQIDNo.1的位置268與位置1470之間的多核苷酸和/或與序列介于SEQIDNo.1的位置349與位置1470之間的多核苦酸具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%，優(yōu)選至少99%的相似性。這些多核苦酸編碼a-L-阿拉伯p^喃糖酶B活性。優(yōu)選地，這些多核苦酸編碼繩狀青霉菌a-L-阿拉伯吹喃糖酶B。表述相似性理解為蛋白質(zhì)或核酸序列之間相同之處的測(cè)量。這些多核苷酸與對(duì)照多核苦酸相比可顯示出至少一個(gè)核苦酸的缺失、增加或取代。以分?jǐn)?shù)定量的兩條序列之間的相似程度基于序列同一性和/或序列保守取代的百分比。測(cè)量和鑒定核酸序列之間的相同程度和相似程度的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知?？墒褂美巛d體NTi載體NTi9.1.0,比對(duì)程序AlignX(聚類w算法)(InvitrogenINFORMAX，http:〃www.invitrogen.com)。優(yōu)選地，使用默認(rèn)參數(shù)。優(yōu)選地，與對(duì)照多核普酸具有相似程度的多核苷酸保持對(duì)照序列的功能。在本文情況下，多核苷酸編碼a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。本發(fā)明還涉及多核苷酸，其能與序列介于SEQIDNo.1的位置268與位置1470之間的多核苷酸和/或與序列介于SEQIDNo.1的位置349與位置1470之間的多核苷酸選擇性雜交。優(yōu)選地，將選擇性雜交在一般嚴(yán)格性條件下完成，優(yōu)選在高嚴(yán)格性條件下完成。這些多核苷酸編碼a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。優(yōu)選地，這些多核苦酸編碼繩狀青霉菌ot-L-阿拉伯呋喃^f唐酶B。表述"能選擇性雜交的序列"被理解為，根據(jù)本發(fā)明，在明顯高于背景噪音的水平上與對(duì)照序列雜交的序列。由能選擇性雜交的序列與對(duì)照序列之間的相互作用產(chǎn)生的信號(hào)水平比產(chǎn)生背景噪音的其它DNA序列的相互作用的信號(hào)水平強(qiáng)，通常強(qiáng)10倍，優(yōu)選強(qiáng)100倍。允許選擇性雜交的嚴(yán)格雜交條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。通常，在給定pH和給定離子強(qiáng)度下，雜交和洗滌溫度比對(duì)照序列的Tm至少低5°C。通常，用于15至50個(gè)核苷酸的多核苷酸的雜交溫度至少為30°C，用于多于50個(gè)核苷酸的多核苷酸的雜交溫度至少為60。C。舉例說(shuō)明，將雜交在以下緩沖液中完成6xSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、1mMEDTA、0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.02%BSA、500pg/ml變性鮭魚精子DNA。例如在低嚴(yán)招^性的2xSSC、0.1%SDS緩沖液中，一般嚴(yán)才各性的0.5xSSC、0.1%SDS緩沖液中以及高嚴(yán)格性的O.lxSSC、0.1%SDS緩沖液中成功地完成洗滌。當(dāng)然，可將雜交根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其它常用方法完成(特別參見(jiàn)Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,1989)。優(yōu)選地，與對(duì)照多核脊酸選擇性雜交的多核苷酸保持對(duì)照序列的功能。在本文情況下，多核苷酸編碼oc-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性，其與序列介于SEQIDNo.1的位置268與位置1470之間的多核苦酸和/或與序列介于SEQIDNo.1的位置349與位置1470之間的多核芬酸選擇性雜交。本發(fā)明通常涉及編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的多核苷酸。由于遺傳密碼的筒并，不同多核苷酸可編碼相同的多肽。本發(fā)明的另一對(duì)象為序列如SEQIDNo.1所示的多核苷酸。SEQIDNo.1的多核苦酸包括位于繩狀青霉菌abffi-2基因開放讀碼框(ORF)側(cè)翼的序列。特別是，它們是abffi-2基因的啟動(dòng)子和終止序列?？蓪bffi基因從其同源調(diào)控序列表達(dá)，特別是在繩狀青霉菌中或其它絲狀真菌中過(guò)表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，例如可將abffi基因在各種宿主生物如細(xì)菌、酵母和真菌中表達(dá)。在本發(fā)明的SEQIDNo.1的啟動(dòng)子控制下或在異源啟動(dòng)子的控制下，可將abffi基因在宿主生物中表達(dá)。表達(dá)盒根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的克隆技術(shù)，將編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的多核苷酸插入表達(dá)盒。該表達(dá)盒包括轉(zhuǎn)錄和翻譯編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的序列所必需的元件。有利的是，該表達(dá)盒既包括可能引起宿主細(xì)胞產(chǎn)生多肽的元件，也包括調(diào)節(jié)該表達(dá)所必需的元件。這些表達(dá)盒在轉(zhuǎn)錄方向上包含-在宿主生物中有功能的啟動(dòng)子；-根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸；-在相同宿主生物中有功能的終止序列?？蓪⑷魏晤愋偷膯?dòng)子序列用于根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒中。特別是，子允許組成型表達(dá)，而其它啟動(dòng)子則相反為誘導(dǎo)型。在真菌中有功能的啟動(dòng)子中，可特別提到構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)甘油醛-3-磷酸脫氫酶的啟動(dòng)子(Robertsetal.,Current基因t.15:177-180,1989)。在細(xì)菌中有功能的啟動(dòng)子中，可特別提到T7噬箇體RNA聚合酶的啟動(dòng)子(Studieretal.,Methodsinenzymology185:60-89，1990)。在酵母中有功能的啟動(dòng)子中，可提到GAL1基因(Elledgeetal.，ProcNatlAcadSciences,USA.88:1731-1735,1991)或釀酒酵母(S.cerevisiae)GAL4的啟動(dòng)子以及ADH啟動(dòng)子。所有這些啟動(dòng)子已有文獻(xiàn)描述，且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。將選擇表達(dá)盒用于繩狀青霉菌中的表達(dá)，所述表達(dá)盒例如包括組蛋白H4.B啟動(dòng)子、天冬氨酸蛋白酶啟動(dòng)子或csl13啟動(dòng)子(WO00/68401)。根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒可額外包括多肽或多核苷酸表達(dá)所必需的任何其它序列，例如允許分泌宿主生物產(chǎn)生的多肽的調(diào)控元件或信號(hào)序列。特別是，可能使用任何調(diào)控序列，所述調(diào)控序列可能提高插入到表達(dá)盒中的編碼序列的表達(dá)水平。特別地，根據(jù)本發(fā)明，可與調(diào)控啟動(dòng)子序列組合使用其它調(diào)控序列，這些調(diào)控序列位于啟動(dòng)子與編碼序列如轉(zhuǎn)錄激活子("增強(qiáng)子")之間?？蓪⒏鞣N各樣的終止序列用于根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒中，這些序列可終止轉(zhuǎn)錄及mRNA的多腺苷酸化?？墒褂迷谒x宿主生物中有功能的任何終止序列。將選擇表達(dá)盒用于在繩狀青霉菌中的表達(dá)，所述表達(dá)盒例如包括組蛋白H4.B終止子、天冬氨酸蛋白酶終止子或csl13終止子的(WO00/68401)。本發(fā)明的對(duì)象還為包含根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒的多核苷酸，有利的是將根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒插入載體。載體本發(fā)明因此還涉及復(fù)制或表達(dá)載體，所述載體用于轉(zhuǎn)化包含至少一個(gè)多核苷酸或一個(gè)根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒的宿主生物。特別是，該載體可對(duì)應(yīng)為已插入根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸或表達(dá)盒的質(zhì)粒、粘粒、噬箇體或病毒。構(gòu)建這些載體和將本發(fā)明多核苷酸插入這些載體的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。通常，可能使用在宿主細(xì)胞中能保持自身、自主復(fù)制或增殖的任何載體，以特別誘導(dǎo)多核苷酸或多肽的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將根據(jù)待轉(zhuǎn)化的宿主生物和根據(jù)所用的轉(zhuǎn)化技術(shù)選擇合適的載體。特別是，將本發(fā)明的載體用于轉(zhuǎn)化宿主生物，用于在宿主生物中復(fù)制載體和/或表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的多肽。本發(fā)明還涉及制備根據(jù)本發(fā)明的多肽的方法，該方法包括以下步驟核普酸轉(zhuǎn)化宿主生物，-分離宿主生物產(chǎn)生的多肽。宿主生物本發(fā)明的對(duì)象還為轉(zhuǎn)化宿主生物的方法，所述方法通過(guò)將至少一個(gè)根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸或表達(dá)盒或載體整合入所述宿主生物來(lái)完成。可將多核苷酸整合入宿主生物的基因組，或多核苷酸能在宿主生物中穩(wěn)定4艮好地描述。本發(fā)明還涉及一種宿主生物，其可被根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸、表達(dá)盒或載體轉(zhuǎn)化。特別是，根據(jù)本發(fā)明，表述宿主生物理解為選自細(xì)菌、酵母和真菌的任何單或多細(xì)胞、低等或高等的生物。表述宿主生物理解為非人生物。有利的是，酵母選自畢赤酵母(Pichiapastoris)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisae)、Yarrowialipolytica和Schwanniomycesoccidentalis。真菌選自曲霉(Aspergillus)和青霉菌(Penicillium),優(yōu)選選自纟i^大青霉菌、Trichodermareesei、黑曲霉(Aspergillusniger)、；包盛曲霉(Aspergillusawamori)、白曲霉(Aspergilluskawachii)和Trichodermakoningii。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主生物為繩狀青霉菌株，其中根據(jù)本發(fā)明的ABFB多肽被表達(dá)或過(guò)表達(dá)。在這些生物中，用于構(gòu)建載體、轉(zhuǎn)化宿主生物和表達(dá)異源蛋白質(zhì)的技術(shù)被廣泛描述于文獻(xiàn)中(AusubelF.M.etal.，"CurrentProtocolsinMolecularBiology"Volumes1和2,GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience，1989;T.Maniatis,E.F.Fritsch，J.Sambrook，MolecularCloningAlaboratoryHandbook,1982)。食品添加劑和銅料本發(fā)明因此涉及提供oc-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的食品添加劑。攝入這種類型酶活性可能增強(qiáng)食品的可消化性并提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。表述營(yíng)養(yǎng)添加物理解為有意地、通常以小量添加至食品以改善其可消化性或營(yíng)養(yǎng)特性的物質(zhì)。用于動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)添加物可包含例如維生素、無(wú)機(jī)鹽、氨基酸和酶。通常，用于動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)添加物包括根據(jù)本發(fā)明的多肽,根據(jù)本發(fā)明的宿主生物或根據(jù)本發(fā)明的宿主生物的發(fā)酵液。因此，可將具有根據(jù)本發(fā)明的a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的多肽自繩狀青霉菌林或自用于制備動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)添加物的重組宿主生物中純化或分離?；蛘?，可將繩狀青霉菌株或產(chǎn)生Abffi多肽的宿主生物直接用于制備動(dòng)物用營(yíng)養(yǎng)添加物。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，將繩狀青霉菌株或根據(jù)本發(fā)明的宿主生物的培養(yǎng)上清液或發(fā)酵液用于制備動(dòng)物用營(yíng)養(yǎng)添加物。當(dāng)將ABFB多肽通過(guò)繩狀青霉菌抹或宿主生物分泌時(shí)，該實(shí)施方案特別有利。通常，將該培養(yǎng)上清液濃縮或凍干以制備營(yíng)養(yǎng)添加物。因此，本發(fā)明還涉及制備ABFB酶的方法，該方法包括以下步驟a)在用于誘導(dǎo)ABFB表達(dá)的條件下培養(yǎng)繩狀青霉菌抹或根據(jù)本發(fā)明的^f皮轉(zhuǎn)化的宿主生物，b)分離包括ABFB酶的培養(yǎng)上清液。然后可將該培養(yǎng)上清液或發(fā)酵液濃縮或凍干以形成食品添加劑或飼料。如果宿主生物在培養(yǎng)基中不分泌ABFB酶，增加打開細(xì)胞并純化細(xì)胞提取物的步驟可能是必需的。本發(fā)明的營(yíng)養(yǎng)添加物包含a-L-阿拉伯吹喃糖酶B活性，但可能還包含其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如維生素、氨基酸或無(wú)機(jī)鹽。根據(jù)本發(fā)明的添加劑增加飼料的可消化性，因此特別有助于更好地增強(qiáng)基于谷類(小麥、大麥、玉米、燕麥、黑麥等)和基于油渣餅(大豆、向日葵、油菜籽等)的食物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)添加物的祠料。通常將這些祠料以膳食或顆粒形式提供，其中加入根據(jù)本發(fā)明的添加劑。表述祠料理解為可作為食物提供給動(dòng)物的任何事物。飼料包含根據(jù)本發(fā)明的多肽、根據(jù)本發(fā)明的宿主生物或根據(jù)本發(fā)明的宿主生物的發(fā)酵液。用于密集的動(dòng)物育種，這些祠料通常包含營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)添加物。表述營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)理解為構(gòu)成動(dòng)物飼料配給的主要部分的物質(zhì)，例如由谷類、蛋白和動(dòng)物和/或植物來(lái)源的脂肪的混合物組成。動(dòng)物用營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)適合用作這些動(dòng)物的食物，并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。通常，這些營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)包含例如玉米、小麥、豌豆和大豆。這些營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)適于它們所指定的各種動(dòng)物的需要。這些營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)可能已經(jīng)包含營(yíng)養(yǎng)添加物如維生素、無(wú)機(jī)鹽和氨基酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于單胃動(dòng)物，特別是用于家禽和豬的飼料。家禽特別包括蛋雞、broilers、火雞和鴨子。豬特別包括成豬和小豬。附圖1:真菌的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(fCBD)的組織圖。附圖2:在40°C下，存在5mMPNPAF時(shí)測(cè)定ABFB-2酶在Mcllvaine緩沖系列(pH2.2至8)中的最佳pH。附圖3:在5mMPNPAF存在下，測(cè)定在最佳pH時(shí)ABFB-2酶的最佳溫度。附圖4:當(dāng)PNPAF為0.5mM至5mM的范圍時(shí)，在pH2.6和50。C時(shí)，測(cè)定ABFB-2的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和Vm(1/Vi=f(1/S)。附圖5:根據(jù)繩狀青霉菌生長(zhǎng)情況評(píng)價(jià)abffi-l和abffi-2基因的差異表達(dá)。附圖6:反應(yīng)上清液中ABFB-2消失的動(dòng)力學(xué)。酶與細(xì)胞的結(jié)合通過(guò)測(cè)量ABFB-2的游離的殘余的a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性來(lái)監(jiān)控。實(shí)施例abffi-2基因的結(jié)構(gòu)分析雖然這些酶通常相當(dāng)保守，但ABFB-2顯示出與絲狀真菌的其它ABFB酶低于62%的同一性。通過(guò)鑒別兩個(gè)不同區(qū)域解釋這一同一性差異。在N-末端部分，對(duì)阿拉伯呋喃糖酶具有特異性的區(qū)域(IOaa—直到341aa)以及在C-末端區(qū)域，通過(guò)SMART(簡(jiǎn)單模塊構(gòu)架搜索工具)分析預(yù)域fCBD介于位置367與400aa之間。才艮據(jù)文獻(xiàn)，這種類型的結(jié)合結(jié)構(gòu)域通常在涉及纖維素降解的酶中發(fā)現(xiàn)，如葡聚糖內(nèi)切酶(EC3.2.1.4)、纖維生物水解酶(EC3.2.1.91)(葡聚糖外切酶)或木聚糖酶(EC3.2.1.8)。這是第一次發(fā)現(xiàn)阿拉伯呋喃糖酶的CBD結(jié)構(gòu)域。從結(jié)構(gòu)(初始序列)觀點(diǎn)來(lái)看，纖維素酶和木聚糖酶由兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成，即催化結(jié)構(gòu)域和CBD結(jié)構(gòu)域，通過(guò)富含脯氨酸和/或羥基化的氨基酸(絲氨酸和蘇氨酸)的所謂的低復(fù)雜性短序列相連。已在許多真菌的纖維素酶中研究過(guò)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，它們的特征在于高達(dá)36個(gè)氨基酸的序列，該序列存在于蛋白質(zhì)的N-末端(cbh-II或egl2)或C-末端(cbh-I、egll或egl5)。此外，這種類型的結(jié)構(gòu)域特征在于附圖1的4個(gè)半胱氨酸保守性，這可允許二硫鍵的形成。預(yù)測(cè)的繩狀青霉菌ABFB-2的fCBD結(jié)構(gòu)域由34個(gè)氨基酸組成(THWGQCGGSGYSGPTSCVAPYACTTANPYYAQCL)，包括4個(gè)保守的半胱氨酸。該結(jié)構(gòu)域之前為低復(fù)雜性的23個(gè)氨基酸的特征短序列(STSPGSHTTSTTLTTITSTTAVS)，其富含帶有羥基的氨基酸(10個(gè)蘇氨酸和6個(gè)絲氨酸)。在繩狀青霉菌中，這種類型的結(jié)構(gòu)域在其它三種酶1,4-木聚糖內(nèi)切酶、纖維生物水解酶和阿魏酸酯酶(藍(lán)色復(fù)合體酯酶)中已有描述。這四種結(jié)構(gòu)域的比對(duì)證實(shí)了fCBD中4個(gè)半胱氨酸的保守性及位置。繩狀青霉菌中已知fCBD的比對(duì)這種類型的結(jié)合結(jié)構(gòu)域在纖維素分解酶(纖維素酶)中已有廣泛地描述。使用blast比對(duì)工具分析fCBD的初始序列與已知的fCBD序列，鑒繩狀青霉菌ABFB—2藍(lán)色復(fù)合體酯^1，4-木聚糖內(nèi)切酶木聚糖酶纖維生物水解酶<367)T柳GQQ3QS鵬鵬TS'CV妙YAeETAN樹Y;AQCIf(320)卿恥C郎I:G蹈GCIT-ACASPyTCQ,咖SQCU《374)^RHW卿C啦咖SJ3蹈I鵬PXTCQVL期yyS卿定了I和II型纖維生物水解酶的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域與來(lái)源于Trichodermareesei和黑曲霉的I、II和V型葡聚糖內(nèi)切酶的結(jié)構(gòu)域具有非常高的同源性。已確定為對(duì)保持結(jié)構(gòu)域功能必需的3個(gè)酪氨酸殘基和天冬酰胺和谷氨酰胺殘基在ABFB-2序列中是保守的。結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系研究顯示，通過(guò)增加酶與其底物的結(jié)合親和力，這種類型的結(jié)構(gòu)域在纖維素的解聚中起主要作用(Linder,M.&Teeri,T.T.(1997)Therolesandfunctionofcellulose-bindingdomains,J.Biotechnol.5715-28)。在T.reesei中，纖維生物水解酶I(CBHI)在其fCBD結(jié)構(gòu)域缺失時(shí)顯示保守的催化活性，但酶與纖維素的結(jié)合親和力明顯降低。這是第一次在絲狀真菌的B型阿拉伯呋喃糖酶中鑒定出這種類型的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這種結(jié)合結(jié)構(gòu)域的存在提高酶與其底物的親和力，從而使得可能增強(qiáng)不溶纖維素的降解。L-阿拉伯呋喃糖酶B活性測(cè)定的發(fā)展在包含0.15%provasoy和0.3%纖維素的混合添加劑的M2培養(yǎng)基上將繩狀青霉菌培養(yǎng)40小時(shí)后，測(cè)定L-阿拉伯呋喃糖酶活性。在培養(yǎng)48小時(shí)和72小時(shí)時(shí)收集樣品。培養(yǎng)在200ml錐形瓶中完成，使用了50ml體積。通過(guò)在50mMpH5的乙酸鈉緩沖液中水解5mM對(duì)硝基苯基-(L-阿拉伯呋喃糖苷(PNPAF)測(cè)定活性。將50ial培養(yǎng)上清液與在50。C預(yù)熱的250pl底物孵育15分鐘。加入500fil0.5MNaOH停止反應(yīng)。在405nm處測(cè)定對(duì)硝基苯基(PNP)的釋放，使用的摩爾消光系數(shù)為17000M-l.cm-l。將酶單位定義為在上述條件下每分鐘水解1pmolPNPAF的酶的量。對(duì)于繩狀青霉菌培養(yǎng)物，在培養(yǎng)48h后我們獲得20mU.ml-l，在培養(yǎng)72h后獲得112mU.ml-1。這些結(jié)果與文獻(xiàn)一致，的確對(duì)于黑曲霉，才艮據(jù)培養(yǎng)中使用的誘導(dǎo)物，觀察到100至600mU.ml-l等級(jí)的活性?？寺±K狀青霉菌ab￡B-2ORF并轉(zhuǎn)化進(jìn)釀酒酵母中從繩狀青霉菌的基因組DNA開始，借助引物(Hindin-abffi-2/Xbal-abffi-2)通過(guò)PCR擴(kuò)增abfB-2基因。應(yīng)用以下PCR條件(94。C30sec;62。C30sec;在72。C1min30sec)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將1215bp的PCR產(chǎn)物克隆入商品化載體pGEM-T(tm)easy中。PCR引物對(duì)的序列XbaI-abfB-2:〉5，-TCTAGAATGACGTCCAAACATAGTT-3，<HindlII陽(yáng)abfB-2:>5，-AAGCTTCTAGAGACATTGAGCGTA-3，<將1215bp的HindlII/Xbal片|殳自載體pGEM-T切除，在HindlII/Xbal位點(diǎn)亞克隆入穿梭載體(placl95-PGK/CYCl)。對(duì)于異源表達(dá)，abffi-2基因因此受編碼磷酸甘油酸酯激酶(釀酒酵母)的基因的組成性PGK啟動(dòng)子和編碼細(xì)胞色素C氧化酶活性的基因的CYC1終止子(釀酒酵母)的控制。將新的表達(dá)載體稱為pOT-02。酉良酒酵母抹JF弁1194(CEN.PK113-5D)是來(lái)源于帶有ura3-52營(yíng)養(yǎng)缺陷型的CEN.PK122抹的克隆，以表達(dá)載體pOT-02轉(zhuǎn)化(乙酸鋰/熱激法)。在無(wú)尿嘧咬的選擇性平板(URA3標(biāo)記)上，以表型互補(bǔ)選擇轉(zhuǎn)化抹。選沖奪6個(gè)轉(zhuǎn)化^^朱以測(cè)試培養(yǎng)上清液中阿拉伯吹喃糖酶B活性的存在。在50ml無(wú)尿嘧啶的基本培養(yǎng)基(除野生型對(duì)照株外)中，將轉(zhuǎn)化抹培養(yǎng)24小時(shí)。以上文描述的方法測(cè)定培養(yǎng)上清液中的阿拉伯呋喃糖酶活性。最佳pH的確定將來(lái)源于繩狀青霉菌的編碼阿拉伯呋喃糖酶B活性的abffi-2基因克隆入釀酒酵母中。在幾個(gè)轉(zhuǎn)化林中檢查阿拉伯吹喃糖酶B活性的存在后，選4奪一種轉(zhuǎn)化4朱并在生長(zhǎng)24h后測(cè)定培養(yǎng)上清液中的ABFB活性。在200ml錐形瓶(工作體積50ml)中完成培養(yǎng)。在Mcllvaine緩沖系列(pH2.2至8.0)中存在5mMp-硝基苯基-oc-L-阿拉伯呋喃糖苷(PNPAF)時(shí)測(cè)定活性。將80^1培養(yǎng)上清液與在40。C預(yù)熱的320iil底物孵育10min。加入1ml1MNa2C03停止反應(yīng)。在405nm"處測(cè)定p-硝基苯基的釋放。將一個(gè)酶單位定義為每分鐘水解1pmolPNPAF的酶量。活性曲線如圖2所示。在pH2.6時(shí)ABFB-2具有最佳活性，并且在pH3.8時(shí)保持55。/。的活性。這是第一次觀察到阿拉伯呋喃糖酶的如此低的最佳pH，并且在pH1.5的50mHHCL溶液中具有68%的活性。最佳溫度的測(cè)定使用相同的流程，我們確定了ABFB-2活性的最佳溫度。在pH2.6的各個(gè)溫度下將酶在Mcllvaine緩沖液中孵育10min。活性曲線如圖3所示。ABFB的最佳溫度范圍已有文獻(xiàn)描述，介于40°C與60。C之間。繩狀青霉菌ABFB-2在50°C時(shí)具有最佳活性。如果選4奪酶的最佳pH和溫度(pH2.6和50°C)，則觀察到ABFB-2的活性為在pH5和40°C的乙酸鹽緩沖液中測(cè)定的活性的20倍(305mUvs15mU)。K二和V^的測(cè)定在上面確定的最佳條件下，通過(guò)測(cè)量PNPAF隨著時(shí)間的水解測(cè)定ABFB-2的兩種動(dòng)力學(xué)常數(shù)(Km和Vm)。在pH2.6緩沖液中，建立0.5與5mM范圍的底物(PNPAF)濃度。在50°C監(jiān)控水解的動(dòng)力學(xué)10分鐘。為了獲得兩種酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，將結(jié)果根據(jù)雙反推法(doubleinversemethod)(Lineweark和Burk)處理，如圖4所示。通過(guò)在最佳條件下水解PNPAF確定動(dòng)力學(xué)常數(shù)。ABFB-2的Km值為0.7mM。通過(guò)比較，文獻(xiàn)中這類酶的Km值根據(jù)所研究的屬和真菌的種類在0.05至1.2mM范圍變化。在上述條件下ABFB-2具有328molPNPAF/mo1酶/min的最大水解速度(Vm)。測(cè)定ABFB-2酶的分子量為確定ABFB-2酶的分子量，將源于基本培養(yǎng)基的生長(zhǎng)突變體(釀酒酵母)的培養(yǎng)上清液濃縮200倍，在100°C煮沸5分鐘變性，然后儲(chǔ)存于SDS-聚丙烯酰胺凝膠中。在野生型菌抹中觀察到細(xì)胞外蛋白質(zhì)的量極低。對(duì)于突變體，ABFB-2酶被分泌在培養(yǎng)上清液中。主要是與釀酒酵母細(xì)胞外蛋白的基本水平有關(guān)。獲得的ABFB酶的電泳語(yǔ)帶是發(fā)散的，表明酶的強(qiáng)糖基化。分子量的確定借助于尺寸標(biāo)記物SeeBlue(Invitrogen)完成。結(jié)果表示于表1中。預(yù)測(cè)的MW在凝膠上評(píng)-f介的MWABFB-24155表l:以Kda計(jì)的ABFB-2分子量我們比較通過(guò)算法載體NTi預(yù)測(cè)的分子量與變性SDS-PAGE凝膠電泳遷移獲得的分子量。我們觀察到SDS-PAGE對(duì)酶分子量預(yù)測(cè)過(guò)高。凝膠上顯示的發(fā)散的電泳i普帶的確表明了酶的高度糖基化(O和N糖基化)。糖基化發(fā)生在正在表達(dá)的生物中的蛋白質(zhì)加工過(guò)程中。繩狀青霉菌中abffl-2基因的表達(dá)情況分析繩狀青霉菌具有兩種編碼B型a-L-阿拉伯呋喃糖酶的基因abffi-l和abffi-2基因。比較了這些基因在各種繩狀青霉菌培養(yǎng)條件下的表達(dá)情況。在誘導(dǎo)纖維素分解的和半纖維素分解酶(M2型工業(yè)生長(zhǎng)培養(yǎng)基)的條件下和非生產(chǎn)條件下(基本的葡萄糖培養(yǎng)基MO)培養(yǎng)繩狀青霉菌。在生長(zhǎng)40h后，停止培養(yǎng)，回收菌絲，然后提取總RNA。通過(guò)測(cè)定260nm和280nm處的吸光度(260/280比率>1.8),評(píng)價(jià)RNA的數(shù)量和質(zhì)量。在兩種各自的條件下(MO和M2),通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR定量編碼B型阿拍:伯p夫喃^f唐酶(ABFB-1和ABFB-2)活性的轉(zhuǎn)錄物水平。在兩種條件下以編碼繩狀青霉菌微管蛋白(tub-1)的基因作為對(duì)照。該基因編碼對(duì)細(xì)胞完整性必需的結(jié)構(gòu)蛋白。通常將這個(gè)基因用作對(duì)照基因是因?yàn)椴还軕?yīng)用何種培養(yǎng)條件(普遍存在的)，其表達(dá)水平不變。為每種基因(abffi-l、abffi-2和tub-l)設(shè)計(jì)用于定量PCR的特異引物。在兩種生長(zhǎng)條件(MO和M2)下，逆轉(zhuǎn)錄2(ig總RNA。為了確定用于擴(kuò)增目的基因的最佳條件(定量PCR法的限制以及這些引物對(duì)的效率)，連續(xù)稀釋來(lái)自逆轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)DNA。標(biāo)準(zhǔn)化的結(jié)果如表2和圖5所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表2:abffi-1和abffi-2基因的差異表達(dá)值為繩狀青霉菌生長(zhǎng)條件的函數(shù)編碼分解纖維素的和半分解纖維素活性的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控已有描述。這些基因的表達(dá)易受培養(yǎng)微生物的碳和氮源的性質(zhì)和/或復(fù)雜性的影響。已報(bào)道在葡萄糖存在時(shí)這些基因的轉(zhuǎn)錄受到高度抑制。此調(diào)控通過(guò)分解代謝阻遏蛋白CreA完成，所述CreA特異地與這些基因的啟動(dòng)子結(jié)合并阻斷其轉(zhuǎn)錄。在我們通過(guò)PCR定量abffi-l和abffi-2信使的試^r中，這兩種基因在葡萄糖(MO)條件下的表達(dá)水平非常低。這與文獻(xiàn)一致，因?yàn)橐扬@示這些基因甚至在不利條件下(不存在分解纖維素的和/或半分解纖維素的底物)具有基礎(chǔ)表達(dá)水平。在M0條件下獲得的結(jié)果與文獻(xiàn)一致。與abffi-l基因不同，abffi-2基因的表達(dá)在工業(yè)條件下不被誘導(dǎo)。這表明繩狀青霉菌產(chǎn)生的酶混合物可通過(guò)在工業(yè)條件下獲得真菌對(duì)ABFB-2表達(dá)或通過(guò)向產(chǎn)生的酶混合物中加入外源性的ABFB-2來(lái)改進(jìn)。fCBD的功能性的確定為了驗(yàn)證fCBD結(jié)構(gòu)域的功能，在微晶纖維素素上測(cè)試其與ABFB-2酶的結(jié)合。在4°C下，將酶按體積比與含0.5%微晶纖維素的pH為7.5的lOOmMTris-HCl緩沖液混合。存在PNPAF時(shí)在已確定的最佳水解條件下，通過(guò)測(cè)量殘留的阿拉伯呋喃糖酶B活性來(lái)監(jiān)測(cè)蛋白的結(jié)合。酶與纖維素之間多種時(shí)間接觸后，將混合物離心，通過(guò)測(cè)定上清液中阿拉伯呋喃糖酶B活性監(jiān)測(cè)ABFB-2蛋白濃度。存在包含ABFB-2酶的對(duì)照反應(yīng)時(shí)，在無(wú)微晶纖維素的相同試驗(yàn)條件下進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)。存在微晶纖維素時(shí)，在相同試-險(xiǎn)條件下，通過(guò)孵化ABFB-1酶開展第二個(gè)對(duì)照反應(yīng)。獲得的結(jié)果如圖6所示。因而，我們可觀察到源于繩狀青霉菌的酶ABFB-2的真菌型纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(fCBD)是有功能的。接觸10到45分鐘后監(jiān)測(cè)酶的結(jié)合。孵育IO分鐘后，最初存在酶總量的70%已經(jīng)結(jié)合到微晶纖維素上。45分鐘后，反應(yīng)中存在的總酶的80%已經(jīng)與纖維素結(jié)合。這些數(shù)據(jù)表明接觸反應(yīng)4艮快達(dá)到平衡，相對(duì)于最初IO分鐘的底物，酶結(jié)合動(dòng)力學(xué)絕大多數(shù)時(shí)候確實(shí)遵循動(dòng)力學(xué)第一定律。權(quán)利要求1.多肽，特征在于其包括一種選自以下多肽的多肽-SEQIDNo.2的多肽，-序列介于SEQIDNo.2的位置28和位置400之間的多肽，-SEQIDNo.2的多肽片段，具有α-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性，-一種多肽，其具有α-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性，且顯示與SEQIDNo.2的多肽至少80％的同一性。2.編碼a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的多核苷酸，其特征在于其選自以下多核苷酸-序列包括在SEQIDNo.1的位置268與位置1470之間的多核苷酸，-序列包括在SEQIDNo.1的位置349與位置1470之間的多核苷酸，-編碼根據(jù)權(quán)利要求1的多肽的多核苷酸。3.多核苷酸，特征在于其具有SEQIDNo.1的序列或與SEQIDNo.1互補(bǔ)的序列。4.表達(dá)盒，特征在于在轉(zhuǎn)錄方向上包括-在宿主生物中有功能的啟動(dòng)子；-根據(jù)權(quán)利要求2的多核苷酸；以及-相同宿主生物中的終止序列。5.包括根據(jù)權(quán)利要求2-3中任一項(xiàng)的多核苷酸和/或根據(jù)權(quán)利要求4的表達(dá)盒的載體。6.用根據(jù)權(quán)利要求2-3中任一項(xiàng)的多核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求4的表達(dá)盒和/或根據(jù)權(quán)利要求5的載體轉(zhuǎn)化的宿主生物。7.根據(jù)權(quán)利要求6的宿主生物，特征在于宿主生物選自酵母和絲狀真菌。8.根據(jù)權(quán)利要求7的宿主生物，特征在于其為繩狀青霉菌林。9.動(dòng)物用營(yíng)養(yǎng)添加物，特征在于其包含根據(jù)權(quán)利要求l的多肽。10.動(dòng)物用營(yíng)養(yǎng)添加物，特征在于其包含才艮據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)的宿主生物和/或根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)的宿主生物的發(fā)酵液。11.根據(jù)權(quán)利要求9-10中任一項(xiàng)的動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)添加物，特征在于其為液體形式或4分末形式。12.飼料，特征在于其包含動(dòng)物用營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)和根據(jù)權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)的動(dòng)物用營(yíng)養(yǎng)添加物。13.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽或根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)的宿主生物用于制備動(dòng)物用營(yíng)養(yǎng)添加物或飼料的用途。14.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽或根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)的宿主生物用于水解阿拉伯呋喃低聚糖化合物的a-L-阿拉伯呋喃糖鍵的用途。全文摘要本發(fā)明涉及編碼B型α-L-阿拉伯呋喃糖酶并具有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的繩狀青霉菌abfB-2基因。該α-L-阿拉伯呋喃糖酶可以摻入用于動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)添加物或食品中，因?yàn)槠浯龠M(jìn)可消化性并從而促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。文檔編號(hào)C12N15/56GK101171335SQ200680015038公開日2008年4月30日申請(qǐng)日期2006年5月3日優(yōu)先權(quán)日2005年5月4日發(fā)明者奧里佛·圖拉斯,奧里佛·諾爾,讓-瑪麗·弗朗索瓦,讓-路克·帕羅申請(qǐng)人:安迪蘇法國(guó)聯(lián)合股份有限公司