專利名稱：：酮化合物的對映體選擇性酶還原方法酮化合物的對映體選^t奪性酶還原方法本發(fā)明涉及將酮化合物，特別是4-卣代-3-氧代丁酸酯分別對映體選擇性酶還原成相應的R-醇或S-4-卣代-3-羥基丁酸酯的方法。羰基還原酶(另外的名稱醇脫氫酶、氧化還原酶)被已知作為分別用于還原羰基化合物和用于氧化仲醇的催化劑。所述的酶需要輔酶例如NAD(P)H。例如從US5,342,767中獲知用由高加索酸奶乳桿菌(Lactobacilluskefir)得到的羰基還原酶和輔酶NADPH還原酮。光學活性的羥基化合物是對藥理學活性化合物、芳族物質、信息素、農藥和酶抑制劑的合成具有廣泛適用性的有價值的手性體。例如，S-4-卣代-3-羥基丁酸酯是用于合成HMG-CoA還原酶抑制劑、D-肉堿和其他物質的重要中間體。對映體選擇性酶是已知的，其例如能夠將4-鹵代-3-氧代丁酸酯還原成相應的S-4-鹵代-3-羥基丁酸酯。作為例子，可以提及以下這些得自面包酵母的還原酶(D-酶-1、D-酶-2,J.Am.Chem.Soc.107，2993-2994,1985);得自鮭色擲孢酵母(Sporobolomycessalmonicolor)的醛還原酶2(Appl.Environ.Microbiol.65，5207-5211，1999);得自馬其頓假絲酵母(Candidamacedoniensis)的酮泛酸酯還原酶(Arch.Biochem.Biophys.294，469-474,1992);得自白地霉(Geotrichumcandidum)的還原酶(EnzymeMircrob.Technol.14，731-738，1992);得自Candidamagnoliae的羰基還原酶(WO98/35025);得自乳克魯維氏酵母(Kluyveromyceslactis)的羰基還原酶(JP-A平11-187869);II類脂肪酸合成酶的P-酮?；??；d體蛋白質還原酶(JP-A2000-189170);得自Pichiafinlandica的(R)-2-辛醇脫氬酶(EP1179595A1);得自乳芽孢桿菌(高加索酸奶乳桿菌(US5200335)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)(DE19610984Al)(ActaCrystallogrDBiolCrystallogr.2000年12月；56Pt12:1696-8)、稍小乳桿菌(Lactobacillusminor)(DE10119274);假單胞菌屬(Pseudomonas)(US05385833)(ApplMicrobiolBiotechnol.2002年8月；59(4—5):483-7.Epub2002年1月26曰，J.Org.Chem.1992,57，1532)的生物體的R-特異性仲醇脫氫酶。除了來自假單胞菌屬、來自乳芽孢桿菌和來自Pichiafinlandica(EP1179595A1)的酶之外，已知的酶通常不4妄受仲醇作為底物并且也不能催化仲醇的氧化。在工業(yè)的酶還原方法中，所述的酶因此必須與分別負責輔助因子NADH或NADPH再生的另一些酶結合。適合于NAD(P)H再生的這類酶是曱酸鹽脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、蘋果酸鹽脫氫酶、甘油脫氫酶和醇脫氫酶，其優(yōu)選與用于還原4-卣代-3-氧代丁酸酯的酶一起表達?？梢宰C明例如同時表示來自Candidamagnoliae的羰基還原酶的基因以及來自巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)的葡萄糖脫氫酶的基因的大腸桿菌(Escherichiacoli)的重組細胞可有效地用于含水/有機兩相體系，其中實現(xiàn)了>40%(重量百分比)的底物濃度(ApplMicrobiolBiotecho1(2001)，55;590-595，AnnNYAcadSci.1998年12月13日；864:87-95)。迄今為止已經利用了使用2-丙醇的底物結合的輔酶再生而成功實施采用來自乳芽孢桿菌族的方法(稍小乳桿菌；DE10119274)，其中還通過使用含水/有機兩相體系在高濃度下實現(xiàn)了不溶性底物的還原(US5342767、DE10119274)。當分別將2-丙醇或2-丁醇用于底物結合的輔酶再生時，大多數(shù)酶對2-丙醇和2-丁醇的低耐受性被主要看作是限制。通常，采用明顯低于10體積％的2-丙醇濃度。在現(xiàn)有技術中，沒有獲知其中描述了將來自酵母的R-特異性氧化還原酶用于使用2-丙醇和/或2-丁醇的底物結合的輔酶再生的方法。由于共同底物2-丙醇的限制使用，因此僅僅獲得了不令人滿意的底物濃度和轉化率(AngewChemieIntEdEngl2002,41:634-637,BiotechnolBioeng2004年4月5日；86(1):55—62)。最近，可以從Rhodococcusruber中分離出S-特異性的中等《連醇脫氫酶，其還在50-80%(體積％)的顯著更高的2-丙醇濃度下仍然穩(wěn)定并且活性。(BiotechnolBioeng2004年4月5日；86(1):55-62)、WO03/078615)。本發(fā)明目的在于克服所述缺陷并且涉及通式I的酮化合物的對映體選擇性酶還原方法R,-C(O)-R2(I)其中Rl表示以下基團之一1)-(C廣C20)-烷基，其中烷基是直鏈或支鏈的，2)-(C2-C2Q)-鏈烯基，其中鏈烯基是直鏈或支鏈的并且任選地包含至多4個雙纟定，3)-(C2-C2o)-炔基，其中炔基是直鏈或支鏈的并且任選地包含至多4個叁鍵，4)-(C6-C14)-芳基，5)-(C廣Cs)-烷基-(C6-d4)-芳基，6)未取代或者被-OH、鹵素、-N02和/或-NH2取代一次、二次或三次的-(C5-C14)-雜環(huán)，或7)-(C3-C7)-環(huán)烷基，其中上面在1)-7)下提及的基團是未取代的或者彼此獨立地被-OH、卣素、-N02和/或-NH2取代一次、二次或三次，并且R2表示以下基團之一8)-(d-C6)-烷基，其中烷基是直鏈或支鏈的，9)-(C2-C6)-鏈烯基，其中鏈烯基是直鏈或支鏈的并且任選地包含至多3個雙一睫，10)_(C2-C6)-炔基，其中炔基是直鏈或支鏈的并且任選地包含2個叁鍵，或11)-(Q-C10)-烷基-C(O)-O-(d-C6)-烷基，其中烷基是直鏈或支鏈的并且是未取代的或者被-OH、卣素、-N02和/或-NH2取代一次、二次或三次，其中上面在8)-11)下提及的基團是未取代的或者彼此獨立地被-OH、鹵素、-N02和/或-NH2取代一次、二次或三次，其特征在于在存在輔助因子的條件下用R-特異性氧化還原酶處理包含以下物質的液態(tài)單相混合物(a)至少5%重量/體積的式(I)化合物，(b)至少15體積％的2-丙醇和/或2-丁醇，和(c)水，以形成通式II的手性羥基化合物R-CH(OH)-R2(II)其中Ri和R2具有上述含義。術語"芳基"意在包括在環(huán)中含6-14個碳原子的芳族碳基團。-(C6-C14)-芳基基團例如為苯基，萘基例如l-萘基、2-萘基，聯(lián)苯基例如2-聯(lián)苯基、3-聯(lián)苯基和4-聯(lián)苯基，蒽基或藥基。聯(lián)苯基基團、萘基基團和特別是苯基基團是優(yōu)選的芳基基團。術語"卣素"是指選自氟、氯、溴或碘系列的元素。術語"_(C-C2o)-烷基"是指其的碳鏈是直鏈或支鏈的并且含有1-20個碳原子的烴部分，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基或癸基。術語"-Co-烷基"意指共價鍵。術語"-(C3-C7)-環(huán)烷基"意在包括環(huán)狀烴基團，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基或環(huán)庚基。術語"_(C5-C")-雜環(huán)"意指部分飽和或全部飽和的單環(huán)或雙環(huán)的5-元至14-元雜環(huán)。N、O和S是雜原子的例子。衍生自吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、喝唑、異喁唑、噻唑、異噻唑、四唑、1,2,3,5-氧雜噻二唑-2-氧化物、三唑酮、p惡二唑酮、異哺唑酮、氧雜二喝唑啉二酮、被F、-CN、CF3或-C(O)-O-(d-C4)-烷基取代的三唑、3-羥基吡咯-2,4-二酮、5-氧代-l,2,4—p塞二峻、p比咬、p比。秦、嘧咬、卩引咮、異口引咮、p引峻、酞。秦、唾淋、異喹啉、喹喔啉、喹p惡啉、鄰二氮雜萘、^啉和所述雜環(huán)的苯稠合(benz-anelliert)、環(huán)戊-、環(huán)己-或環(huán)庚-稠合(anelliert)的衍生物是這些雜環(huán)的例子。特別優(yōu)選這些基團2-或3-他咯基、苯基吡咯基例如4-或5-苯基-2-p比咯基、2-吹喃基、2-逸吩基、4-咪峻基、曱基-咪唑基例如1-曱基-2-、-4-或-5-咪峻基、1,3-p塞哇-2-基、2-p比咬基、3-p比咬基、4-p比咬基、2-、3-或4-o比咬基-:N-氧化物、2-p比口秦基、2-、4_或5-嘧咬基、2-、3-或5-口引哚基、取代的2-吲哚基例如1-曱基-、5-甲基-、5-曱氧基-、5-芐氧基—、5-氯_或4,5_二曱基—2-吲p朵基、1—千基-2—或—3-吲"朵基、4,5,6,7—四氫一2—。引口呆基、環(huán)庚[b]—5—p比p各基、2-、3-或4—喹啉基(Chinolyl)、1-、3-或4-異p奎啉基、1-氧代-1,2-二氫-3-異喹啉基、2-喹喔啉基、2-苯并呋喃基、2-苯并-噻吩基、2-苯并嗜唑基或苯并噻唑基或二氫吡啶基、吡咯烷基例如2-或3-(N-曱基吡咯烷基)、哌。秦基、嗎啉基、硫代嗎啉基、四氫噻吩基或苯并二氧戊環(huán)基。本發(fā)明基于這樣的知識在使用R-特異性醇脫氫酶或氧化還原酶時，這些也可與在遠高于15體積％并且特別高于25體積％的2-丙醇和/或2-丁醇濃度下使用。這還開啟了在均勻的含水/有機體系中以對映體選擇性方式將高濃度的低水溶性底物例如4-卣代-3-氧代丁酸酯酶解還原的可能性。如果將生成的手性醇不需要預先分離而以連續(xù)的過程直接供送到在單相含水/有機反應混合物中進行的連續(xù)反應中，則這是特別有利的。這出現(xiàn)在例如4-氯乙酰乙酸酯的對映體選擇性還原期間，其中可以將該均勻反應混合物中生成的產物S-4-氯-3-羥基丁酸乙酯直接加入氰化過程并且可以將其進一步加工成(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯(WO03/097581Al)。術語"R-特異性氧化還原酶"和醇脫氫酶分別意在包括優(yōu)選將未取代的羰基化合物例如2-丁酮、2-辛酮或苯乙酮還原成相應的R-羥基化合物例如R-2-丁醇、R-2-辛醇或R-2-苯基乙醇的那些。根據(jù)本發(fā)明使用的R-特異性氧化還原酶優(yōu)選屬于微生物來源并且特別來源于乳芽孢桿菌族，特別是乳芽孢桿菌屬例如高加索酸奶乳桿菌(US5,200,335)、短乳桿菌(DE19610984Al)(ActaCrystallogrDBiolCrystallogr.2000年12月；56Pt12:1696-8)、稍小孢桿菌(DE10119274)或Leuconostoccarnosum的細菌，或者來源于酵母，特別是畢赤酵母(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)、Pachysolen、Debaromyces或伊氏酵母(Issatschenkia)屬,特別地優(yōu)選來源于Pichiafinlandica(EP1179595Al)。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，優(yōu)選將NAD(P)H用作輔助因子。術語"NADPH"是指還原的煙酰胺腺噤呤二核苷酸磷酸。術語"NADP"是指煙酰胺腺噪呤二核苷酸磷酸。根據(jù)本發(fā)明的方法的一個實施方案的特征在于當使用細菌來源的氧化還原酶時，該液態(tài)單相混合物含有至少25體積％的2-丙醇和/或2-丁醇。根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個實施方案在于該液態(tài)單相混合物包含25-90體積％，特別為35-70體積％的2-丙醇和/或2-丁醇。通式(I)化合物優(yōu)選以5-50%重量/體積，特別為15-50%重量/體積的數(shù)量包含于該液態(tài)單相混合物中。如果使用來源于酵母的氧化還原酶，則該液態(tài)單相混合物優(yōu)選包含至少15體積％的2-丙醇。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，優(yōu)選將4-氯乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸曱酯、3-氧代戊酸乙酯、4-羥基-2-丁酮、丙酮酸乙酯、2,3-二氯苯乙酮、1-[3,5-雙(三氟甲基)苯基]乙烷-1-酮、苯乙酮、2-辛酮、3-辛酮、2,5-己二酮、1，4-二氯-2-丁酮、乙酰氧基丙酮、苯酰基氯、4-溴乙酰乙酸乙酯、1,1-二氯丙酮、1,1,3-三氯丙酮或1-氯丙酮用作通式(I)化合物。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，酶可以完全精制或部分精制或者含于細胞中的狀態(tài)使用。這樣做時，使用的細胞可以天然、滲透或溶解的狀態(tài)提供?？梢允褂?0000至優(yōu)選10000000單位(U)的氧化還原酶/每kg待反應的式I化合物。其中，酶單位1U對應于每分鐘(min)將1pmol式I化合物反應所需的酶數(shù)量。可以將緩沖劑例如磷酸鉀、pH值為5-10,優(yōu)選pH值為6-9的Tris/HCl或三乙醇胺緩沖劑加入水中。另外，緩沖劑可以含有使酶穩(wěn)定的離子，例如鎂離子。此外，在根據(jù)本發(fā)明的方法中可以使用其它醇脫氫酶的穩(wěn)定劑例如甘油、山梨糖醇、1,4-DL-二硫代蘇糖醇(DTT)或二曱亞砜(DMSO)?；谒?，輔助因子NAD(P)H的濃度為0.001mM-1mM,特別為0.01mM-0.1mM。溫度為例如約10°C-6CTC，優(yōu)選20。C-35°C。一種提高酮化合物的轉化率的方法變型在于在方法期間從反應混合物中逐步或連續(xù)除去氧化的共底物。此外，可以將新鮮共底物、酶或輔助因子逐步或連續(xù)加入反應批料中。根據(jù)本發(fā)明的方法例如在由玻璃或金屬制成的反應容器中進行。出于該目的，將組分單獨轉移到反應容器中并且在例如氮氣或空氣的氣氛下攪拌。取決于使用的底物和式I化合物，反應時間持續(xù)1小時-96小時，特別為2小時-24小時。借助于以下實施例進一步詳細地解釋本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。式I化合物的還原適宜地這樣進行將下面示出的組分轉移到反應容器中并且于徹底混合條件下在室溫下孵化。當反應結束時，可以取決于溶解度通過萃取從含水反應溶液中、通過蒸餾從反應溶液中，或者通過萃取和蒸餾組合將產品分離和精制。在所有以下實施例中，酶以粗提取物的形式使用。實施例1:(S)-乙基-4-氯-3-羥基丁酸的合成<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例2:(R)-甲基-3-羥基丁酸的合成<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例3:乙泉-D-乳酸鹽的合成<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例4:(R)-1,3-丁二醇的合成<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*從批料中將形成的丙酮兩次蒸出，并且隨后再次將數(shù)量與反應開始時相等的2-丙醇和酶加入反應混合物。以該方式，即使在底物濃度為48%的批料中也可以實現(xiàn)90%的轉化率。實施例5:(R)-2-辛醇的合成組分數(shù)量反應體積中的％濃度緩沖劑(TEApH-7,lraMMgCl2,10%甘油)270mlNADP[M=765g/mol]27mg35pmol(=0,023raM)共底物2-丙醇卿ml60%2-辛酮(128g/mol'd=0,8)300ml20o/o(v/v)16%(w/v)1.87M酶(得自L.minor的R-ADH=1000U/ml30000單位(30ml)體積1500體系工藝過程*:單相將丙酮蒸出，逐漸力口入2-丙醇掉化時間24h2-丙醇的總消耗量1350ml轉化率97%ee-值100o/oRttnNADP53000酶消耗量200000U/kg*從批料中將形成的丙酮一次蒸出，并且隨后再次將數(shù)量與反應開始時相等的2-丙醇和酶加入反應混合物。以該方式，即使在底物濃度為20%的批料中也可以實現(xiàn)97%的轉化率。實施例6:(R,R)-2,5-己二醇的合成<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>從批料中將形成的丙酮一次蒸出，并且隨后再次將數(shù)量與反應開始時相等的2-丙醇和酶加入反應混合物。實施例7:(S)-乙基-4-氯-3-羥基丁酸的合成<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實施例8:OR)-1-『3,5-雙〖三氟甲基)苯臬1乙烷-1-酵的合成<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>權利要求1.一種通式I的酮化合物的對映體選擇性酶還原方法R1-C(O)-R2(I)其中R1表示以下基團之一1)-(C1-C20)-烷基，其中烷基是直鏈或支鏈的，2)-(C2-C20)-鏈烯基，其中鏈烯基是直鏈或支鏈的并且視需要包含至多4個雙鍵，3)-(C2-C20)-炔基，其中炔基是直鏈或支鏈的并且視需要包含至多4個叁鍵，4)-(C6-C14)-芳基，5)-(C1-C8)-烷基-(C6-C14)-芳基，6)未取代或者被-OH、鹵素、-NO2和/或-NH2取代一次、二次或三次的-(C5-C14)-雜環(huán)，或7)-(C3-C7)-環(huán)烷基，其中上面在1)-7)下提及的基團是未取代的或者彼此獨立地被-OH、鹵素、-NO2和/或-NH2取代一次、二次或三次，并且R2表示以下基團之一8)-(C1-C6)-烷基，其中烷基是直鏈或支鏈的，9)-(C2-C6)-鏈烯基，其中鏈烯基是直鏈或支鏈的并且視需要包含至多3個雙鍵，10)-(C2-C6)-炔基，其中炔基是直鏈或支鏈的并且視需要包含2個叁鍵，或11)-(C1-C10)-烷基-C(O)-O-(C1-C6)-烷基，其中烷基是直鏈或支鏈的并且是未取代的或者被-OH、鹵素、-NO2和/或-NH2取代一次、二次或三次，其中上面在8)-11)下提及的基團是未取代的或者彼此獨立地被-OH、鹵素、-NO2和/或-NH2取代一次、二次或三次，特征在于在存在輔助因子的情況下用R-特異性氧化還原酶處理包含以下物質的液態(tài)單相混合物(a)至少5％重量/體積的式(I)化合物，(b)至少15體積％的2-丙醇和/或2-丁醇，和(c)水，以形成通式II的手性羥基化合物R1-CH(OH)-R2(II)其中R1和R2具有上述含義。2.根據(jù)權利要求1的方法，特征在于該R-特異性氧化還原酶屬于微生物來源并且特別來源于乳芽孢桿菌族，特別是乳芽孢桿菌屬的細菌，或者來源于酵母，特別是畢赤酵母、假絲酵母屬、Pachysolen、Debaromyces或J尹氏酵母屬。3.根據(jù)權利要求1或2的方法，特征在于使用NAD(P)H作為輔助因子。4.根據(jù)權利要求1-3任一項的方法，特征在于在使用細菌來源的氧化還原酶時，該液態(tài)單相混合物包含至少25體積％的2-丙醇和/或2-丁醇。5.根據(jù)權利要求1-3任一項的方法，特征在于該液態(tài)單相混合物包含25-90體積％，特別為35-70體積°/。的2-丙醇和/或2-丁醇。6.根據(jù)權利要求1-5任一項的方法，特征在于該液態(tài)單相混合物包含量為5-50%重量/體積，特別為15-50%重量/體積的通式(I)化合物。7.根據(jù)權利要求1-6任一項的方法，特征在于將4-氯乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸甲酯、3-氧代戊酸乙酯、4-羥基-2-丁酮、丙酮酸乙酯、2,3-二氯苯乙酮、苯乙酮、1-[3,5-雙(三氟曱基)苯基]乙烷-1-酮、2-辛酮、3-辛酮、2,5-己二酮、1,4-二氯-2-丁酮、乙酰氧基丙酮、苯?；?、4-溴乙酰乙酸乙酯、1,1-二氯丙酮、1,1,3-三氯丙酮或1-氯丙酮用作通式(I)化合物。全文摘要本發(fā)明涉及一種在輔助因子的存在下使用R-特異性氧化還原酶將酮化合物，特別是4-鹵代-3-氧代丁酸酯分別對映體選擇性酶還原成相應的R-醇或S-4-鹵代-3-羥基丁酸酯的方法。文檔編號C12P7/02GK101128594SQ200680005628公開日2008年2月20日申請日期2006年2月21日優(yōu)先權日2005年2月21日發(fā)明者A·古普塔,A·特申特謝爾,M·博布科瓦申請人:Iep有限責任公司