專利名稱：一種殼聚糖納米纖維復(fù)合膜固定化酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種殼聚糖納米纖維復(fù)合膜用于固定化酶的技術(shù)。
背景技術(shù)：
酶是由活細胞產(chǎn)生的具有高效催化功能、高度專一性和高度受控性的一類特殊蛋白質(zhì)，它能特定地促成某個化學(xué)反應(yīng)而本身卻不參加反應(yīng)，具有反應(yīng)效率高、條件溫和、反應(yīng)產(chǎn)物污染小、能耗低、反應(yīng)容易控制等特點，因此得到廣泛的應(yīng)用。但其在酸、堿、熱及有機溶液等條件下易發(fā)生酶蛋白的變性，從而使酶活性降低或喪失，而且酶反應(yīng)多在溶液中進行，反應(yīng)完成后不易回收，反應(yīng)產(chǎn)物分離提純困難，且難以實現(xiàn)工業(yè)上的連續(xù)化、自動化生產(chǎn)，因此酶工程的應(yīng)用發(fā)展受到了很大的限制，固定化酶技術(shù)為這些問題的解決提供了有效的手段。研究表明，雖然固定化酶能提高酶的穩(wěn)定性，但與自由酶相比，固定化酶的生物活性均有所下降。其中，酶的失活部分源于載體材料表面與酶蛋白分子非生物特異性相互作用所導(dǎo)致的變異。由于大多數(shù)酶均是從細胞中分離出的蛋白質(zhì)，在酶蛋白經(jīng)固定化以后，酶與載體之間的一些非生物特異性相互作用改變了其結(jié)構(gòu)和微環(huán)境，從而導(dǎo)致固定化酶活性有所降低甚至失活。因此，一些天然的物質(zhì)如殼聚糖，由于其具有良好的生物相容性而被廣泛地用作酶固定化載體。可將殼聚糖制成各種結(jié)構(gòu)形態(tài)的載體材料，如薄膜、多孔膜和多孔微球等用于酶的固定化。[1]Amorim RVS，Melo ES，Carneiro-da-Cunha MG，Ledingham WM，Campos-Takaki GM.Chitosan from syncephalastrum racemosum used as a film support for lipaseimmobilization.Bioresource Technol 2003，8935-39；[2]Tan TW，Wang F，Zhang H.Preparationof PVA/chitosan lipase membrane reactor and its application in synthesis of monoglyceride.J MolCatal B-Enzym 2002，18325-331；[3]Pereira EB，De Castro HF，De Moraes FF，Zanin GM.Kinetic studies oflipase from Candida rugosa-A comparative study between free and immobilizedenzyme onto porous chitosan beads.Appl Biochem Biotech 2001，91739-752；[4]Magnin D，Dumitriu S，Magny P，Chornet E.Lipase immobilization into porous chitoxan beadsActivities inaqueous and organic media and lipase localization.Biotechnol Prog 2001，17734-737.又如CN01126606.6用珠狀殼聚糖作載體材料，用于酶的固定化；CN200510045268.8是用交聯(lián)劑將殼聚糖負載在硅膠上，再將其用于酶的固定化。這種天然載體材料能夠在一定程度上減少酶和載體間不利的相互作用，為固定化酶提供一種生物友好的微環(huán)境，從而提高固定化酶的活性。
另一方面，固定化酶載體材料的形態(tài)結(jié)構(gòu)對固定化酶的載酶量、生物活性以及催化效率亦有顯著的影響。研究表明一些具有多孔結(jié)構(gòu)、大比表面積的載體材料有利于提高固化酶的載酶量，并有利于底物向酶活性中心和產(chǎn)物向反應(yīng)區(qū)域以外擴散以提高固定化酶的生物活性和催化效率。用于固定化酶載體材料形態(tài)結(jié)構(gòu)種類繁多，有膜材料、微球和納米粒子等。其中，由于靜電紡納米纖維復(fù)合膜具有大的比表面積和高的孔隙率，并且可以通過紡絲條件進行調(diào)控等優(yōu)點，越來越引起人們的重視。近些年，利用靜電紡絲法制備殼聚糖納米纖維復(fù)合膜引起了許多研究者的興趣?？蓪ぞ厶桥c聚乙烯醇或聚乙二醇的溶液混合進行靜電紡絲制備納米纖維復(fù)合膜。[5]Ohkawa K，Cha D，Kim H，Nishida A，Yamamoto H.Electrospinning ofChitosan.Macromol Rapid Commun 2004，251600-1605；[6]Li L，Hsieh Y.-L.Chitosanbicomponent nanofibers and nanoporous fibers.Carbohydrate Research 2006，341374-381；[7]Mincheva R，Manolova N，Paneva D，Rashkov I.Preparation of polyelectrolyte-containingnanofibers by electrospinning in the presence of a non-ionogenic water-soluble polymer.JBioactive Compat Polym 2005，20419-435.又如，CN 200410019230.9將殼聚糖與聚乙烯醇的混合溶液靜電紡絲制備超細纖維復(fù)合膜；CN 200510014826.4將殼聚糖、聚乙烯醇和碳納米管混合體系靜電紡絲制備具有抗菌、抗靜電的殼聚糖/碳納米管超細纖維復(fù)合膜。CN200610052953.8通過靜電紡絲和堿處理的方法，可以得到一種在水溶液中具有穩(wěn)定形態(tài)結(jié)構(gòu)的殼聚糖納米纖維膜。這種具有穩(wěn)定形態(tài)結(jié)構(gòu)的殼聚糖納米纖維膜制備技術(shù)方案操作步驟如下將殼聚糖溶于90％的乙酸和10％水組成的混合溶劑，配成重量百分比為2～5％的溶液；將聚乙烯醇溶于水中，配成重量百分比為5～10％的溶液；將殼聚糖和聚乙烯醇溶液按體積比1～5∶1混合均勻，再注入到多道靜電紡絲裝置中，在電壓為5千伏～30千伏、噴絲頭溶液流量為0.1毫升/小時～1.0毫升/小時、接收距離為5厘米～20厘米的條件下進行靜電紡絲和匯集成纖維復(fù)合膜。再將所得到的殼聚糖/聚乙烯醇納米纖維復(fù)合膜浸入0.1～5摩爾/升的強堿性溶液中，在常溫中浸泡2～6小時，再用去離子水重復(fù)清洗，直至洗液呈中性，最后納米纖維復(fù)合膜放入真空烘箱中于60℃下干燥24小時。
但是，目前還沒有采用這種具有良好親水性、生物相容性和在水溶液中具有穩(wěn)定形態(tài)結(jié)構(gòu)的殼聚糖納米纖維膜用于酶固定化。所以，有必要研制一種利用具有形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、比表面積高、空隙率大和生物相容性良好的殼聚糖納米纖維復(fù)合膜用于酶固定化的方法，有效提高固定化酶的載酶量、消除酶催化反應(yīng)時的擴散控制和提高固定化酶的催化效率；同時，殼聚糖納米纖維復(fù)合膜為固定化酶提供一種良好的生物相容性界面，從而促進固定化酶活性和穩(wěn)定性的提高。

發(fā)明內(nèi)容
針對一些用于固定化酶的載體與酶之間非生物特異性的相互作用容易導(dǎo)致酶活性的降低，以及固定化酶的載酶量和催化效率低、固定化酶載體材料難以回收等問題，本發(fā)明提供一種具有高比表面積、高空隙率和良好生物相容性的殼聚糖納米纖維復(fù)合膜材料的制備及其用于酶固定化的方法。
本發(fā)明的殼聚糖納米纖維復(fù)合膜上酶的固定化技術(shù)方案如下將殼聚糖納米纖維復(fù)合膜浸入1～20％的戊二醛水溶液中，密封后于25℃的恒溫條件下震蕩2～12小時，震蕩速度為20～120轉(zhuǎn)/分鐘；取出納米纖維復(fù)合膜并用pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液充分沖洗，以除去膜上殘余的戊二醛；將經(jīng)戊二醛活化的納米纖維復(fù)合膜浸沒于濃度為1～20毫克/毫升的酶磷酸鹽緩沖溶液中，密封后于4℃的恒溫條件下震蕩1～5小時，震蕩速度為20～120轉(zhuǎn)/分鐘；從溶液中取出膜，用去離子水重復(fù)清洗，共清洗3～5次，即可得到殼聚糖納米纖維復(fù)合膜固定化酶；將固定化酶的納米纖維復(fù)合膜浸入pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，于4℃下儲存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明的優(yōu)點是1)殼聚糖來源充足，成本低廉，可用于工業(yè)化大生產(chǎn)。
2)殼聚糖納米纖維復(fù)合膜的制備及其酶固定化工藝簡單。
3)殼聚糖納米纖維復(fù)合膜具有高比表面積和高空隙率，有利于提高固定化酶的載酶量、消除酶催化反應(yīng)時的擴散控制和提高固定化酶的催化效率。
4)這種具有納米尺寸纖維復(fù)合膜酶固定化的載體，易于從反應(yīng)體系中回收，可以重復(fù)使用，極大地提高酶的利用率和降低生產(chǎn)成本。
5)殼聚糖納米纖維復(fù)合膜具有良好的生物相容性，可以為其表面固定化酶蛋白提供友好仿生環(huán)境，有效地提高固定化酶生物活性和穩(wěn)定性。
具體實施例方式
殼聚糖納米纖維復(fù)合膜制備方法將殼聚糖溶于90％的乙酸和10％水組成的混合溶劑，配成重量百分比為2～5％的溶液；將聚乙烯醇溶于水中，配成重量百分比為5～10％的溶液；將殼聚糖和聚乙烯醇溶液按體積比1～5∶1混合均勻，再注入到多道靜電紡絲裝置中，在電壓為5千伏～30千伏、噴絲頭溶液流量為0.1毫升/小時～1.0毫升/小時、接收距離為5厘米～20厘米的條件下進行靜電紡絲和匯集成纖維直徑在50～1000納米的復(fù)合膜。再將所得到的殼聚糖/聚乙烯醇納米纖維復(fù)合膜浸入0.1～5摩爾/升的強堿性溶液中，在常溫中浸泡2～6小時，再用去離子水重復(fù)清洗，直至洗液呈中性，最后納米纖維復(fù)合膜放入真空烘箱中于60℃下干燥24小時。
殼聚糖的分子量為5～100萬，聚乙烯醇的聚合度為1500～2500，醇解度為85％～99％；通過戊二醛交聯(lián)法將酶固定于殼聚糖納米纖維復(fù)合膜上，具體方法為將殼聚糖納米纖維復(fù)合膜浸入1～20％的戊二醛水溶液中，密封后于25℃的恒溫條件下震蕩2～12小時，震蕩速度為20～120轉(zhuǎn)/分鐘；取納米纖維復(fù)合膜并用pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液充分沖洗，以除去膜上殘余的戊二醛；將經(jīng)戊二醛活化的納米纖維復(fù)合膜浸沒于濃度為1～20毫克/毫升的酶磷酸鹽緩沖溶液中，密封后于4℃的恒溫條件下震蕩1～5小時，震蕩速度為20～120轉(zhuǎn)/分鐘；從溶液中取出膜，用去離子水重復(fù)清洗，共清洗3～5次，即可得到殼聚糖納米纖維復(fù)合膜固定化酶；將固定化酶的納米纖維復(fù)合膜浸入pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，于4℃下儲存?zhèn)溆谩?br> 固定于該種材料上酶是脂肪酶、過氧化氫酶、蛋白酶、過氧化物酶、纖維素酶、漆酶、脫氫酶、氧化酶的一種。
以下實施實例對本發(fā)明做更詳細的描述，但所述例不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。納米纖維復(fù)合膜纖維直徑是采用掃描電鏡分析進行測定。
將殼聚糖納米纖維復(fù)合膜作為酶固定化的載體，進行酶的固定化的實施方法例1將1克殼聚糖納米纖維復(fù)合膜浸入2％的戊二醛水溶液中，密封后于25℃的恒溫條件下震蕩3小時，震蕩速度為40轉(zhuǎn)/分鐘；取納米纖維復(fù)合膜并用pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液充分沖洗，以除去膜上殘余的戊二醛；將經(jīng)戊二醛活化的納米纖維復(fù)合膜浸沒于濃度為2毫克/毫升的脂肪酶磷酸鹽緩沖溶液中，密封后于4℃的恒溫條件下震蕩2小時，震蕩速度為40轉(zhuǎn)/分鐘；從溶液中取出膜，用去離子水重復(fù)清洗，共清洗3次，即可得到脂肪酶固定化的殼聚糖納米纖維復(fù)合；將固定化酶的納米纖維復(fù)合膜浸入pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，于4℃下儲存?zhèn)溆谩?br> 例2將1克殼聚糖納米纖維復(fù)合膜浸入10％的戊二醛水溶液中，密封后于25℃的恒溫條件下震蕩5小時，震蕩速度為60轉(zhuǎn)/分鐘；取納米纖維復(fù)合膜并用pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液充分沖洗，以除去膜上殘余的戊二醛；將經(jīng)戊二醛活化的納米纖維復(fù)合膜浸沒于濃度為6毫克/毫升的脂肪酶磷酸鹽緩沖溶液中，密封后于4℃的恒溫條件下震蕩4小時，震蕩速度為60轉(zhuǎn)/分鐘；從溶液中取出膜，用去離子水重復(fù)清洗，共清洗4次，即可得到脂肪酶固定化的殼聚糖納米纖維復(fù)合；將固定化酶的納米纖維復(fù)合膜浸入pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，于4℃下儲存?zhèn)溆谩?br> 例3將1克殼聚糖納米纖維復(fù)合膜浸入5％的戊二醛水溶液中，密封后于25℃的恒溫條件下震蕩8小時，震蕩速度為80轉(zhuǎn)/分鐘；取納米纖維復(fù)合膜并用pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液充分沖洗，以除去膜上殘余的戊二醛；將經(jīng)戊二醛活化的納米纖維復(fù)合膜浸沒于濃度為8毫克/毫升的過氧化氫酶磷酸鹽緩沖溶液中，密封后于4℃的恒溫條件下震蕩6小時，震蕩速度為80轉(zhuǎn)/分鐘；從溶液中取出膜，用去離子水重復(fù)清洗，共清洗5次，即可得到過氧化氫酶固定化的殼聚糖納米纖維復(fù)合；將固定化酶的納米纖維復(fù)合膜浸入pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，于4℃下儲存?zhèn)溆谩?br> 例4將1克殼聚糖納米纖維復(fù)合膜浸入15％的戊二醛水溶液中，密封后于25℃的恒溫條件下震蕩10小時，震蕩速度為100轉(zhuǎn)/分鐘；取納米纖維復(fù)合膜并用pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液充分沖洗，以除去膜上殘余的戊二醛；將經(jīng)戊二醛活化的納米纖維復(fù)合膜浸沒于濃度為12毫克/毫升的過氧化氫酶磷酸鹽緩沖溶液中，密封后于4℃的恒溫條件下震蕩4小時，震蕩速度為100轉(zhuǎn)/分鐘；從溶液中取出膜，用去離子水重復(fù)清洗，共清洗3次，即可得到過氧化氫酶固定化的殼聚糖納米纖維復(fù)合；將固定化酶的納米纖維復(fù)合膜浸入pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，于4℃下儲存?zhèn)溆谩?br> 例5將1克殼聚糖納米纖維復(fù)合膜浸入10％的戊二醛水溶液中，密封后于25℃的恒溫條件下震蕩12小時，震蕩速度為120轉(zhuǎn)/分鐘；取納米纖維復(fù)合膜并用pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液充分沖洗，以除去膜上殘余的戊二醛；將經(jīng)戊二醛活化的納米纖維復(fù)合膜浸沒于濃度為16毫克/毫升的纖維素酶磷酸鹽緩沖溶液中，密封后于4℃的恒溫條件下震蕩4小時，震蕩速度為120轉(zhuǎn)/分鐘；從溶液中取出膜，用去離子水重復(fù)清洗，共清洗4次，即可得到纖維素酶固定化的殼聚糖納米纖維復(fù)合；將固定化酶的納米纖維復(fù)合膜浸入pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，于4℃下儲存?zhèn)溆谩?br> 例6將1克殼聚糖納米纖維復(fù)合膜浸入20％的戊二醛水溶液中，密封后于25℃的恒溫條件下震蕩12小時，震蕩速度為120轉(zhuǎn)/分鐘；取納米纖維復(fù)合膜并用pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液充分沖洗，以除去膜上殘余的戊二醛；將經(jīng)戊二醛活化的納米纖維復(fù)合膜浸沒于濃度為20毫克/毫升的纖維素酶磷酸鹽緩沖溶液中，密封后于4℃的恒溫條件下震蕩6小時，震蕩速度為120轉(zhuǎn)/分鐘；從溶液中取出膜，用去離子水重復(fù)清洗，共清洗5次，即可得到纖維素酶固定化的殼聚糖納米纖維復(fù)合；將固定化酶的納米纖維復(fù)合膜浸入pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，于4℃下儲存?zhèn)溆谩?br> 權(quán)利要求
1.一種殼聚糖納米纖維復(fù)合膜用于固定化酶的方法，其特征在于將殼聚糖納米纖維復(fù)合膜浸入1～20％的戊二醛水溶液中，密封后于25℃的恒溫條件下震蕩2～12小時，震蕩速度為20～120轉(zhuǎn)/分鐘；取出納米纖維復(fù)合膜并用pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液充分沖洗，以除去膜上殘余的戊二醛；將經(jīng)戊二醛活化的納米纖維復(fù)合膜浸沒于濃度為1～20毫克/毫升的酶磷酸鹽緩沖溶液中，密封后于4℃的恒溫條件下震蕩1～5小時，震蕩速度為20～120轉(zhuǎn)/分鐘；從溶液中取出膜，用去離子水反復(fù)清洗3～5次，即可得到殼聚糖納米纖維復(fù)合膜固定化酶；將固定化酶的納米纖維復(fù)合膜浸入pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，于4℃下儲存?zhèn)溆谩?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述固定化酶的方法，其特征在于，固定于該種材料上的酶為脂肪酶、蛋白酶、過氧化物酶、纖維素酶、漆酶、脫氫酶及氧化酶中的一種。
全文摘要
一種殼聚糖納米纖維復(fù)合膜用于固定化酶的方法。它以殼聚糖和聚乙烯醇溶于冰醋酸和水的混合溶劑中形成透明溶液，通過靜電紡絲法制成殼聚糖納米纖維復(fù)合膜，并以其作為酶固定化的載體，通過化學(xué)鍵合的方法將酶固定到納米纖維復(fù)合膜上。本發(fā)明利用納米纖維復(fù)合膜的高比表面積、高空隙率以及殼聚糖所具有的反應(yīng)性氨基和生物相容性，可以得到具有載酶量高、比活高、催化效率高的殼聚糖納米纖維復(fù)合膜固定化酶。該固定化酶具有易從反應(yīng)體系中回收、可反復(fù)多次使用、能提高酶的利用率和降低生產(chǎn)成本等優(yōu)點，且其制備過程簡單。
文檔編號C12N11/00GK1948474SQ20061015456
公開日2007年4月18日 申請日期2006年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月8日
發(fā)明者黃小軍, 徐志康 申請人:浙江大學(xué)