專(zhuān)利名稱：利用促血管生成素－2單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)確定中國(guó)人群中出血性腦卒中易感性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用促血管生成素-2(Angiopoietin-2，以下簡(jiǎn)稱Ang2)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)確定患者對(duì)出血性腦卒中的遺傳易感性的方法，用于該方法的物質(zhì)、組合物、試劑盒及其用途。
背景技術(shù)：
腦卒中是一組以腦部缺血及出血性損傷癥狀為主要臨床表現(xiàn)的疾病，分為出血性腦卒中(腦出血或蛛網(wǎng)膜下腔出血)和缺血性腦卒中(腦梗塞和腦血栓形成)兩大類(lèi)。
在中國(guó)，腦卒中是僅次于癌癥的第二大死因，平均每10萬(wàn)人中就有137人死于此病，每年死于腦卒中的病人約有150萬(wàn)。更為嚴(yán)重的是，腦卒中是致殘率極高的疾病。中國(guó)現(xiàn)有的500萬(wàn)左右的腦卒中患者中，75％有不同程度的殘疾。因此，積極研究腦卒中的病因及治療方案，大幅度降低腦卒中的發(fā)病率與死亡率，對(duì)于延長(zhǎng)病人壽命，提高生活質(zhì)量，降低醫(yī)療費(fèi)用支出，具有重要意義。
腦卒中是一種復(fù)雜的多因素疾病，是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果[59]。出血性腦卒中根據(jù)出血部位分為腦出血和蛛網(wǎng)膜下腔出血。大腦中動(dòng)脈分支所引起的腦出血、顱內(nèi)動(dòng)脈瘤和腦血管畸形是常見(jiàn)的出血原因。在病理變化上表現(xiàn)為一組以動(dòng)脈粥樣硬化為特征、血管壁功能紊亂引起的癥候群，包括血管出血，滲出，和組織水腫等。
出血性腦卒中發(fā)病機(jī)理未明。但目前研究發(fā)現(xiàn)，與下列危險(xiǎn)因素存在密切關(guān)系1)高血壓[60]是腦卒中最重要的危險(xiǎn)因素，也是其病理性變化—?jiǎng)用}粥樣硬化的基礎(chǔ)，高血壓可導(dǎo)致腦血管發(fā)生脂質(zhì)透明變性而引起腦卒中，高鹽飲食亦是通過(guò)高血壓促發(fā)腦卒中的；2)吸煙是腦卒中發(fā)病的第二大危險(xiǎn)因素。吸煙能提高血漿纖維蛋白原含量，能增加動(dòng)脈瘤破裂所致的蛛網(wǎng)膜下腔出血的發(fā)生率[60]。作為獨(dú)立危險(xiǎn)因素，及早戒煙可以預(yù)防腦卒中，特別是60歲以下合并高血壓、心肌病、糖尿病等患者；3)心血管疾病心臟病(如風(fēng)濕性心臟病、冠心病、心力衰竭、心房纖顫等)，特別是伴有心律失?；蛐募」Ｈ撸瑸槌鲅阅X卒中的危險(xiǎn)因素。4)糖尿病[61]糖尿病患者腦卒中發(fā)病率為1,549.05/10萬(wàn)，非糖尿病患者為333.00/10萬(wàn)，兩者具有顯著性差異(P＜0.01，RR＝4.64)，說(shuō)明糖尿病是腦卒中的危險(xiǎn)因素[61]。胰島素降低血糖水平，可以明顯降低腦卒中病變范圍；5)血脂異常高脂蛋白a(Lp(a))是出血性腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[62]，目前已廣泛應(yīng)用作為測(cè)定動(dòng)脈粥樣硬化性疾病、出血性腦卒中的危險(xiǎn)因素的指標(biāo)；6)其他包括飲酒，感染，藥物等。
中國(guó)人群中，出血性腦卒中占總類(lèi)的21％～48％，是高加索人2～3倍。這種種族發(fā)病的差異，提示存在不同的發(fā)病機(jī)理。盡管可以尋找到各種腦卒中共同的易感位點(diǎn)[63]，但此位點(diǎn)跟出血性腦卒中的關(guān)系尚未證明。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，上述各種危險(xiǎn)因素中，只有Lp(a)水平能合理解釋出血性腦卒中的在不同種族間的發(fā)病差異。危險(xiǎn)因素的作用，最終將對(duì)疾病發(fā)生的中心環(huán)節(jié)—血管壁病變，起到誘發(fā)和促進(jìn)作用。因此，研究血管的發(fā)育發(fā)生機(jī)制，以及在出血性腦卒中的變化，將有助于最終闡明本病的發(fā)生機(jī)理。
出血性腦卒中的特征性病理變化包括出血、滲出和組織水腫等，這是血管動(dòng)脈粥樣硬化、血管壁功能紊亂引起的癥候群。已知促血管生成素-2是生后血管重塑所必須的，能引發(fā)新生血管形成，同時(shí)也與Ang1及VEGF協(xié)調(diào)作用整合新生血管，最終形成功能性血管。當(dāng)Ang2基因敲除時(shí)，胚胎時(shí)期血管發(fā)生不受影響，但進(jìn)入成熟期后，由于失去Ang2的整合穩(wěn)定作用，血管壁完整性遭到破壞，通透性增加，表現(xiàn)為水腫，出血而死亡[1]。因此，Ang2功能不全造成的血管整合不全，可能是動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制之一。
自發(fā)性高血壓腦卒中易患型大鼠(stroke-prone spontaneouslyhypertensive rat，SHRSP)是研究遺傳因素對(duì)腦卒中作用的良好模型。SHRSP在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可以自發(fā)形成腦卒中，損傷不斷加劇。這種損傷部分是由于腦部血管發(fā)育異常造成的。研究發(fā)現(xiàn)，在各種類(lèi)型的腦卒中動(dòng)物模型中，Ang2表達(dá)均升高，而在SHRSP大鼠增高最為明顯[65]。與此相比，Ang1和Tie2表達(dá)下降，但在SHR和WKY大鼠之間沒(méi)有明顯差異。在大腦中動(dòng)脈梗塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型中，Ang2的在發(fā)病后6小時(shí)明顯升高，主要分布于梗塞及周?chē)鷧^(qū)的內(nèi)皮細(xì)胞索端部，而Ang1主要在膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞區(qū)域表達(dá)，且沒(méi)有明顯變化。Ang2的表達(dá)同VEGF同步進(jìn)行，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和新生血管的發(fā)生[66]。宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growthrestricted fetuses，IUGR)可以導(dǎo)致包括冠心病，II型糖尿病，高血壓，腦卒中等在內(nèi)的成年綜合癥，這種綜合癥的出現(xiàn)，跟IUGR時(shí)期血管發(fā)生異常密切相關(guān)。Ang2在IUGR中的獨(dú)特表達(dá)及對(duì)此病發(fā)生的影響，可能是IUGR綜合癥的重要原因[67]。
綜上所述，Ang2功能不全，造成血管壁整合不全，表現(xiàn)為滲出，出血，周?chē)M織水腫，可能是以血管壁功能不全為特征的出血性腦卒中的重要發(fā)病原因。探討Ang2在出血性腦卒中功能紊亂血管中的地位和作用，將有助于早日闡明這種復(fù)雜性疾病的發(fā)病機(jī)理，為其預(yù)防，診斷和治療提供有益指導(dǎo)。
近年來(lái)，在基因組水平上探討遺傳因素同人類(lèi)復(fù)雜性疾病的關(guān)聯(lián)已成為研究熱點(diǎn)之一。病例對(duì)照研究是最常用的關(guān)聯(lián)研究[68]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是最常見(jiàn)的遺傳變異，由于含量豐富、穩(wěn)定性高、可以高通量分析等特點(diǎn)，廣泛用做人類(lèi)群體遺傳研究的篩選標(biāo)記物[68]和疾病連鎖分析[69]。單倍型是指同一染色體上某一特定基因內(nèi)，多個(gè)變異位點(diǎn)共存的模式。同SNP比較起來(lái)，單倍型具有高度的雜合性，多種等位基因共存，相對(duì)更高的穩(wěn)定性，因此在復(fù)雜性疾病的連鎖分析中能提供更多有價(jià)值的信息[70]。一個(gè)突出的例證來(lái)自哮喘病人對(duì)β受體激動(dòng)劑的個(gè)體反應(yīng)差異性的研究[71]。結(jié)果表明，β2-腎上腺素能受體基因單倍型跟這種反應(yīng)性密切相關(guān)，即使在一個(gè)小規(guī)模人群中也可得到驗(yàn)證，而獨(dú)立SNP分析卻不適合小人群研究。此外，單倍型由于是基因組變異結(jié)構(gòu)的直接描述，因此可以反映某一特定人群基因遺傳進(jìn)化結(jié)構(gòu)的情況。這種進(jìn)化信息對(duì)研究遺傳因素同復(fù)雜疾病之間的關(guān)系是極其敏感的[72-74]。
單核苷酸多態(tài)性人類(lèi)基因組中的序列變異主要由單核苷酸多態(tài)性(″SNP″)組成，其余序列變異是短串聯(lián)重復(fù)(包括微衛(wèi)星)、長(zhǎng)串聯(lián)重復(fù)(小衛(wèi)星)和其它插入和缺失。SNP是群體中以可測(cè)頻率(即＞1％)出現(xiàn)兩個(gè)可替換堿基的位置。SNP被稱為是″等位的″，因?yàn)橛捎诖硕鄳B(tài)性的存在，一個(gè)物種的一些成員可能具有未突變序列(即，原始“等位基因”)，而其它成員可能具有突變序列(即變體或突變等位基因)。在最簡(jiǎn)單的情況下，可能僅存在一個(gè)突變序列，該多態(tài)性被稱為二對(duì)等位基因多態(tài)性。可替換突變的發(fā)生可產(chǎn)生三對(duì)等位基因多態(tài)性等。SNP廣泛存在于基因組中，改變基因功能的SNP可能直接有助于表型變異。由于它們的流行和普遍本質(zhì)，SNP有潛力成為定位參與人類(lèi)疾病情況的基因的重要工具，見(jiàn)如Wang等，Science 2801077-1082(1998)，它公開(kāi)了一個(gè)探索性研究，其中2,227個(gè)SNP被作圖定位于一個(gè)2.3兆堿基的DNA區(qū)域內(nèi)。
單核苷酸多態(tài)性和特定表型之間的關(guān)系不表示或需要SNP是該表型的原因。相反，這種關(guān)系可能僅表示SNP位于表型決定因子在基因組上的存在位置的附近，由此更可能被發(fā)現(xiàn)與這些決定因子關(guān)聯(lián)和由此與感興趣的表型關(guān)聯(lián)。因此，SNP可能與“真正”的功能變異存在連鎖不平衡(LD)。當(dāng)基因組兩個(gè)不同位置上的等位基因的相關(guān)性比期望的相關(guān)性更高時(shí)存在LD，又稱作等位基因相關(guān)(allelicassociation)。因此，SNP可以用作標(biāo)記，由于其接近引起特定表型的突變而具有價(jià)值。
本發(fā)明在以促血管生成素-2作為出血性腦卒中(特別是包括腦出血或蛛網(wǎng)膜下腔出血)易感候選基因的病例-對(duì)照研究中，通過(guò)對(duì)該基因SNP1084多態(tài)性位點(diǎn)與出血性腦卒中的關(guān)系進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究，研究該位點(diǎn)與出血性腦卒中的相關(guān)性，從而確定中國(guó)人出血性腦卒中病的易感基因。同時(shí)，根據(jù)本發(fā)明所鑒別的出血性腦卒中相關(guān)SNP確定藥物的靶位點(diǎn)，可以為后續(xù)的藥物篩選提供指導(dǎo)性方針。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及用于檢測(cè)促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的工具。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中中，所述工具可以是促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A多態(tài)性分型寡核苷酸，優(yōu)選地，所述多態(tài)性分型寡核苷酸是(1)等位基因特異性核酸引物，它能夠檢測(cè)促血管生成素-2的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的多態(tài)性，或者(2)用于檢測(cè)促血管生成素-2中多態(tài)性的寡核苷酸探針，其能特異地與具有促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的核酸雜交，優(yōu)選地，寡核苷酸探針的長(zhǎng)度為17-50個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述工具是限制性內(nèi)切酶。
本發(fā)明的另一方面，涉及用于上述檢測(cè)的試劑盒，其中至少一種上述的工具，以及，任選的，用于檢測(cè)反應(yīng)的合適的緩沖體系和顯色體系。
本發(fā)明的又一方面，涉及一種診斷患者出血性腦卒中(包括腦出血或蛛網(wǎng)膜下腔出血)的方法，所述方法包括檢測(cè)來(lái)自所述患者的樣品中促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的存在。
本發(fā)明的又一方面，涉及一種確定患者出血性腦卒中(特別是包括腦出血或蛛網(wǎng)膜下腔出血)的易感性的方法，所述方法包括檢測(cè)來(lái)自所述患者的樣品中促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的存在。
本發(fā)明的再一方面，還涉及一種分析從患者分離的離體生物樣品的方法，包括確定所述樣品中促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的核苷酸。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用包括，但不限于，選自以下的差異核酸分析技術(shù)的試驗(yàn)用質(zhì)譜對(duì)PCR產(chǎn)物直接質(zhì)量分析、對(duì)侵入性切割產(chǎn)物直接分析、直接序列分析、等位基因特異性擴(kuò)增、等位基因特異性雜交、寡核苷酸連接試驗(yàn)、侵入者試驗(yàn)、DNA芯片分析和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，檢測(cè)所述樣品中促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的核苷酸的存在。
本發(fā)明的再一方面，還涉及一種微陣列，其中包含上述定義的促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的分型寡核苷酸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述微陣列是DNA芯片的形式。
本發(fā)明的再一方面，還涉及檢測(cè)生物學(xué)樣品中促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的存在的物質(zhì)在制備診斷試劑的用途，所述診斷試劑用于診斷患者出血性腦卒中(特別是包括腦出血或蛛網(wǎng)膜下腔出血)的遺傳易感性。在本發(fā)明中，所述物質(zhì)選自用于檢測(cè)促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的工具，例如，促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A多態(tài)性分型寡核苷酸，優(yōu)選地，所述多態(tài)性分型寡核苷酸是(1)等位基因特異性核酸引物，它能夠檢測(cè)促血管生成素-2的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的多態(tài)性，或者(2)用于檢測(cè)促血管生成素-2中多態(tài)性的寡核苷酸探針，其能特異地與具有促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的核酸雜交，優(yōu)選地，寡核苷酸探針的長(zhǎng)度為17-50個(gè)核苷酸；能夠特異識(shí)別促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的突變的抗體；和能夠特異識(shí)別促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的引物或者探針或者限制性內(nèi)切酶。
發(fā)明詳述關(guān)于Ang2的SNP的研究已有報(bào)告[75]。此項(xiàng)研究是建立在隨機(jī)挑選的10個(gè)正常人基因測(cè)序基礎(chǔ)上。雖然獲得了在外顯子2，4，5上的三個(gè)SNP，但由于樣本量太小，不足以全面反映Ang2基因組變異的詳盡信息，無(wú)法進(jìn)行單倍型分析，更無(wú)法建立在疾病中的分布模型。
為闡明Ang2單倍型在中國(guó)出血性腦卒中人群中的分布規(guī)律，借以研究Ang2是否在基因組水平上跟出血性腦卒中相關(guān)，我們選用了西安地區(qū)的腦卒中人群進(jìn)行病例-對(duì)照分析研究。我們的初步結(jié)果顯示，SNP1084位點(diǎn)的其他基因型向A/A的轉(zhuǎn)換，是出血性腦卒中不同年齡發(fā)病的一個(gè)易感因子。SNP1084位點(diǎn)A/A基因型可以看作是不同年齡發(fā)病的一個(gè)危險(xiǎn)因子。Ang2可能是出血性腦卒中的一個(gè)易感標(biāo)記。
促血管生成素-2基因序列對(duì)應(yīng)于NCBI Acc No004327。
在本文中，促血管生成素-2基因序列和編碼的蛋白質(zhì)序列按照常規(guī)方法進(jìn)行編號(hào)。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的堿基編號(hào)為2。
本發(fā)明所提及的核酸序列和氨基酸序列中核苷酸和氨基酸殘基的編號(hào)是指與Ang2 cDNA序列(NCBI Acc No004327的序列或其編碼的氨基酸序列相同位置(或編號(hào))對(duì)應(yīng)的核苷酸和氨基酸殘基。
“對(duì)應(yīng)”是指本發(fā)明核酸分子或者蛋白質(zhì)的序列在與參考序列的cDNA序列所示序列最佳比對(duì)(alignment)后與該參考序列某位置相對(duì)的位置。因此，本發(fā)明核酸分子或者蛋白質(zhì)“對(duì)應(yīng)位置”或者“對(duì)應(yīng)核苷酸”或者“對(duì)應(yīng)氨基酸”不一定是與參考序列編號(hào)相同的位置、或者核苷酸或者氨基酸。
促血管生成素-2基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)“1084A/A”是指該基因第2914位多態(tài)性A和A。
單核苷酸多態(tài)性及其檢測(cè)術(shù)語(yǔ)“患者”是指動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，最優(yōu)選人類(lèi)。
術(shù)語(yǔ)“多態(tài)性”廣義上限定為包括已知發(fā)生在核苷酸序列中的所有變異，包括插入，缺失，置換和重復(fù)序列(包括二重重復(fù))。
根據(jù)本發(fā)明的上述方法可通過(guò)使用用于檢測(cè)單核苷酸變異的任何合適方法而得以施用，比如用質(zhì)譜對(duì)PCR產(chǎn)物的直接質(zhì)量分析，對(duì)侵入性切割產(chǎn)物(invasive cleavage product)的直接分析，直接的序列分析，等位基因特異性擴(kuò)增(即，ARMSTM-等位基因特異性擴(kuò)增，ARMS指擴(kuò)增受阻突變體系(amplification refractory mutationsystem))，ALEX(擴(kuò)增受阻突變系統(tǒng)線性延伸(amplificationrefractory mutation system linear extension)和COPS(競(jìng)爭(zhēng)性寡核苷酸引發(fā)系統(tǒng))，等位基因特異性雜交(ASH)，寡核苷酸連接試驗(yàn)(OLA)，侵入者試驗(yàn)，DNA芯片分析和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)(綜述參見(jiàn)基因組研究(Genome Research)，1998年，8卷，769-776頁(yè)；Pharmacogenomics，2000年，1卷，95-100頁(yè)；人類(lèi)突變(HumanMutation)，2001年，17卷，475-492頁(yè))。
攜有所述多態(tài)性核酸的獲自患者的樣品可以方便地是從個(gè)體中獲得的，包括但不限于血清、尿樣、唾液、體液、(活檢)組織樣本等。這些樣品可以預(yù)先進(jìn)行純化，例如分離總DNA?？梢悦髁?，樣品同樣可以是對(duì)應(yīng)于試樣中序列的核酸序列，也就是說(shuō)，在等位基因變異分析前，核酸樣品中的全部或一部分區(qū)域可先用任何一種方便的技術(shù)如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或連接酶鏈反應(yīng)(LCR)擴(kuò)增。
顯然，對(duì)于對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)有大量的分析方法可被用于檢測(cè)在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)多態(tài)位置處變異核苷酸存在與否。一般來(lái)說(shuō)，等位基因變異的檢測(cè)需要突變辨別技術(shù)，任選地?cái)U(kuò)增反應(yīng)和任選地信號(hào)生成系統(tǒng)。國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO00/06768列出了許多擴(kuò)增技術(shù)和突變檢測(cè)技術(shù)，其中一些是基于PCR技術(shù)的。這些技術(shù)可和許多信號(hào)生成系統(tǒng)聯(lián)合使用，可選的信號(hào)生成系統(tǒng)也被列于WO00/06768。
用于檢測(cè)等位基因變異的許多現(xiàn)行方法綜述于Nollau等，臨床化學(xué)(Clin.Chem.)，1997年，43期，1114-1120頁(yè)；在標(biāo)準(zhǔn)教科書(shū)例如“突變檢測(cè)實(shí)驗(yàn)指南”(Laboratory Protocols for MutationDetection)U.Landegren編輯，牛津大學(xué)出版社，1996年和“PCR”第二版Newton &Graham編輯，BIOS Scientific Publishers Limited，1997年。
本發(fā)明涉及可被用做檢測(cè)促血管生成素-2基因中多態(tài)性的診斷引物的等位基因特異性核酸引物，該診斷引物能夠與在序列內(nèi)于促血管生成素-2基因位點(diǎn)1084處包含多態(tài)性(例如促血管生成素-2基因位點(diǎn)1084A/A或者其反向互補(bǔ)序列)的核酸雜交。
等位基因特異性引物通常與恒定引物一起用于諸如PCR反應(yīng)等擴(kuò)增反應(yīng)中，通過(guò)對(duì)位于一個(gè)特定序列位置處的一個(gè)等位基因的選擇性擴(kuò)增而使等位基因之間得以區(qū)分開(kāi)來(lái)，例如用在ARMS試驗(yàn)中的引物。等位基因特異性引物的長(zhǎng)度優(yōu)選17-50個(gè)核苷酸，更優(yōu)選大約17-35個(gè)核苷酸，最優(yōu)選大約17-30個(gè)核苷酸。
優(yōu)選地，等位基因特異性引物與待檢測(cè)的等位基因完全地相對(duì)應(yīng)，但是也可以考慮其衍生物，其中3’端大約有6到8個(gè)核苷酸與待檢測(cè)的等位基因?qū)?yīng)而不超過(guò)10個(gè)，比如不超過(guò)8，6，4，2或者1個(gè)剩余核苷酸在不顯著影響引物特性的情況下可以發(fā)生變化。常常在第2和/或第3位(相對(duì)于3’端)的核苷酸被錯(cuò)配以優(yōu)化差異引物結(jié)合和優(yōu)先僅從正確的等位基因辨別引物延伸。
本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)促血管生成素-2基因中的多態(tài)性的寡核苷酸探針，該探針能特異地與在序列內(nèi)包含位于促血管生成素-2基因位點(diǎn)1084位的多態(tài)性(例如促血管生成素-2基因位點(diǎn)1084A/A或者其反向互補(bǔ)序列)的核酸雜交。
術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸探針”指長(zhǎng)度至少有17個(gè)核苷酸的一種核苷酸序列，此序列與部分或全部的人類(lèi)促血管生成素-2基因，特別是表達(dá)多態(tài)性的人類(lèi)促血管生成素-2基因部分對(duì)應(yīng)。優(yōu)選長(zhǎng)度17到50個(gè)核苷酸。一般來(lái)說(shuō)這樣的探針包含與基因中相應(yīng)的野生型或變體座位完全互補(bǔ)的堿基序列。
然而，如果需要，可以引入一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配，前提是寡核苷酸探針的辨別能力不被過(guò)度影響。本發(fā)明的探針可以攜有一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記以便于檢測(cè)，比如在Moleaular Beacons中。
本發(fā)明還涉及一種用于檢測(cè)促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的試劑盒，其包含至少一種促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A多態(tài)性分型寡核苷酸，或是限制性內(nèi)切酶。本發(fā)明中所述多態(tài)性分型寡核苷酸是(1)等位基因特異性核酸引物，它能夠檢測(cè)促血管生成素-2的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的多態(tài)性，或者(2)用于檢測(cè)促血管生成素-2中多態(tài)性的寡核苷酸探針，其能特異地與具有促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的核酸雜交，優(yōu)選地，寡核苷酸探針的長(zhǎng)度為17-50個(gè)核苷酸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒中任選的含有適于所述檢測(cè)反應(yīng)的緩沖體系和顯色體系。
在一些實(shí)施方案中，一種組合物含有用于同時(shí)探測(cè)兩個(gè)或更多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的寡核苷酸身份的兩個(gè)或更多個(gè)不同標(biāo)記的基因分型寡核苷酸。也可考慮含有兩套或更多套等位基因特異性引物對(duì)以允許同時(shí)靶向和擴(kuò)增含多態(tài)性位點(diǎn)的兩個(gè)或更多個(gè)區(qū)域的引物組合物。
本發(fā)明的促血管生成素-2基因分型寡核苷酸也可以固定在固體表面或在固體表面合成，如芯片、珠或玻片(如見(jiàn)WO98/20020和WO98/20019)。這種固定的基因分型寡核苷酸可以用于各種多態(tài)性檢測(cè)試驗(yàn)，包括但不限于探針雜交和聚合酶延伸試驗(yàn)。本發(fā)明的固定的促血管生成素-2基因分型寡核苷酸可以包括為同時(shí)快速篩選DNA樣品在多個(gè)基因中的多態(tài)性而設(shè)計(jì)的有序寡核苷酸陣列。
本發(fā)明等位基因特異性寡核苷酸引物優(yōu)選具有與特定SNP的僅一種核苷酸互補(bǔ)的3’末端核苷酸，或優(yōu)選地3’倒數(shù)第二個(gè)核苷酸，由此只有存在含該核苷酸的等位基因時(shí)其才可以用作聚合酶介導(dǎo)的延伸反應(yīng)的引物。與編碼鏈或非編碼鏈雜交的等位基因特異性寡核苷酸引物包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明其它基因分型寡核苷酸與位于這里所述的多態(tài)性位點(diǎn)之一下游一個(gè)至幾個(gè)核苷酸處的靶區(qū)域雜交。這種寡核苷酸可用于聚合酶介導(dǎo)的引物延伸方法中以檢測(cè)這里所描述的多態(tài)性之一，因此這種基因分型寡核苷酸這里稱作“引物延伸寡核苷酸”。在優(yōu)選實(shí)施方案中，引物延伸寡核苷酸的3’末端是與多態(tài)性位點(diǎn)緊臨的核苷酸互補(bǔ)的脫氧核苷酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括包裝在分開(kāi)容器中的至少兩個(gè)基因分型寡核苷酸的試劑盒。該試劑盒也可以含有包裝在分開(kāi)容器中的其它成分如雜交緩沖液(此時(shí)寡核苷酸待用作探針)?？晒┻x擇地，當(dāng)寡核苷酸待用于擴(kuò)增靶區(qū)域時(shí)，該試劑盒可以含有包裝在分開(kāi)容器中的聚合酶和用于聚合酶介導(dǎo)的引物延伸如PCR的經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)緩沖液。
本發(fā)明還涉及一種診斷患者出血性腦卒中(包括腦出血或蛛網(wǎng)膜下腔出血)的體外方法，所述方法包括檢測(cè)來(lái)自所述患者的樣品中促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的存在。
本發(fā)明還涉及一種確定患者出血性腦卒中(包括腦出血或蛛網(wǎng)膜下腔出血)的易感性的體外方法，所述方法包括檢測(cè)來(lái)自所述患者的樣品中促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的存在。
本發(fā)明還涉及一種分析從患者分離的離體生物樣品的方法，包括確定所述樣品中促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的核苷酸。在本發(fā)明所述方法中，使用包括選自以下的差異核酸分析技術(shù)的試驗(yàn)用質(zhì)譜對(duì)PCR產(chǎn)物直接質(zhì)量分析、對(duì)侵入性切割產(chǎn)物直接分析、直接序列分析、等位基因特異性擴(kuò)增、等位基因特異性雜交、寡核苷酸連接試驗(yàn)、侵入者試驗(yàn)、DNA芯片分析和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。
在本發(fā)明所述方法中，其中所述來(lái)自患者的樣品選自血清、尿樣、唾液、體液和/或(活檢)組織樣本，任選的，所述樣品可以預(yù)先進(jìn)行純化，例如分離總DNA。
本發(fā)明還涉及一種用于檢測(cè)促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的微陣列，其中包含前述定義的促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的分型寡核苷酸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述微陣列是DNA芯片的形式。
本發(fā)明還涉及檢測(cè)生物學(xué)樣品中促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的存在的物質(zhì)在制備診斷試劑的用途，所述診斷試劑用于診斷患者出血性腦卒中(腦出血或蛛網(wǎng)膜下腔出血)的易感性。在本發(fā)明中，所述物質(zhì)選自用于檢測(cè)促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的工具，例如，促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A多態(tài)性分型寡核苷酸，優(yōu)選地，所述多態(tài)性分型寡核苷酸是(1)等位基因特異性核酸引物，它能夠檢測(cè)促血管生成素-2的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的多態(tài)性，或者(2)用于檢測(cè)促血管生成素-2中多態(tài)性的寡核苷酸探針，其能特異地與具有促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的核酸雜交，優(yōu)選地，寡核苷酸探針的長(zhǎng)度為17-50個(gè)核苷酸；能夠特異識(shí)別促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的突變的抗體；和能夠特異識(shí)別促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的引物或者探針或者限制性內(nèi)切酶。


圖1顯示Ang-2序列的單核苷酸多態(tài)性測(cè)定結(jié)果SNP1456176位，C/T。
圖2顯示Ang-2序列的單核苷酸多態(tài)性測(cè)定結(jié)果SNP757151位，T/T。
圖3顯示Ang-2序列的單核苷酸多態(tài)性測(cè)定結(jié)果SNP757152位，G/C。
圖4顯示Ang-2序列的單核苷酸多態(tài)性測(cè)定結(jié)果SNP757151位，C/C。
圖5顯示Ang-2序列的單核苷酸多態(tài)性測(cè)定結(jié)果SNP757153位，T/C。
圖6顯示Ang-2序列的單核苷酸多態(tài)性測(cè)定結(jié)果SNP757168位，T/G。
圖7顯示Ang-2序列的單核苷酸多態(tài)性測(cè)定結(jié)果SNP1063195位，G/G；SNP1084216位，A/A。
圖8顯示Ang-2序列的單核苷酸多態(tài)性測(cè)定結(jié)果SNP1063189位，G/T；SNP1084210位，A/G。
圖9顯示Ang-2序列的單核苷酸多態(tài)性測(cè)定結(jié)果SNP1063196位，G/G；SNP1084217位，A/G。
圖10顯示Ang-2序列的單核苷酸多態(tài)性測(cè)定結(jié)果SNP1063145位，G/T；SNP1084166位，G/G。
圖11顯示Ang-2序列的單核苷酸多態(tài)性測(cè)定結(jié)果SNP1063145位，G/G；SNP1084166位，G/G。
圖12顯示Ang-2序列的單核苷酸多態(tài)性測(cè)定結(jié)果SNP1231154位，G/G。
圖13顯示Ang-2序列的單核苷酸多態(tài)性測(cè)定結(jié)果SNP1231145位，A/G。
圖14顯示Ang-2序列的單核苷酸多態(tài)性測(cè)定結(jié)果SNP1456169位，T/T。
圖15顯示Ang2各單倍型進(jìn)化關(guān)系圖。
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步舉例說(shuō)明，而不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1入選病例和研究方法入選病例和對(duì)照本研究受中國(guó)國(guó)家973課題(中國(guó)腦卒中危險(xiǎn)因素的調(diào)查和預(yù)防，惠汝太教授)資助，由中德實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一協(xié)調(diào)，收集樣本。本研究選取西安地區(qū)的出血性腦卒中樣本77例，對(duì)照77例。所有參與者均簽署知情同意書(shū)。出血性腦卒中的診斷來(lái)自CT和磁共振，標(biāo)準(zhǔn)符合《國(guó)際疾病分類(lèi)(第九版)》，病人詳細(xì)資料略。
基因型測(cè)定1.樣品DNA的提取[76]按照常規(guī)分子生物學(xué)方法。
2.PCR擴(kuò)增9個(gè)外顯子引物設(shè)計(jì)見(jiàn)參考文獻(xiàn)[50]，但在exon1和exon3做出改進(jìn)。序列如下Exon1-1#5’-CGG GAC TCT GGA CGT GTG TTT-3’Exon1-2#5’-GCT CTA ATC CTC TTC ATC CTC CTT CT-3’Exon3-1#5’-GTT ATG TTT TCC TGT AGC TTG GGT A-3’Exon3-2#5’-CTC TCC CTT CTC CTC CCT CA-3’3.PCR擴(kuò)增
20μl體系10×buffer 2μl，5pmol/μl的上游引物1μl，5pmol/μl的下游引物1μl，10mM dNTP 0.3μl，基因組DNA 0.2μl，5U/μl Taq聚合酶0.3ul，補(bǔ)H2O至20μl。
95℃，5’；40cycle(95℃，30”；54℃，30”；72℃，1’)；72℃，10’(for exon2，4，5，6).
95℃，5’；40cycle(95℃，30”；58℃，30”；72℃，1’)；72℃，10’(for exon1，3，8，9).
95℃，5’；40cycle(95℃，30”；50℃，30”；72℃，2’)；72℃，10’(for exon7).
4.PCR產(chǎn)物純化1)PCR產(chǎn)物+5倍體積的NaAc/無(wú)水乙醇(5M NaAc∶無(wú)水乙醇＝1∶5)2)-80℃，2小時(shí)至過(guò)夜。
3)離心13,000g，4℃，20分鐘。
4)75％乙醇洗滌。
5)室溫晾干，加入雙蒸水，2％瓊脂糖電泳鑒定，確定濃度，送測(cè)序。測(cè)序采用ABI377測(cè)序儀(PE Applied Biosystems)。
SNP分析將測(cè)序結(jié)果與G.D.Yancopoulos報(bào)道的Ang2 cDNA序列(NCBI AccNo004327)進(jìn)行比較[8]，尋找變異位點(diǎn)。使用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
單倍型分析1.單倍型構(gòu)建[77]我們使用了根據(jù)改進(jìn)Bayesian算法開(kāi)發(fā)的Haplotyper軟件。在Unix運(yùn)行環(huán)境中，參數(shù)如下htyperv2 input output snp peopleround，其中htperv2是軟件名稱，input是輸入的原始資料文件名稱，output是輸出的結(jié)果名稱，snp是SNP的數(shù)目，people是人數(shù)，round是運(yùn)行圈數(shù)量，一般選20。舉例說(shuō)明，下列程序表示分析5個(gè)SNP，154個(gè)樣本的結(jié)果。input_all是輸入的原始數(shù)據(jù)文件名稱，output_all是輸出的結(jié)果名稱，共運(yùn)行20圈htyperv2 input_alloutput_all 5 154 20。
2.單倍型進(jìn)化分析[78]所采用的軟件PPH(perfect phylogeny haplotyper)，將原來(lái)的未分型的單倍型，理論上拆分為兩個(gè)單體單倍型(分型)，并給出其相互進(jìn)化關(guān)系。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果一.入選病人及對(duì)照的一般資料由表1顯示，出血性腦卒中和對(duì)照在年齡、性別、體重指數(shù)、葡萄糖、吸煙史等方面沒(méi)有顯著性差異。在收縮壓、舒張壓、總膽固醇上具有非常顯著性差異(P＜0.01)，在高密度脂蛋白上具有顯著性差異(P＜0.05)。總體看來(lái)，兩個(gè)組別是匹配的；存在的差異，本身就是腦卒中的危險(xiǎn)因素。
表1入選病例和對(duì)照的一般臨床資料

注SBP收縮壓；DBP舒張壓；HDL高密度脂蛋白；LDL低密度脂蛋白。*病例對(duì)照間具有非常顯著性差異(P＜0.01)；病例對(duì)照間具有顯著性差異(P＜0.05)。
二.SNP結(jié)果分析1.SNP等位位點(diǎn)頻率Ang2基因包括9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子[75]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)9對(duì)引物擴(kuò)增，將Ang2基因的全部編碼區(qū)擴(kuò)增出來(lái)。擴(kuò)增產(chǎn)物PCR經(jīng)過(guò)NaAc/乙醇純化后，ABI377測(cè)序鑒定。我們以首次報(bào)道的全長(zhǎng)Ang2 cDNA序列(NCBI No.AF004327)作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行BLAST比對(duì)，從中尋找SNP。在檢測(cè)到的5個(gè)SNP中，有三個(gè)已經(jīng)報(bào)道SNP757，SNP1084和SNP1231。兩個(gè)為最新報(bào)道SNP1063和SNP1456。所有SNP均為無(wú)義突變。各等位基因測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖1到圖14，其分布頻率見(jiàn)表2。
表2Ang2基因編碼區(qū)SNP的分布和各等位位點(diǎn)的相對(duì)含量

2.不同組別間SNP頻率比較以及是否有意義我們將研究人群分為病例/對(duì)照、年齡組(低于50歲發(fā)病和高于50歲發(fā)病組)，高血壓組(有或者無(wú)高血壓史)進(jìn)行比較。x2檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，病例對(duì)照組和高血壓組內(nèi)，各等位基因分布沒(méi)有差異。在年齡組別中，SNP1084的A/A等位基因低于50歲腦卒中病人和高于50歲中的分布頻率分別為16.1％和40.9％，分布具有顯著性差異(P＜0.05)。其他分布差異比較詳見(jiàn)表3。
表3各等位基因分布在不同組別間的比較

注釋SH腦卒中并發(fā)高血壓者(n＝53)；SNH腦卒中無(wú)高血壓者(n＝12)；NSNH無(wú)腦卒中無(wú)高血壓者(n＝48)。*P＜0.05。
3.單倍型分析單倍型構(gòu)建根據(jù)所測(cè)定的SNP基因型，本實(shí)驗(yàn)采用了改進(jìn)的Bayesian算法及相關(guān)的Haplotyper軟件進(jìn)行單倍型的推算。此方法采用Gibbssampler，將理論單倍型分割處理，最后再匯總起來(lái)。尤其適用于隨機(jī)挑選的小樣本資料，對(duì)未達(dá)到Hardy-Weinberg分布平衡的人群也適用。表4給出了不同組別中，各推斷基因型的分布比例。我們采用了5％作為取舍界限。低于5％的單倍型將被舍棄，因?yàn)檫@要求相關(guān)軟件具有很強(qiáng)的推算能力，是一般軟件達(dá)不到的。
表4Ang2基因單倍型結(jié)構(gòu)和分布頻率表

單倍型以常見(jiàn)的表示等位基因的數(shù)字表示0表示雜合型，1表示純合野生型。在SNP757、SNP1063、SNP1084、SNP1231和SNP1456中，0和1分別代表C/T和C/C、G/T和G/G、A/G和A/A、A/G和G/G、C/T和T/T。表中，N表示分布頻率低于5％或者無(wú)分布。SH腦卒中并發(fā)高血壓(n＝53)；SNH腦卒中無(wú)高血壓(n＝12)；NSH無(wú)腦卒中有高血壓(n＝30)；NSNH無(wú)腦卒中無(wú)高血壓(n＝48)。
單倍型的分布比較不同組別間單倍型的比較，更容易反映基因同疾病的關(guān)系。x2檢驗(yàn)表明，在年齡組別中，單倍型00100(Hap1)在低于50歲和高于50歲出血性腦卒中的病人中的分布比例為46.77％和15.91％，00000(Hap2)在上述兩組中的分布頻率分別為9.68％和31.82％，二者分布均具有顯著性差異(P值分別為0.023和0.042)。其他組別間的單倍型分布無(wú)差異(表5)。
4、單倍型進(jìn)化分析單倍型的進(jìn)化分析可以提示在一個(gè)特定人群中，基因型的變異方向。在病例-對(duì)照研究中，根據(jù)相關(guān)性結(jié)果的分析，可以提示疾病相關(guān)基因的變異方向，從而為疾病發(fā)生機(jī)理提供一種新的研究途徑。本文采用PPH方法對(duì)推斷出的8種單倍型進(jìn)行進(jìn)化分析，目的是為了找出單倍型進(jìn)化趨勢(shì)，從而比較潛在的疾病相關(guān)的進(jìn)化位點(diǎn)[53]。單倍型被拆分為兩條染色體上的詳細(xì)位點(diǎn)組合，分別定義為epna和epnb，其中n是單倍型的代碼，為1～8(圖15和表6)。
表5各單倍型在不同組別中分布差異比較

注釋病病例組；對(duì)對(duì)照組；余同表2-4。
通過(guò)PPH對(duì)8個(gè)＞5％的單倍型分析，發(fā)現(xiàn)共存在5種單倍亞型。結(jié)果如下表6Ang2中存在的5種常見(jiàn)單倍型序列

本發(fā)明對(duì)中國(guó)西安地區(qū)散發(fā)的出血性腦卒中人群的病例-對(duì)照資料進(jìn)行了Ang2編碼區(qū)單倍型的分析。通過(guò)154例樣本分析，除了已報(bào)道的3個(gè)SNP位點(diǎn)(SNP757，SNP1084和SNP1231)外，我們新發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)SNP位點(diǎn)(SNP1063和SNP1456)。各SNP的等位基因統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，SNP1084的A/A基因型，在低于50歲和高于50歲腦卒中患者中具有顯著差異(P＜0.05)。單倍型分析發(fā)現(xiàn)，在所有可能的25(＝32)單倍型中，只獲得8種單倍型。其中Hap1和Hap2在低于和高于50歲的兩組別中，分布具有顯著差異(P＜0.05)。
編碼區(qū)SNP的檢測(cè)，除了能掃描到潛在的致病突變位點(diǎn)外，還可以綜合無(wú)義突變作為遺傳標(biāo)記，為單倍型分析提供基礎(chǔ)。
本發(fā)明所檢測(cè)到的5個(gè)SNP位點(diǎn)，均無(wú)氨基酸變化。位于外顯子2上的SNP757屬于多位點(diǎn)SNP，存在T，C，G三者之間的變換，其余四者均是經(jīng)典的兩位點(diǎn)變換。群體遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人群中發(fā)生頻率最多的等位基因往往是先祖位點(diǎn)[79]。據(jù)此推測(cè)，SNP1063，SNP1231，SNP1456只含有野生純合型和雜合型兩種，SNP1084還含有突變純合型。說(shuō)明在進(jìn)化方面，這四者相對(duì)保守，尤其以前三者明顯。人群特異的稀有位點(diǎn)對(duì)闡明人群進(jìn)化和發(fā)生學(xué)，特別是對(duì)多先祖人群中疾病易感基因的定位具有重要作用[80]。
本發(fā)明人未發(fā)現(xiàn)上述類(lèi)型的SNP位點(diǎn)，而是如前所述，各位點(diǎn)除了SNP2呈現(xiàn)一種多位點(diǎn)變異的情況外，其他4個(gè)SNP位點(diǎn)，均為傳統(tǒng)的兩位點(diǎn)突變模型。這種保守進(jìn)化的結(jié)果是，一旦某些位點(diǎn)發(fā)生了突變，便提示，很可能有強(qiáng)烈的進(jìn)化動(dòng)力作用于這個(gè)固定的群落，或者這種穩(wěn)定性上的改變會(huì)帶來(lái)某種特異的表型，如疾病等。SNP1084可能屬于此類(lèi)。
Ang2編碼區(qū)檢測(cè)到了5個(gè)SNP位點(diǎn)，分布于4個(gè)外顯子上。為排除系統(tǒng)誤差和一般算法推算能力的限制，我們采用了5％作為推算單倍型的取舍界限[85]，由Gibbs sampler方法推算出的Ang2的單倍型數(shù)目是8，遠(yuǎn)低于理論最大值(25＝32)。這是因?yàn)椋谝?，在外顯子4上存在兩個(gè)SNP位點(diǎn)，呈現(xiàn)高度連鎖性，減弱了作為獨(dú)立因子參與單倍型分析的能力；第二，本發(fā)明只分析了編碼區(qū)上的SNP位點(diǎn)，從進(jìn)化角度來(lái)看，編碼區(qū)保持相對(duì)保守性，能有利于機(jī)體的穩(wěn)定性。因此本發(fā)明中除了SNP757在三個(gè)堿基之間變換外，其他都是經(jīng)典的野生/突變位點(diǎn)變換，顯示了其保守性。。
理論上，如果有一個(gè)基礎(chǔ)單倍型，而突變是產(chǎn)生新位點(diǎn)的唯一進(jìn)化動(dòng)力，那么n個(gè)SNP產(chǎn)生的單倍型的理論值是n+1。當(dāng)實(shí)際或者推算的數(shù)值超過(guò)n+1時(shí)，提示存在其他進(jìn)化動(dòng)力，如重組，多次突變等。本發(fā)明檢測(cè)到的SNP數(shù)目為5，推算的單倍型數(shù)為8，提示可能存在上述幾種進(jìn)化動(dòng)力的組合。本文所測(cè)得的8個(gè)單倍型中，Hap1～Hap4是各組人群所共有的，占所有總量的90％以上，屬于共有單倍型。Hap5～Hap8只在部分組別中出現(xiàn)，分布頻率在5％～10％之間，且每組基本上只具有1～2種，說(shuō)明此類(lèi)單倍型屬于組別特異的。x2檢驗(yàn)結(jié)果提示，Hap1和Hap2在低于50歲和高于50歲腦卒中人群中分布具有顯著性差異(P＜0.05)。
如前所示，共有單倍型在進(jìn)化上是相對(duì)保守的一類(lèi)，當(dāng)在疾病-常人之間出現(xiàn)差異時(shí)，相對(duì)稀有位點(diǎn)的變化，更具參考價(jià)值。因此，分析造成Hap1和Hap2在兩個(gè)組別之間分布差異的原因，將有助于闡明兩組在進(jìn)化上分離的趨勢(shì)，由此可以尋找潛在的危險(xiǎn)因素。進(jìn)化分析表明，跟ep2a同屬一個(gè)進(jìn)化來(lái)源的ep1b，在基因型上，只存在SNP1084的差異。這與SNP統(tǒng)計(jì)結(jié)果相符(SNP1084的A/A基因型在低于50歲和高于50歲腦卒中病人兩個(gè)組別中也具有顯著性差異)。這說(shuō)明，正是由于SNP1084位點(diǎn)的其他基因型向A/A的轉(zhuǎn)換，造成了出血性腦卒中不同年齡發(fā)病的一個(gè)易感因子。SNP1084位點(diǎn)A/A基因型可以看作是不同年齡發(fā)病的一個(gè)危險(xiǎn)因子。
綜上所述，在已檢測(cè)到的5個(gè)SNP中，SNP1084位點(diǎn)的A/A變異，可能是出血性腦卒中不同發(fā)病年齡的差異基礎(chǔ)，單倍型Hap1和Hap2分布差異為其提供了進(jìn)一步的佐證。
權(quán)利要求
1.用于鑒別促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的工具。
2.權(quán)利要求1的工具，它是促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A多態(tài)性分型寡核苷酸，優(yōu)選地，所述多態(tài)性分型寡核苷酸是(1)等位基因特異性核酸引物，它能夠檢測(cè)促血管生成素-2的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的多態(tài)性，或者(2)用于檢測(cè)促血管生成素-2中多態(tài)性的寡核苷酸探針，其能特異地與具有促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的核酸雜交，優(yōu)選地，寡核苷酸探針的長(zhǎng)度為17-50個(gè)核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的工具，其是限制性內(nèi)切酶。
4.一種試劑盒，其包含至少一種權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的工具，以及，任選的，用于檢測(cè)反應(yīng)的合適的緩沖體系和顯色體系。
5.診斷患者出血性腦卒中(包括腦出血或蛛網(wǎng)膜下腔出血)的方法，所述方法包括檢測(cè)來(lái)自所述患者的樣品中促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的存在。
6.確定患者出血性腦卒中(包括腦出血或蛛網(wǎng)膜下腔出血)的易感性的方法，所述方法包括檢測(cè)來(lái)自所述患者的樣品中促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的存在。
7.分析從患者分離的離體生物樣品的方法，包括確定所述樣品中促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的核苷酸。
8.權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的方法，其中使用包括選自以下的差異核酸分析技術(shù)的試驗(yàn)用質(zhì)譜對(duì)PCR產(chǎn)物直接質(zhì)量分析、對(duì)侵入性切割產(chǎn)物直接分析、直接序列分析、等位基因特異性擴(kuò)增、等位基因特異性雜交、寡核苷酸連接試驗(yàn)、侵入者試驗(yàn)、DNA芯片分析和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。
9.權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述來(lái)自患者的樣品選自外周血細(xì)胞、白細(xì)胞、血清、尿樣、唾液、體液和/或(活檢)組織樣本，任選的，所述樣品可以預(yù)先進(jìn)行純化，例如分離總DNA。
10.一種微陣列，其中包含權(quán)利要求2所定義的促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的分型寡核苷酸。
11.權(quán)利要求10的微陣列，它是DNA芯片的形式。
12.檢測(cè)生物學(xué)樣品中促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的存在的物質(zhì)在制備診斷試劑的用途，所述診斷試劑用于診斷患者出血性腦卒中(包括腦出血或蛛網(wǎng)膜下腔出血)的遺傳易感性。
13.權(quán)利要求12的用途，其中所述物質(zhì)選自權(quán)利要求1-3的工具；能夠特異識(shí)別促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的突變的抗體；和能夠特異識(shí)別促血管生成素-2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A的引物或者探針或者限制性內(nèi)切酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及確定患者出血性腦卒中(特別是包括腦出血或蛛網(wǎng)膜下腔出血)的易感性的方法。具體地，本發(fā)明方法包括確定促血管生成素－2上的多態(tài)性位點(diǎn)1084A/A。本發(fā)明還涉及用于該方法的物質(zhì)、組合物、試劑盒及其用途。
文檔編號(hào)C12Q1/25GK101041855SQ20061013586
公開(kāi)日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2006年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月17日
發(fā)明者惠汝太, 蔡明清, 王繼征, 于暉, 張偉麗, 孫凱 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院