專利名稱：應(yīng)用乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因基因芯片建立篩選抗乳腺癌轉(zhuǎn)移藥物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因基因芯片和其它實驗方法，用于篩選抗乳腺癌轉(zhuǎn)移藥物，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致病人死亡的主要原因。然而，目前尚缺少有效的技術(shù)手段用于篩選和鑒定已經(jīng)具有抗乳腺癌作用的藥物是否具有抑制轉(zhuǎn)移的作用。因此，建立新的快速、方便、準確、高通量和高效率的檢測方法具有重要的意義?；蛐酒夹g(shù)已用于生物醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域，并取得了飛速的發(fā)展，為實現(xiàn)上述研究提供了可能。大量研究表明，基因芯片技術(shù)可用于多種臨床藥物的篩選，具有高通量和高效率等特點，同時可闡明藥物作用的分子機制，能夠發(fā)現(xiàn)藥物作用的靶基因，從而為新藥開發(fā)提供線索。

發(fā)明內(nèi)容
應(yīng)用自行制備的“乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因基因芯片”結(jié)合其它實驗方法篩選抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的藥物。在篩選抗乳腺癌轉(zhuǎn)移藥物的同時，闡明藥物的作用分子機制，確定藥物作用的靶基因，為新藥的開發(fā)提供線索。并結(jié)合我們建立的具有高轉(zhuǎn)移傾向的人乳腺癌細胞系(LM-MCF-7細胞系，已獲得申請國家發(fā)明專利，ZL03130264.5)和嚴重免疫缺陷(Severecombined immunodeficiency，SCID)的小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移動物模型，進行細胞水平和動物水平的研究和驗證。從而建立一套在分子水平、細胞水平和動物水平上互相結(jié)合相互驗證的實驗技術(shù)平臺，用于快速高通量地篩選抗乳腺癌轉(zhuǎn)移藥物。
本發(fā)明的主要內(nèi)容是1.首先在細胞水平上通過流式細胞儀觀察候選抗癌藥物抑制LM-MCF-7細胞增殖的有效濃度；2.通過“傷口愈合”實驗觀察候選抗腫瘤藥物對LM-MCF-7細胞遷移能力的影響，初步篩選具有抑制乳腺癌細胞遷移作用的藥物；3.應(yīng)用乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因基因芯片檢測初步篩選的抗乳腺癌藥物作用LM-MCF-7細胞后相關(guān)基因表達譜的變化，反向推測藥物作用乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的靶基因。然后，應(yīng)用Real-time PCR方法對變化的基因進行驗證。如果LM-MCF-7細胞在藥物作用后出現(xiàn)與乳腺癌轉(zhuǎn)移正相關(guān)基因下調(diào)和/或與乳腺癌轉(zhuǎn)移負相關(guān)基因上調(diào)，則表明該藥物可能具有抑制乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移作用的分子基礎(chǔ)；4.在上述基礎(chǔ)上，將LM-MCF-7細胞接種SCID小鼠后，定時腹腔注射上述篩選的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物，一定時間后處死動物進行病理觀察。通過與對照組相比，在動物水平上進一步驗證藥物在動物水平對腫瘤轉(zhuǎn)移是否具有抑制作用。
綜合上述分子、細胞和動物水平觀察的實驗結(jié)果，篩選出具有抑制乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移作用的藥物。一方面，從基因表達譜水平觀察抗癌藥物對腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的影響；另一方面，從細胞水平和動物水平觀察抗癌藥物是否具有抑制腫瘤細胞遷移和轉(zhuǎn)移的作用。進而，在篩選出具有抗乳腺癌轉(zhuǎn)移作用藥物的同時，也闡明了藥物作用的基因靶點，有利于揭示其分子機制。
本發(fā)明的有益效果是1.應(yīng)用乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因基因芯片建立篩選抗乳腺癌轉(zhuǎn)移藥物的方法，可從分子水平上高通量地觀察乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達譜的變化，提供了大規(guī)模、高通量篩選腫瘤藥物的技術(shù)平臺；2.將建立的LM-MCF-7細胞系、基因芯片和相應(yīng)的乳腺癌高轉(zhuǎn)移動物模型相結(jié)合，應(yīng)用該研究手段可篩選出抗乳腺癌轉(zhuǎn)移藥物。從不同水平闡明藥物的抗乳腺癌轉(zhuǎn)移作用，可使篩選出藥物的作用更可靠。
附圖簡要說明

圖1觀察藥物對LM-MCF-7細胞遷移能力的影響通過“傷口愈合”，觀察阿霉素(ADM)、順鉑(DDP)、小檗胺(EBB)、足葉乙甙(VP-16)、鹽酸平陽霉素(PYM)和異環(huán)磷酰胺(Ifo)分別作用LM-MCF-7細胞遷移能力變化的實驗結(jié)果。
圖2應(yīng)用建立的乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因基因芯片進行藥物篩選實驗的基因芯片結(jié)果圖左側(cè)A、B、C、D、E和F分別為抗腫瘤藥物ADM，DDP，EBB，VP 16，PYM和Ifo，作用LM-MCF-7細胞后與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因基因芯片雜交的偽色圖，cy5用紅色表示，cy3用綠色表示。對于某一點的信號來講，如果cy3信號較強，該點多顯綠色；如果cy5信號較強，該點多顯紅色；如果強度相似，即顯黃色。
圖右側(cè)是抗腫瘤藥物ADM，DDP，EBB，VP 16，PYM和Ifo分別作用LM-MCF-7細胞后與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因基因芯片雜交的散點圖，可以比較直觀地看出在兩個樣品之間基因表達的差異情況。其中X軸和Y軸分別以兩個樣品的熒光信號強度值為坐標，圖中每一個數(shù)據(jù)點代表芯片上一個基因點的雜交信號，紅色標記和綠色標記的數(shù)據(jù)點分別表示Y/X的Ratio值≥2和≤0.5，確定為表達有差異的基因，黑色標記表示Y/X的Ratio值在0.5和2之間，確定為表達基本無差異。
根據(jù)Ratio值≥2和≤0.5，順鉑作用LM-MCF-7細胞后可上調(diào)ERCC1基因，并下調(diào)PIK3C2B、PGK1、RAF1、AA262211、W30988、nck、STK15和H58873等基因。圖3nck、PIK3C2B和PGK1三個基因的實時定量PCR擴增曲線和柱狀圖用Real-time PCR檢測3.3μg/ml順鉑作用LM-MCF-7細胞對nck、PIK3C2B和PGK1基因表達的影響。對照組為不加藥。每個樣品重復(fù)三次，計算反應(yīng)的Ct值，實驗結(jié)果顯示，順鉑可以顯著抑制nck、PIK3C2B和PGK1三個基因的表達。
圖3應(yīng)用Real-PCR對基因芯片的部分結(jié)果進行驗證nck、PIK3C2B和PGK1三個基因的實時定量PCR擴增曲線圖。
圖4動物實驗結(jié)果觀察抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物對乳腺癌LM-MCF-7細胞轉(zhuǎn)移能力的抑制作用。接種27天SCID小鼠腫瘤生長狀況A.接種腫瘤細胞注射藥物的實驗組小鼠；B.接種腫瘤細胞未注射藥物的對照組小鼠。
具體實施例方式
實施例1 抗癌藥物抑制腫瘤細胞增殖有效濃度的確定選用臨床上應(yīng)用的抗癌藥物，如阿霉素(ADM，浙江海正藥業(yè)股份有限公司)、順鉑(DDP，齊魯制藥有限公司)、小檗胺(EBB，北京東升制藥廠)、足葉乙甙(VP-16，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)、鹽酸平陽霉素(PYM，哈爾濱博萊制藥有限公司)和異環(huán)磷酰胺(Ifo，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)等，作用LM-MCF-7細胞。首先在細胞水平上通過流式細胞儀觀察所篩選的抗癌藥物抑制腫瘤細胞增殖的有效濃度，具體方法如下(1)待測樣本制成單細胞懸液，然后1000rpm離心5分鐘，棄上清。
(2)用4℃預(yù)冷的70％乙醇固定，4℃保存，至少固定18小時。
(3)調(diào)整細胞濃度為106個細胞/ml，取1ml細胞懸液，用PBS洗三次，細胞重懸于1毫升PBS溶液中PI(碘化丙啶，Solarbio產(chǎn)品)染液中，37℃孵育30分鐘即可進行流式分析。
(4)PI染液終濃度為50μg/ml，RNase A終濃度為20μg/ml。
(5)流式細胞儀檢測以流式細胞儀檢測的結(jié)果顯示細胞增殖受到抑制、出現(xiàn)細胞凋亡時的濃度作為判斷上述抗癌藥物抑制腫瘤細胞增殖的有效濃度。
實施例2 抗癌藥物抑制腫瘤細胞遷移作用的檢測在檢測出藥物有效濃度后，應(yīng)用“傷口愈合”實驗觀察藥物對高轉(zhuǎn)移傾向乳腺癌LM-MCF-7細胞遷移能力的影響，檢測該藥物是否具有抑制腫瘤細胞遷移的作用，具體方法如下a)將LM-MCF-7細胞接種在蓋玻片上，用RPMI 1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基含有10％胎牛血清，青霉素100U/ml和硫酸鏈霉素100μg/ml，于培養(yǎng)箱37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)過夜。換無血清培養(yǎng)12h，進行細胞同步化；b)用移液器槍頭的槍尖在蓋玻片上劃線，用PBS小心的清洗細胞；c)加入上述有效濃度抗腫瘤藥物作用，培養(yǎng)細胞12h；d)鏡檢照相，觀察在藥物作用下細胞遷移能力的變化。
應(yīng)用ADM，EBB，DDP，VP-16，Ifo和PYM作用LM-MCF-7細胞后進行細胞劃痕實驗的實驗結(jié)果見圖1。
實施例3 應(yīng)用建立的乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因基因芯片對上述初篩藥物進行篩選在上述研究獲得了藥物抑制LM-MCF-7細胞增殖的有效濃度和具有抑制細胞遷移的作用后，應(yīng)用乳腺癌轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移相關(guān)基因基因芯片對抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物做進一步的篩選，旨在檢測細胞經(jīng)過藥物作用后與乳腺癌轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的基因譜表達變化，以此揭示藥物在基因水平作用的靶點。具體方法如下提取經(jīng)過藥物作用12h細胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，對cDNA進行熒光標已，然后與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的基因芯片進行雜交(重復(fù)4次)，通過比較加藥前后的細胞基因表達譜的變化進行分析。如果該藥物具有上調(diào)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因和/或下調(diào)腫瘤轉(zhuǎn)移促進基因的作用，即表明該藥物具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的分子基礎(chǔ)。
基因芯片檢測結(jié)果分析步驟
1.數(shù)據(jù)篩選由于每個基因?qū)?yīng)多個ratio值，對于刪除弱信號點后的數(shù)據(jù)，很多基因的保留下來的ratio值彼此不同。選擇保留的ratio值個數(shù)在4個以上的基因進行差異分析，以確保結(jié)果的可靠性。
2.對數(shù)變換對所有的ratio取以2為底數(shù)的對數(shù)，以減少數(shù)據(jù)的變異及增加數(shù)據(jù)分布的對稱性。
3.t檢驗a)計算Log2(ratio)的均數(shù)(Lmean)、標準差(sd)。
b)根據(jù)公式t＝(Lmean)*(n^0.5)/sd計算t值，其中n為樣本量。取t值的絕對值，并按照t值的絕對值進行降序排列。
c)根據(jù)t絕對值，做出統(tǒng)計學(xué)結(jié)論對于4個重復(fù)點，在95％的水準，|t＞3.182對應(yīng)的基因為差異表達基因；在99％的水準，|t|＞5.841的基因為差異表達基因。
應(yīng)用ADM，EBB，DDP，VP-16，Ifo和PYM作用LM-MCF-7細胞后進行上述基因芯片檢測結(jié)果見圖2。
實施例4 應(yīng)用Real-time PCR對基因芯片的部分結(jié)果進行驗證為了檢測基因芯片結(jié)果的正確性，針對變化明顯有意義的基因設(shè)計PCR引物，以上述cDNA為模板，進行Real-time PCR。我們在順鉑篩選出來的基因中選取了nck、PIK3C2B和PGK1三個基因進行Real-time PCR的驗證。具體步驟如下1.總RNA的提取將LM-MCF-7細胞培養(yǎng)過夜，無血清培養(yǎng)12h，分成對照組和順鉑3.3μg/m組作用LM-MCF-7細胞12h，PBS洗細胞兩次，每瓶細胞加入1ml Trizol于冰上裂解細胞，抽提細胞總RNA。
2.cDNA模板的獲得用上述實驗獲得的兩種總RNA作為模板，采用上海生工MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒，并按試劑盒規(guī)定的流程操作。
3.Real-time PCR檢測分別取上述兩種總cDNA模板通過PCR手段檢測順鉑對乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因nck、PIK3C2B和PGK1的影響。用引物設(shè)計軟件primer 5.0設(shè)計PCR引物。PCR體系、PCR反應(yīng)條件和引物序列如表1，表2和表3所示。每個樣品重復(fù)三次，獲得nck、PIK3C2B和PGK1三個基因的實時定量PCR擴增曲線，計算反應(yīng)的Ct值，實驗結(jié)果顯示，順鉑可以顯著抑制nck、PIK3C2B和PGK1三個基因的表達。
表1.PCR反應(yīng)體系

表2.PCR反應(yīng)條件

表3.引物序列列表

Real-time PCR實驗結(jié)果nck、PIK3C2B和PGK1三個基因的實時定量PCR擴增曲線圖。見圖3。
實施例5通過以上細胞水平和分子水平的篩選，可初步篩選出抗腫瘤藥物是否具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。為了進一步驗證該藥物抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，進行動物水平的研究，觀察所篩選的藥物對高轉(zhuǎn)移傾向乳腺癌LM-MCF-7細胞的抑制效果。從而進行藥物療效的綜合評估。
具體方法如下將1×107個乳腺癌LM-MCF-7細胞接種SCID小鼠，以5只動物為1組，5天后動物成瘤。成瘤后將上述篩選的有效藥物按臨床用藥的計量(mg/Kg)，腹腔注射SCID小鼠。根據(jù)小鼠的反應(yīng)，每3-6天注射一次，達到小鼠可耐受藥物毒性而存活的目的。30天后將SCID小鼠處死，取各個臟器及骨髓在福爾馬林固定液中固定，做病理切片，觀察腫瘤細胞轉(zhuǎn)移情況。以未注射藥物的SCID小鼠作為對照實驗。
動物實驗結(jié)果見圖4。接種27天小鼠的腫瘤生長狀況A.接種腫瘤細胞注射順鉑(注射的劑量為6mg/kg)的實驗組小鼠；B.接種腫瘤細胞未注射藥物的對照組小鼠。
權(quán)利要求
建立一種應(yīng)用乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因基因芯片篩選抗乳腺癌轉(zhuǎn)移藥物的實驗方法，其特征在于它包括
1.建立一套研究方法用于篩選抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物，包括在細胞水平上應(yīng)用高轉(zhuǎn)移傾向乳腺癌LM-MCF-7細胞進行侯選藥物的初步篩選，獲得抑制細胞增殖的有效濃度并確定是否具有抑制細胞遷移的作用。然后，應(yīng)用該濃度藥物作用LM-MCF-7細胞12h后，提取細胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，對cDNA進行熒光標記，之后與我們建立的乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因基因芯片進行分子雜交，通過比較加藥前后的細胞基因表達譜的變化進行分析。如果獲得該藥物具有上調(diào)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因和/或下調(diào)腫瘤轉(zhuǎn)移促進基因的效果，即表明該藥物具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的分子基礎(chǔ)。通過Real-time PCR技術(shù)，對基因芯片檢測陽性結(jié)果進行驗證。最后，進行動物實驗，從動物整體水平觀察藥物抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的效果。
2.在篩選抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物抑制腫瘤轉(zhuǎn)移效果的同時，基因芯片的應(yīng)用提供了高通量快速有效的手段，揭示藥物作用的靶基因，有助于闡明藥物作用的分子機制，并可為新藥開發(fā)提供線索。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種應(yīng)用乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因基因芯片建立篩選抗乳腺癌轉(zhuǎn)移藥物的方法，與以往篩選抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的方法相比，該方法包括首先在抗乳腺癌轉(zhuǎn)移藥物作用下，通過流式細胞儀觀察候選抗癌藥物抑制高轉(zhuǎn)移傾向的乳腺癌LM－MCF－7細胞增殖的有效濃度；通過“傷口愈合”實驗初步篩選出該藥物是否具有抑制腫瘤細胞遷移的作用；然后，應(yīng)用建立的“乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因基因芯片”，在基因水平上觀察乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達譜的變化，反向推測抗乳腺癌轉(zhuǎn)移藥物的作用和作用的靶基因。最后，在動物水平上進一步驗證藥物對腫瘤轉(zhuǎn)移是否具有抑制作用。上述方法一方面從基因表達譜水平觀察抗癌藥物對乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的影響；另一方面從細胞水平和動物水平觀察抗癌藥物是否具有抑制乳腺癌細胞遷移和轉(zhuǎn)移的作用。進而，在篩選出具有抗乳腺癌轉(zhuǎn)移作用藥物的同時，也闡明了藥物作用的基因靶點，有利于揭示其分子機制。
文檔編號C12Q1/68GK1974789SQ200610130108
公開日2007年6月6日 申請日期2006年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月13日
發(fā)明者張曉東, 葉麗虹, 王長曄, 吳蓮英 申請人:南開大學(xué)