專利名稱：：研究、判定或評價的方法研究、判定或評價的方法
技術領域：
5本發(fā)明涉及一種通過向SART應激負荷動物投入被檢物質后對其腦組織進行蛋白質組表達分析，對該被檢物質的藥理作用，特別是對于纖維肌痛癥的作用、鎮(zhèn)痛作用或抗應激作用進行研究、判定或評價的方法。|0
背景技術：
纖維肌痛癥(Fibromyalgia)是一種慢性全身性的強烈疼痛、或者即使為局部疼痛，也是廣范圍的慢性疼痛為主要癥狀的疾病，不僅肌肉組織，而且連皮膚也感覺疼痛。在纖維肌痛癥中，不僅表現(xiàn)出這種全身性的疼痛，而且還多伴有疲勞感、倦怠感、憂郁、焦慮感、晨間僵15硬感、肌肉強直、睡眠障礙等。此外，有時還伴有頭痛、顏而痛、認識障礙(記憶錯誤、注意力渙散)、腸胃不適(內臟痛、消化系統(tǒng)障礙、腸胃氣脹)、尿頻、腹瀉、便秘、月經(jīng)不調等癥狀。已報告，相對于美國的一般人口，纖維肌痛癥的發(fā)病率在女性為3.4%，男性為0.5%，大致多發(fā)于2550歲的女性，約80%的患者為20女性，在日本的情況認為與美國大致相同。纖維肌痛癥，雖然其自覺癥狀各種各樣，可是外界觀察到的癥狀，除特征性的全身壓痛之外，卻幾乎沒有，除進行MRI、CT等圖像檢査外，即使進行肌肉疼痛部位的病理檢查、各種免疫學、病毒學、內分泌學檢查，也幾乎不能見到異常。例如，不能觀察到不同于風濕性關節(jié)炎的浮腫，盡管顯示炎癥25程度的血液中的指標，即血沉或cAMP受體蛋白(CRP)均在正常范圍之內，但患者仍主訴遍及四肢或軀干的廣泛范圍內的疼痛。作為診斷方法，現(xiàn)在，在世界范圍內使用美國風濕病學會1990年提出的分類標準。根據(jù)該標準，以臍部作為基點，在上半身和下半身、右半身和左半身、脊椎部和胸骨部的5處中的任一部位均感覺疼痛，30且此疼痛至少持續(xù)3個月以上的情況，或者在規(guī)定的全身18處的壓痛載重后，在ll處以上感覺到疼痛的情況，被認定為纖維肌痛癥。關于纖維肌痛癥的發(fā)病的原因和機理，現(xiàn)在雖然推測為應激等心理原因、病毒感染、遺傳、免疫異?；虻r經(jīng)遞質的異常等，但是仍未5闡明。纖維肌痛癥是一種由生物體組織的損傷或可能帶來損傷的侵害刺激引起的、與多數(shù)一般疼痛性的疾病大不相同的疾病，在疼痛部位無相關的病理學方面的所見。在纖維肌痛癥的治療上，在一般的疼痛治療中較多使用的非類固醇性抗炎癥藥(NSAIDs)等消炎鎮(zhèn)痛劑的幾乎無效。另外，雖然試用io了肌肉松弛藥、阿片樣物質性鎮(zhèn)痛藥、抗焦慮劑等各種各樣的藥劑，但其有效性因人而異存在很大的差別，未見顯著的效果。因此，目前在纖維肌痛癥的治療上，無非是開具抗憂郁藥或抗憂郁藥和NSAIDs的處方、向疼癇發(fā)作部位投以局部麻醉藥或類固醇劑、采用按摩、運動療法、睡眠療法等。但是，任何治療藥劑和治療方法，由于纖維肌15痛癥的原因尚未確定，且治療效果因人而異存在很大的差別，所以均不能確立為治療方法。如上所述，目前，纖維肌痛癥的發(fā)病原因和機理尚未闡明，因此，研究者們正在尋求研究、判定或評價對治療該疾病有效的物質的方法。本發(fā)明的目的在于提供一種對治療纖維肌痛癥或疼痛性疾病有效20的物質進行研究、判定或評價的方法。本發(fā)明的發(fā)明人首先著眼于纖維肌痛癥與SART應激負荷動物的類似性。所謂SART應激負荷動物，是指負荷SART(SpecificAlternationofRhythminTemperature)應激，即反復寒冷刺激的動物，可由小鼠、大25鼠、豚鼠等制作得到。制作方法可以根據(jù)喜多等的方法(日薬理誌，71:195，1975)進行。即，例如在大鼠的情況下，在上午10點至下午5點的期間內，每小時交替改變飼養(yǎng)環(huán)境溫度24'C和一3t:，接著，在下午5點至次日早晨的上午IO點的期間內，維持在4。C，使其自由攝取水和飼料，詞養(yǎng)4天以上，通過反復負荷寒冷刺激而能夠制作。30在大鼠為一3X:的低溫的溫度設定，在小鼠為4°C，在豚鼠為0°C，由此能夠分別制作SART應激負荷小鼠、豚鼠。已知這樣制作的SART應激負荷動物具有以下特征，即，因反復寒冷刺激而造成的疼痛閾值降低(疼痛過敏)、焦慮-憂郁亢進、CRH(促腎上腺皮質素釋放激素)、去甲腎上腺素、IL-ip的釋放分別亢進、5-羥色胺(5-HT)的釋放被抑制。另外，其體重也減少。5另一方面，已知纖維肌痛癥的的患者也具有疼痛閾值降低、焦慮-憂郁亢進、CRH(促腎上腺皮質素釋放激素)、去甲腎上腺素、P物質、IL-ip、IL-2、IL-6及l(fā)L-8的釋放分別亢進、5-羥色胺(5-HT)的釋放被抑制的特征。已經(jīng)明確，在這些方面與SART應激負荷動物具有共性。io此外，迄今為止，已知牛痘病毒接種炎癥組織的提取物對于SART應激負荷動物，具有疼痛閾值降低(疼痛過敏)的抑制作用(鎮(zhèn)痛作用)、CRH(促腎上腺皮質素釋放激素)、去甲腎上腺素、IL-lp的釋放亢進的抑制作用、5-羥色胺(5-HT)的釋放抑制、體重減少的抑制作用等的抗應激作用(基礎&臨床、15卷、5號、2459頁、1981年；応15用薬理、32巻、3號、599頁、1986年及其它)，規(guī)定以牛痘病毒接種家兔炎癥皮膚的提取液為主要成分的醫(yī)藥品制劑(商品名Neurotropin(祌經(jīng)妥樂平))，通過使用該SART應激負荷動物的鎮(zhèn)痛效力試驗而進行效價檢定，作為定量試驗。牛痘病毒接種家兔炎癥皮膚的提取液制劑是一種已明確廣泛適用20于腰疝癥、頸肩腕綜合癥、癥狀性神經(jīng)痛、肩周炎、變形性關節(jié)炎、帶狀皰疹后祌經(jīng)痛等疼痛性疾病，除此以外還廣泛適用于伴隨皮膚疾病(濕疹、皮炎、蕁麻疹)的搔癢、過敏性鼻炎、亞急性脊髓視神經(jīng)癥(SMON)后遺癥的冷覺、異常知覺、疼痛等的非常獨特的制劑，其皮下注射、肌肉注射、靜脈注射用的注射劑和片劑，作為醫(yī)療用醫(yī)25藥品已被允許制造，并在市場上出售。近年，在美國進行了關于作為難治性神經(jīng)性疼痛的RSD(反射性交感神經(jīng)萎縮癥，CPRS-typel)的臨床試驗。另外，近年，已明確牛痘病毒接種炎癥組織的提取物對纖維肌痛癥有效(ArthritisResTher,5(Suppl3):S53，170，2003年及其它)。30在以下專利文獻中，同樣記載了牛痘病毒接種炎癥組織的提取物對纖維肌痛癥有效。專利文獻1:國際公幵WO2004/039383號公報
發(fā)明內容本發(fā)明的發(fā)明人著眼于上述的SART應激負荷動物與纖維肌痛癥5患者具有共同的特征、以及牛痘病毒接種炎癥組織提取物對上述二者均有鎮(zhèn)痛作用，考慮其作用機理為改善疼痛的下行性抑制系統(tǒng)的功能降低，經(jīng)過深入的研究，結果發(fā)明一種通過向SART應激負荷動物投入被檢物質后對其腦組織進行蛋白質組表達分析，對該被檢物質的藥理作用，特別是對于纖維肌痛癥的作用、鎮(zhèn)痛作用或抗應激作用進行io研究、判定或評價的方法。發(fā)明的效果本發(fā)明提供一種通過向SART應激負荷動物投入被檢物質后對其腦組織進行蛋白質組表達分析，對該被檢物質的藥理作用，特別是對于纖維肌痛癥的作用或鎮(zhèn)痛作用進行研究、判定或評價的方法。根據(jù)15該方法，能夠探索對纖維肌痛癥或疼痛性疾病有效的物質，對其進行療效的判定、評價，或者對該物質的耙蛋白質進行分析。具體實施方式向動物接種牛痘病毒，破碎出痘的組織，加入提取溶劑除去組織20碎片之后，進行除蛋白處理，使其吸附于吸附劑上，然后再將吸附成分溶出，由此得到牛痘病毒接種炎癥組織提取物。例如，可以通過以下工序制造牛痘病毒接種炎癥組織提取物。(a)采取接種牛痘病毒而出痘的家兔、小鼠等的皮膚組織，破碎出痘的組織，添加水、苯酚水溶液、生理鹽水或苯酚加甘油水溶液等25提取溶劑之后，通過過濾或離心分離得到提取液(濾液或上清)。(b)將上述提取液調整至酸性的pH，加熱，進行除蛋白處理。然后將除蛋白后的提取液調整至堿性，加熱后進行過濾或離心分離。(c)將得到的濾液或上清調整至酸性，使其吸附于活性碳、高嶺土等吸附劑上。30(d)向上述吸附劑添加水等提取溶劑，調整至堿性的pH，將吸附成分溶出，由此能夠達到牛痘病毒接種炎癥組織提取物。下面，對上述各工序進行更詳細地說明。(a)采取向家兔等兔子接種牛痘病毒而出痘的炎癥皮膚組織，將其破碎。添加其15倍量的提取溶劑，制成乳化懸浮液。作為提取溶劑，5可以使用蒸餾水、生理鹽水、弱酸性乃至弱堿性的緩沖液等，也可以適當?shù)靥砑痈视偷确€(wěn)定劑、苯酚等殺菌防腐劑、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂等鹽類等。此時，也可以通過凍結融解、超聲波、細胞膜溶解酶或表而活性劑等的處理破壞細胞組織，使提取容易進行。(b)io將得到的乳狀提取液通過過濾或離心分離除去組織碎片之后，進行除蛋白處理。除蛋白操作可以根據(jù)通常公知的方法進行，加熱處理、使斤j蛋白質變性劑，例如酸、堿、尿素、胍、丙酮等有機溶劑等的處理、等電點沉淀，鹽析等方法均可適用。然后，采用除去不溶物的通常方法，例如使用濾紙(纖維素、硝酸纖維素等)、玻璃濾器、西萊特15(Celite)、塞氏過濾板等的過濾、超濾、離心分離等方法，由此能夠除去析出的不溶蛋白質。(c)使用鹽酸、硫酸、氫溴酸等酸，將這樣得到的含有有效成分的提取液調整至酸性，優(yōu)選調整至pH3.5pH5.5，進行向吸附劑上吸附的20操作。作為能夠使用的吸附劑，可以列舉活性碳、高嶺土等。向提取液中添加吸附劑并進行攪拌，或者使提取液通過填充有吸附劑的柱子，由此能夠使有效成分吸附在該吸附劑上。在向提取液中添加吸附劑的情況下，通過過濾或離心分離等除去溶液，從而能夠得到吸附有有效成分的吸附劑。25(d)為使有效成分從吸附劑中溶出(脫離)，能夠通過向上述吸附劑添加提取溶劑，在室溫或者適當加熱進行攪拌而溶出，以過濾或離心分離等通常方法除去吸附劑而實現(xiàn)。作為所使用的提取溶劑，可以使用堿性溶劑，例如，調整至堿性pH的水、甲醇、乙醇、異丙醇等或這些30溶劑的適當?shù)幕旌先芤?，?yōu)選使用調整至pH9pH12的水。另外，例如在上述專利文獻1等中記載了更具體的制法。實施例首先，如下所述制作了SART應激負荷動物的腦組織試樣。(1)動物對6周齡的Wistar系雄性大鼠負荷SART應激，制作出SART應5激大鼠。使大鼠自由攝取飼料和自來水，負荷5天。自第6天起解除負荷，以供試驗。(2)牛痘病毒接種炎癥組織的提取物作為牛痘病毒接種炎癥組織的提取物，使用根據(jù)上述專利文獻1的實施例2制作的將從接種了牛痘病毒的兔子的炎癥皮膚中提取的提io取物調制為20NU/mL的物質(牛痘病毒接種家兔炎癥皮膚的提取物)。所謂Nli，是使用作為疼痛閾值低于正常動物的慢性應激動物的SART應激負荷大鼠，基于Randall-Selitto法進行試驗，以鎮(zhèn)痛效力的EDso忸規(guī)定的。INU表示當EDs(,值為100mg/kg時，牛痘病毒接種家兔炎癥皮膚提取物含有鎮(zhèn)痛活性成分lmg的活性。15(3)牛痘病毒接種家兔炎癥皮膚的提取物的給藥對上述SART應激負荷大鼠，從SART應激負荷開始日起，按照每lkg體重200NU，將牛痘病毒接種家兔炎癥皮膚的提取物(SART應激被檢物質給藥組)進行連日腹腔內給藥。以相同的方案，向正常對照組和SART應激負荷對照組投入生理鹽水。給藥的液體量為每lkg體20重10mL。分組如下正常對照組(n二5)、SART應激負荷對照組(n二IO)、SART應激負荷被檢物質組給藥組(n二10)。(4)疼痛閾值的測定通過采用壓力剌激鎮(zhèn)痛效果測定裝置的基于Randall-Selitto法的試驗，對疼痛閾值進行測定。即，以一定的加壓速度對大鼠的右后肢腳25趾施加壓力刺激，將動物表現(xiàn)出逃避或嘶叫反應時的加壓重量(g)作為疼痛閾值進行測定。由此得到以下的結果。(1)體重的變化SART應激負荷對照組的體重與正常對照組相比，從SART應激負30荷開始1天后起，觀察到有意義的體重增加抑制。SART應激負荷被檢物質給藥組的體重與SART應激負荷對照組相比，未觀察到體重變化。(2)牛痘病毒接種家兔炎癥皮膚的提取物對SART應激負荷大鼠的疼痛閾值降低的效果如果負荷SART應激5天，則與正常對照組相比，疼痛閾值有意義地降低。對SART應激負荷被檢物質給藥組，在最后給藥的30分鐘之5后測定了疼痛閾值，結果觀察到與SART應激負荷對照組相比有意義的改善。(3)試樣如上所述，在確認SART應激負荷引起疼痛閾值的降低和牛痘病毒接種家兔炎癥皮膚提取物的鎮(zhèn)痛效果之后，從各組大鼠的腦組織屮回io收大腦、中腦、小腦、間腦、橋腦和延髓、脊髓后角和后根祌經(jīng)節(jié)。對得到的各試樣，使用Polytron勻漿器，在冰冷下，在細胞裂解緩沖液(30mmol/LTris-鹽酸、2mol/L硫脲、7mol/L尿素、4XCHAPS，pH8.5)[CHAPS:3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylamrnonio]propanesulfonicacid(3-[3-鵬酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸)]中對分別取自各組的4只大鼠15的試樣進行勻漿，將得到的組織均漿以液氮迅速冷卻，凍結保存于一8(TC至使用之吋。然后，使用以上述方法得到的試樣，通過熒光標記雙向差異凝膠電泳(2D-DIGE)法，發(fā)現(xiàn)在SART應激負荷動物的中樞和末梢神經(jīng)中表達量發(fā)生改變的蛋白質，再采用基質輔助激光分析電離飛行時間質20譜(MALDI-TOF/MS)對這些蛋白質進行鑒定。以下進行詳細說明。(1)試劑在上述熒光標記雙向差異凝膠電泳中使用的試劑均為由GEHealthcareBioscience株式會社(原AmershamBioscience)指定的生產廠家制造的等級品。為避免在細胞裂解緩沖液、重泡脹緩沖液中使用25的尿素和硫脲對實驗系統(tǒng)造成不良影響，添加離子交換樹脂Amberlite進行振蕩，吸附并除去分解物后再使用。在調制試劑時使用超純水(Milli-Q水)。(2)熒光標記雙向差異凝膠電泳(2D-DIGE)法利用根據(jù)Bradford法用牛血清白蛋白制作的標準曲線，對以上述方30法得到的試樣的蛋白質濃度進行定量分析。將其用作熒光標記雙向差異凝膠電泳的試樣，在蛋白質表達量變化的分析中，采用2D-DIGE法。(3)使用熒光標記試劑(CyDye)進行的標記反應用細胞裂解緩沖液將各試樣的蛋白質濃度調整為2mg/mL或5mg/mL，并確認其液性為pH8.09.0的范圍。制作出分別等量混合有待測的全部試樣的混合試樣，將其作為為內部標準。將內部標準、蛋5白質試樣50嗎加入微量離心管內，添加lpL的CyDyeDIGEFluorminimaldye標記溶液(以無水二甲基甲酰胺將CyDye色素稀釋至400pmol/pL)。攪拌后，在冰中和喑處靜置30分鐘，標記蛋白質。內部標準試樣以Cy2色素標記，蛋白質試樣以Cy3或Cy5色素標記。添加lpL10mmol/L的賴氨酸溶液，在冰中和暗處靜置10分鐘，使標記io反應停止。將以Cy2、Cy3和Cy5色素標記的各試樣加入1個微量離心管內進行混合，用于第一向電泳。(4)第一向電泳第一向電泳使用AmershamBioscience的IPG預制膠條(ImmobilineDrystrip)和等電點電泳系統(tǒng)(IPGphor)，進行等電點電泳。使用長度15為24cm、pH范圍分別為pH47L、4.55.5L、5.36.5L禾卩69L的膠條。在使用pH47L、4.55.5L和5.36.5L的膠條的情況下，同吋進行膠條重泡脹和試樣添加。將450pL含有試樣的重泡脹緩沖液(2mol/L硫脲、7mol/L尿素、4%CHAPS、1.2%DeStreakReagent、0.5%IPG20Buffer)加于24cm的膠條架上，再放置IPG膠條放置于其上。10小吋重泡脹之后，以每個膠條最大50|_iA、最大8000V實施D0，000—180,000VHr電泳。在分離堿性側的蛋白質的pH69L的膠條的情況下，重泡脹IPG膠條后再添加試樣能夠得到良好的結果，因此，在加入不含試樣的重25泡脹緩沖液......的重泡脹托盤內重泡脹IPG膠條10小時以上，然后用加樣杯添加試樣，以每個膠條最大....、最大8000V實施96，000VHr電泳。在嚴格遮光的條件下進行試樣添加后的操作，將電泳結束后的膠條保存于一80"C至實施第二向電泳。30(5)第二向電泳第二向電泳進行24cmX20cm、1mm厚的十二垸基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE，丙烯酰胺濃度12.5%)。向電泳結束的膠條添加平衡緩沖液A(50mmol/LTris-鹽酸、6mol/L尿素、30%甘油、2%SDS、1%二硫蘇糖醇，pH8.8)，振蕩15分鐘，更換為平衡緩沖液B(50mmol/LTris-鹽酸、6mol/L尿素、30%甘油、2%SDS、2.5%碘乙5酰胺，pH8.8)后，再振蕩15分鐘。在平衡結束之后，立即進行第二向電泳。在l(TC、2W/gel、遮光狀態(tài)下進行電泳，直至電泳前端距凝膠下端510mm的位置。(6)分析將電泳結朿的凝膠從電泳槽屮取出之后，遮光，直接以夾于玻璃片10之間的狀態(tài)，立即使用Typhoon9400可變圖象分析儀(variableimageanalyzer)(熒光圖象分析裝置)，獲取Cy2、Cy3、Cy5的熒光圖象(激發(fā)波-fe/1^光波長Cy2:488nm/520nm，Cy3:532nm/580nm，Cy5:633nm/670nm)。應用DeCyder差異分析軟件(DeCyderDifferentialAnalysisSoftware),對各祌經(jīng)組織的6塊凝膠(凝膠圖像數(shù)18)進行15斑點的檢出、匹配、統(tǒng)計分析。對正常對照組和SART應激負荷對照組，以及SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組分別進行比較，挑選出表達量之差為1.5倍以上且在t—test中p<0.05的斑點。(7)磷酸化蛋白質的分析20為了確認翻譯后修飾的影響，在同一塊凝膠中實施了使用熒光標記試劑(CyDye)的總蛋白質的標記，和使用磷酸化蛋白質染色試劑(Pro-QDiamond)的磷酸化蛋白質的染色。以Cy2標記50嗎試樣，與450pg未標記的試樣混合，與上述同樣進行雙向電泳。電泳結束后，為不引起CyDye和Pro-QDiamond的褪色，在遮光下實施染色操作。25從玻璃片中取出凝膠，在固定液(50%甲醇，10%三氯乙酸)中，室溫下浸漬1小時。然后更換固定液，過夜，再更換固定液，平穩(wěn)地振蕩1小時，固定。用雙蒸水洗凈固定后的凝膠，每次15分鐘，清洗4次，添加500mL染色液，振蕩2小時進行染色。然后添加脫色液(20%乙腈、50mmoVL乙酸鈉，pH4.0)，每次30分鐘，共洗凈3次。使用30Typhoon9400可變圖象分析儀，Cy5色素以激發(fā)波長633nnv^光波長670nm的條件、Pro_QDiamond以激發(fā)波長532nm/熒光波長580nm的條件，對凝膠進行測定。(8)采用MALDI-TOF/MS進行的蛋白質鑒定作為試樣，添加相當于蛋白質量為500pg的組織均漿，與上述同樣實施雙向電泳。5使用SYPRORubyProteinGel和BlotStainKit,按照試驗設計(protocol)對凝膠中的總蛋白質進行染色。從玻璃片中取出已結朿電泳的凝膠，浸漬在500mL的固定液(10%甲醇，7%乙酸)中，在室溫下平穩(wěn)地振蕩過夜，進行固定。固定后，添加500mL染色液，在遮光下，室溫下平穩(wěn)地振蕩5小吋以上，進行染色。然后添加500mL的io脫色液(10%甲醇，6%乙酸)，在遮光下，室溫下平穩(wěn)地振蕩I2小吋。使J1]Typhoon9400可變圖象分析儀，在激發(fā)波長457nnv^光波長610nm的條件下，對凝膠進行測定。染色后的凝膠使用BioRadSpotCutter挑選出目的斑點，對其進行分析。其結果如下所示。15(1)在pH4—7的范圍內的蛋白質表達改變的分析對采取的全部組織實施在pH4—7的范圍內的熒光標記雙向差異凝膠電泳(2D-DIGE)分析。(l一l)大腦分析的結果為，對正常對照組和SART應激負荷對照組，以及SART20應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組，分別進行了比較，均未發(fā)現(xiàn)表達量之差為1.5倍以上且在t一test中p<0.05的斑點。以下，根據(jù)同樣的檢測標準對斑點的表達量之差進行評價。(l一2)間腦在正常對照組和SART應激負荷對照組，以及SART應激負荷對照25組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，均未發(fā)現(xiàn)存在表達量存在差異的斑點。(1—3)中腦在正常對照組和SART應激負荷對照組的比較中，與正常對照組相比，在SART應激負荷對照組中增加了5個斑點，未發(fā)現(xiàn)減少的斑點。30而在SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，在被檢物質給藥組中增加1個斑點，減少4個斑點。(l一4)橋腦在正常對照組和SART應激負荷對照組的比較中，在SART應激負荷對照組中增加6個斑點，減少4個斑點。而在SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，在被檢物質給藥組中增加35個斑點，未發(fā)現(xiàn)減少的斑點。(l一5)延髓在正常對照組和SART應激負荷對照組的比較中，在SART應激負荷對照組中未發(fā)現(xiàn)增加的斑點，減少1個斑點。而在SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組屮，在被檢物質給藥組中未io發(fā)現(xiàn)增加的斑點，減少1個斑點。(1—6)小服f在正常對照組和SART應激負荷對照組的比較中，在SART應激負荷對照組中增加了5個斑點，減少9個斑點。而在SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，未發(fā)現(xiàn)存在表達量存在差15異的斑點。U—7)脊髓后角在正常對照組和SART應激負荷對照組的比較中，在SART應激負荷對照組中增加1個斑點，未發(fā)現(xiàn)減少的斑點。而在SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，在SART應激負荷被檢20物質給藥組中增加1個斑點，減少1個斑點。(卜8)后根神經(jīng)節(jié)在正常對照組和SART應激負荷對照組的比較中，在SART應激負荷對照組中增加1個斑點，未發(fā)現(xiàn)減少的斑點。而在SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，未發(fā)現(xiàn)存在表達量存在25差異的斑點。在至此進行的實驗中發(fā)現(xiàn)表達量改變的斑點數(shù)量表示在表1中。30[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>n二4，t檢驗(2)在窄pH范圍(pH4.5—5.5和pH5.3—6.5)內的蛋白質表達改變對于在pH4—7的范圍內能夠確認多個斑點發(fā)生變化的中腦、橋腦和小腦，實施了在更窄范圍(pH4.5—5.5和pH5.3—6.5)內的DIGE，再次確認在pH4—7中得到的結果，并嘗試檢出新的斑點。(2—1)中腦io在pH4.5—5.5的范圍內，在正常對照組和SART應激負荷對照組中，在SART應激負荷對照組中增加14個斑點，減少6個斑點。而在SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，在被檢物質給藥組中增加1個斑點，減少14個斑點。在pH5.3—6.5的范圍內，在正常對照組和SART應激負荷對照組中，在SART應激負荷對照組中增15力口7個斑點，減少2個斑點。而在SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，在SART應激負荷被檢物質給藥組中增加2個斑點，減少6個斑點。在中腦中，在pH4—7的范圍內發(fā)現(xiàn)表達量發(fā)生改變的斑點，除了其中的1個之外，在pH4.5—5.5和pH5.3—6.5的范圍內，仍然發(fā)生1.5倍以上有意義的改變，能夠確認實驗的再現(xiàn)性。(2—2)橋腦在pH4.5—5.5的范圍內，在正常對照組和SART應激負荷對照組，以及SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，均5未發(fā)現(xiàn)表達量存在差異的斑點。在pH5.3—6.5的范圍內，在正常對照組和SART應激負荷對照組中，在SART應激負荷對照組中增加1個斑點，減少1個斑點。而在SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，在被檢物質給藥組中增加2個斑點，減少l個斑點。io在橋腦中，在pH4—7的范圍內能夠檢測出改變的斑點，在pH4.5一5.5禾卩pH5.3—6.5的范圍內未能確認。(2_3)小腦在pH4.5—5.5的范圍內，在正常對照組和SART應激負荷對照組中，在SART應激負荷對照組中增加3個斑點，減少12個斑點。而在SART15應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組屮，在被檢物質給藥組屮增加2個斑點，減少1個斑點。在pH5.3—6.5的范圍內，在正常對照組和SART應激負荷對照組中，在SART應激負荷對照組中增加2個斑點，減少7個斑點。而在SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，在被檢物質給藥組中增加1個斑點，未發(fā)20現(xiàn)減少的斑點。在小腦中，在pH4—7的范圍的內發(fā)現(xiàn)的改變的斑點，除了其中的2個之外，在pH4.5—5.5和pH5.3—6.5的范圍內，仍然發(fā)生1.5倍以上有意義的改變，能夠確認實驗的再現(xiàn)性。(3)在pH6—9的范圍內的蛋白質表達量改變的分析25對大腦和后根神經(jīng)節(jié)進行了在pH6—9的范圍內的DIGE分析，結果如下所述。(3—1)大腦在正常對照組和SART應激負荷對照組，以及SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，均未發(fā)現(xiàn)表達量存在差異的30斑點。(3—2)后根神經(jīng)節(jié)在正常對照組和SART應激負荷對照組，以及SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，均未發(fā)現(xiàn)表達量存在差異的斑點。在窄pH范圍和堿性pH范圍的實驗中發(fā)現(xiàn)變化的斑點數(shù)量表示在表2中。[表2]<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>所有實驗均為n-4，t檢驗(4)中腦試樣的磷酸化分析一般認為，在發(fā)現(xiàn)翻譯后修飾的影響方面，蛋白質組分析與其它方法相比更具長處。因此，使用中腦試樣確認蛋白質的磷酸化。用Cy5預先標記總蛋白質，以ProQDiamond對雙向電泳后發(fā)生磷酸化的蛋白質進行染色，按各自的熒光波長獲取圖象，確認蛋白質磷酸化的有無。(5)已確認發(fā)生改變的蛋白質的鑒定5對于中腦、橋腦和小腦的試樣，進行雙向電泳，挑選出斑點進行凝膠內消化后，采用MALDI-TOF/MS進行分析。如上所述，根據(jù)使用2D-DIGE的蛋白質組分析，確認了在SART應激負荷動物的中腦、橋腦、小腦中的多種蛋白質發(fā)生改變。蛋白質組分析的優(yōu)點在于能夠確認在基因水平上不能確認的翻譯io后修飾。在DIGE分析中，受到磷酸化、糖化、切斷等翻譯后修飾的蛋白質作為另外的斑點而能夠被確認，因此，應用Pro-QDiamond染色對斑點是否為磷酸化的蛋白質進行確認。通過組合應用CyDye標記和Pro-QDiamond染色，能夠確認以DIGE法確認發(fā)生改變的斑點有無磷酸化。15通過MALDI-TOF/MS對已確認發(fā)生改變的斑點進行鑒定的結果，能夠鑒定的蛋白質為以下21種CRMP-2、CRMP-4、Munc-18-1、Complexinl、Cornplexin2、突觸蛋白2(Synapsin2)、PGP9.5(蛋白基因產物9.5(ProteinGeneProduct9.5))、a-突觸核蛋白(Alpha-synuclein)、Erk2(MAPK)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PAK220(Ser/ThrproteinkinasePAK2)、TOLLIP、肌動蛋白相關蛋白2/3復合體亞基2(Actinrelatedprotein2/3sub2)、肌動蛋白相關蛋白2/3復合體亞基4(Actinrelatedprotein2/3sub4)、a-微管蛋白(Tubulinalpha)、Regucalcin(SMP30)、elF5A、醛脫氫酶(Aldehydedehydrogenase)、琥珀酰CoA連接酶(SuccinylCoAligase)、肌酸激酶(Creatinekinase)、25檸檬酸合成酶(Citratesynthase)、ATP合成酶(ATPsynthase)。當設正常對照組的表達量為1時，在SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質(Drug)給藥組中，各鑒定蛋白質的斑點的表達量表示在表3中。30<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>(6)鑒定出的蛋白質的分析在這些鑒定出的蛋白質中，針對在中腦中的由SART應激負荷引起變化，但該變化通過投入被檢物質而被抑制的CRMP-2、CRMP-4和Munc-18-1，以及在小腦中發(fā)現(xiàn)的由SART應激負荷引起變化的5Complexin1/2，進行了更詳細地研究。(A)應用realtimePCR測定CRMP-2在中腦中心灰白質中的mRNA量，未能確認由SART應激負荷和由SART應激負荷被檢物質給藥引起mRNA量的變化，提示CRMP-2在轉錄階段中未受影響。因此，以聚丙烯酰胺凝膠將中腦均槳進行電泳后，轉印至PVDF膜上，再使用io抗CRMP-2抗體對其進行檢測，未發(fā)現(xiàn)以抗CRMP-2抗體識別的條帶濃度變化，提示發(fā)生通過雙向電泳能夠確認的翻譯后修飾等變化。為了對其進行確認，從通過雙向電泳分離后的凝膠中轉印至PVDF膜上，使用抗CRMP-2抗體進行檢測，在比通過2D-DIGE確認發(fā)生改變的斑點更高分子量的位置上發(fā)現(xiàn)CRMP-2的斑點。由該結果提示，以152D-DIGE確認發(fā)生改變的斑點為CRMP-2的一部分被切斷而生成的切斷型CRMP-2。(B)用realtimePCR測定CRMP-4在中腦中心灰白質中的mRNA量，也未能確認由SART應激負荷和由SART應激負荷被檢物質給藥引起mRNA量的變化，提示CRMP-4在轉錄階段中未受影響。因此，以聚20丙烯酰胺凝膠將中腦均漿進行電泳后，轉印至PVDF膜上，再使用抗CRMP-4抗體對其進行檢測，未發(fā)現(xiàn)以抗CRMP-4抗體識別的條帶濃度變化，.提示發(fā)生通過雙向電泳能夠確認的翻譯后修飾等變化。為了對其進行確認，從通過雙向電泳分離后的凝膠中轉印至PVDF膜上，使用抗CRMP-4抗體進行檢測，在與通過2D-DIGE確認發(fā)生改變的斑25點幾乎相同的分子量檢測出等電點不同的多個斑點，考慮可能發(fā)生翻譯后的修飾。由SART應激負荷引起這些斑點的濃度在酸性側降低，堿性側增加，該變化通過投入被檢物質而被抑制。已知磷酸化可作為使蛋白質的等電點發(fā)生改變的翻譯后修飾，因此，與經(jīng)ProQDiamond染色的凝膠圖象進行比較，可知酸性側的斑點被磷酸化，而堿性側的30斑點未被磷酸化。由該結果提示，通過2D-DIGE發(fā)現(xiàn)了由SART應激負荷引起磷酸化CRMP-4的減少。(C)采用realtimePCR測定Munc-18-1在中腦中心灰白質中的mRNA量，Munc-18-1也未能確認由SART應激負荷和由SART應激負荷被檢物質給藥引起mRNA量的變化，提示Mimc-18-1在轉錄階段中未受影響。因此，以聚丙烯酰胺凝膠對中腦均漿進行電泳之后，轉錄至PVDF5膜上，再用可識別Munc-18-1的氨基酸58—70位的抗體對其進行檢測，確認由SART應激負荷引起以新的抗Munc-18抗體識別的條帶濃度位于低分子量側，提示發(fā)生了切斷等翻譯后修飾。為了對其進行確認，從通過雙向電泳分離后的凝膠中轉印至PVDF膜上，使用抗Munc-18抗休進行檢測，不僅檢出了通過2D-DIGE確認發(fā)生變化的斑點，而且io在高分子量側還檢出了數(shù)個斑點。進一步，嘗試使用識別Munc-18-1的C末端的氨基酸580—594位的抗體對其進行檢測，在高分子量側檢測出數(shù)個斑點，但未檢出山2D-DIGE確認發(fā)生改變的斑點。由該結果提示，以2D-DIGE發(fā)現(xiàn)的斑點為將C末端從Munc-18-1中切斷后的蛋白質。15(D)針對Complexin1/2，通過雙向電泳分離小腦均漿，從凝膠巾轉印至PVDF股上，使用抗Complexin1/2抗體進行檢測，不僅檢出了釆用MALDI-TOF/MS分別鑒定出的Complexin1和Complexin2，而且還在兒乎相同的分子量檢測出等電點存在于若干酸性側的數(shù)個斑點，考慮可能發(fā)生翻譯后的修飾。這些斑點，正是雖然在2D-DIGE中發(fā)現(xiàn)20其變化，但采用MALDI-TOF/MS卻未鑒定出來的斑點，存在于同一位置的斑點在中腦中也發(fā)生了改變。在中腦中，由SART應激負荷引起這些斑點濃度在酸性側增加，該變化通過投入被檢物質而被抑制。由該結果提示，通過2D-DIGE發(fā)現(xiàn)了由SART應激負荷引起的翻譯后修飾的變化。以上結果總結在表4中。[表4]<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>設正常對照組=1計算*:p<0.05(與TH常對照組比較，T檢驗)+:p<0.05(與SART應激負荷對照組比較，T檢驗)如上述CRMP-2、CRMP-4和Munc-18-1這樣的通過蛋白質組分析作為發(fā)生變化的蛋白質被鑒定的蛋白質，也存在翻譯后被修飾的情況。已確認發(fā)生改變的上述蛋白質，既有翻譯后被修飾的蛋白質，也有翻io譯后不被修飾的蛋白質。作為翻譯后的修飾反應，可以列舉例如肽鏈的切斷、糖鏈和脂肪酸的加成這種不可逆反應，和磷酸化、乙酰化、羥化、羧化、腺苷酸化、ADP核糖基化等可逆反應。(7)鑒定出的蛋白質在生物體內的功能從公共的數(shù)據(jù)庫和公知的文獻中收集發(fā)現(xiàn)的蛋白質相關的情報。15CRMP-1、CRMP-2和CRMP-4為同屬于CRMP家族的蛋白質，分別具有70%以上的同源性。有報告，CRMP-2為一種參與軸索延伸和生長錐破壞的蛋白質，通過磷酸化抑制軸索延伸。關于本案發(fā)現(xiàn)的切斷型CRMP-2，雖然有報告切斷型CRMP-2在組織采取后隨著時間的推移而增加，在內側型側頭葉癲癇患者的已萎縮的海馬中表達減少，20但是它在生物體內的功能和意義尚不清楚。己知CRMP-4也具有與CRMP-2同樣的功能，但尚不知道CRMP-4的功能調控等，也沒有磷酸化的報告。雖然沒有軸索延伸與疼痛過敏的相關性的直接性的報告，但是考慮因疼痛和溫度等而可能發(fā)生神經(jīng)網(wǎng)絡的變化。關于Munc-18-l、Complexin1、Complexin2禾卩Synapsin2，其均參與祌經(jīng)遞質的釋放。已知神經(jīng)遞質儲存于分泌小泡內，對刺激產生5反應而與細胞膜融合，發(fā)生釋放。而Munc-18-KComplexin1和Complexin2在作為分泌小泡與細胞膜的融合中的關鍵的蛋白質復合體SNARE復合體的形成中發(fā)揮重要的作用。關于被認為切斷型的低分子量的Munc-18-l，雖然還不明白其在生物體內的功能和意義，但是迄今為止觀察到其存在于海馬和大腦皮質中。ioPGP9.5(蛋白基因產物9.5，泛素羧基末端水解酶同功酶LI(Proteingeneproduct9.5，Ubiquitincarboxyl-terminalhydrolaseisozymeLl))和a-突觸核蛋白也是已知在祌經(jīng)中特異表達的蛋白質。已知PGP9.5是作為祌經(jīng)的標記物而被廣泛使用的蛋白質，具有泛素水解酶活性，認為能夠防止因泛素化而引起的祌經(jīng)損傷，其消失可引起祌經(jīng)發(fā)15生破壞。另外，最近還報告，PGP9.5使P2XATP受體活化，使ATP誘導性的Tll流增加。a-突觸核蛋白是一種因其生理功能而在帕金森病中凝柒的周知的蛋白質，已報告，(x-突觸核蛋白抑制參與多巴胺合成的酪氨酸磷酸化酶的活性，與多巴胺轉運蛋白結合，使多巴胺向細胞內的流入。20除了這些祌經(jīng)特異性蛋白質之外，參與信號轉導系統(tǒng)、細胞形態(tài)、蛋白質合成起始、能量產生等的蛋白質也已被鑒定。表5匯總了有關確認發(fā)生改變且采用MALDI-TOF/MS鑒定出的蛋白質的已知功能。2530[表5]<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>上述蛋白質有可能是SART應激負荷動物的疼痛閾值降低等的生理功能異?；蛘呃w維肌痛癥患者的病因，還有可能是牛痘病毒接種家兔炎癥皮膚提取物的靶分子。因此，在被檢物質使這些蛋白質的變化恢復正常的情況下，該被檢物質可能成為對治療纖維肌痛癥和腰痛癥、頸肩腕綜合癥、癥狀性神經(jīng)痛、肩周炎、變形性關節(jié)炎、帶狀皰疹后神經(jīng)痛等疼痛性疾病、RSD(refrexsympatheticdystrophy:反射性交感神經(jīng)萎縮癥)等神經(jīng)性疼痛、或者因應激而造成的生理功能異常等有效的藥劑。工業(yè)實用性如上所述，能夠確認，根據(jù)本發(fā)明的方法能夠檢出、鑒定因SART應激負荷或投入有牛痘病毒接種家兔炎癥皮膚的提取物而表達發(fā)生改變的蛋白質。因此，本發(fā)明作為一種通過向SART應激負荷動物投入被檢物質后對其腦組織進行蛋白質組表達分析，對該被檢物質的藥理作用，特別是對于纖維肌痛癥的作用、鎮(zhèn)痛作用或抗應激作用進行研究、判定或評價的方法十分有用。權利要求1.一種對被檢物質的藥理作用進行研究、判定或評價的方法，其特征在于該方法基于對投入有被檢物質的SART應激負荷動物的腦組織進行的蛋白質組表達分析。2.如權利要求1所述的研究、判定或評價的方法，其特征在于所述藥理作用為對纖維肌痛癥的作用、鎮(zhèn)痛作用或抗應激作用。3.如權利要求1或2中任一項所述的研究、判定或評價的方法，其特征在于所述SART應激負荷動物為大鼠。4.如權利要求13中任一項所述的研究、判定或評價的方法，其特征在于所述腦組織為中腦、橋腦或小腦。5.如權利要求14中任一項所述的研究、判定或評價方法，其特征在于所述蛋白質組表達分析是采用熒光標記雙向差異凝膠電泳的分析。6.如權利要求15中任一項所述的研究、判定或評價的方法，其特征在于進行蛋白質組表達分析，與正常動物進行比較，將在SART應激負荷動物中表達發(fā)生改變的蛋白質作為指標。7.如權利要求15中任一項所述的研究、判定或評價的方法，其特征在于進行蛋白質組表達分析，與未投入被檢物質的SART應激負荷動物進行比較，將在投入有被檢物質的SART應激負荷動物中表達發(fā)生改變的蛋白質作為指標。8.如權利要求6或7所述的研究、判定或評價的方法，其特征在5于作為表達發(fā)生改變的蛋白質，用翻譯后被修飾或未被修飾的CRMP-2、CRMP-4、Munc-18-1、Complexin1、Complexin2、突觸蛋白2、PGP9.5(蛋白基因產物9.5)、a-突觸核蛋白、Erk2(MAPK)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PAK2、TOLLIP、肌動蛋白相關蛋白2/3復合io體亞基2、肌動蛋白相關蛋白2/3復合體亞基4、a-微管蛋白、Regucaldn(SMP30)、elF5A、醛脫氫酶、琥珀酰CoA連接酶、肌酸激酶、檸檬酸合成酶、ATP合成酶中的任1種或2種以上作為指標。9.如權利要求18中任一項所述的研究、判定或評價的方法，其15特征在于所述被檢物質為牛痘病毒接種炎癥組織的提取物。10.如權利要求9所述的研究、判定或評價方法，其特征在于所述被檢物質為牛痘病毒接種家兔炎癥皮膚的提取物。2011.一種用權利要求18中任一項所述的研究、判定或評價的方法進行了研究、判定或評價的藥劑。12.如權利要求11所述的藥劑，其特征在于25所述藥劑為對纖維肌痛癥的治療劑。13.如權利要求ll所述的藥劑，其特征在于所述藥劑為鎮(zhèn)痛劑。14.如權利要求ll所述的藥劑，其特征在于所述藥劑為具有抗應激作用的藥劑。15.如權利要求11所述的藥劑，其特征在于有效成分為牛痘病毒接種家兔炎癥皮膚的提取物。16.SART應激負荷動物在權利要求18所述的研究、判定或評價的方法中的使用方法。17.SART應激負荷動物在被檢物質為牛痘病毒接種家兔炎癥皮膚提取物的權利要求18所述的研究、判定或評價的方法中的使用方法。全文摘要本發(fā)明提供一種通過向SART應激負荷動物投入被檢物質后，對其腦組織進行蛋白質組表達分析，研究、判定或評價該被檢物質對纖維肌痛癥的作用、鎮(zhèn)痛作用或抗應激作用等藥理作用的方法。對SART應激負荷動物的腦組織進行蛋白質組表達分析，以確認被檢物質如何影響其中所發(fā)生的蛋白質表達的變化，由此能夠探索對治療纖維肌痛癥和疼痛性疾病有效的物質和抗應激物質。文檔編號C12Q1/02GK101151376SQ20068000739公開日2008年3月26日申請日期2006年3月6日優(yōu)先權日2005年3月7日發(fā)明者加藤智啟,藤澤裕樹,西岡久壽樹申請人:日本臟器制藥株式會社