專利名稱：一種直接酶解植物秸稈發(fā)酵生產(chǎn)2.3-丁二醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，特別涉及利用一株具有分泌纖維素酶能力的芽 孢桿菌，在不外加纖維素酶條件下，直接利用秸稈發(fā)酵產(chǎn)2.3-丁二醇的方法。
背景技術(shù)：
2.3-丁二醇作為一種潛在的非常有價(jià)值的平臺(tái)化合物，在國(guó)際上引起了廣泛 的關(guān)注。它是一種無(wú)色無(wú)味的手性化合物，分子量90.12kDa，沸點(diǎn)較高 (180-184°C)，凝固點(diǎn)較低(-6(TC)，是優(yōu)良的抗凍劑。作為化工中間體，它可以經(jīng) 脫水轉(zhuǎn)化為具有高燃燒值在燃料添加劑方面廣泛應(yīng)用的丁二酮和在合成橡膠上 廣泛應(yīng)用的1.3-丁二烯；通過(guò)縮合、聚合等反應(yīng)可生成別的化合物，如苯乙烯， 辛烷和2.3-丁二醇二乙酸酯等等，作為添加劑可廣泛應(yīng)用于油墨、化妝品、洗液、 防凍劑、熏蒸劑、軟化劑、增塑劑、炸藥和藥物的手性載體等等。在材料和紡織 生產(chǎn)加工行業(yè)分別用來(lái)生產(chǎn)聚丁烯對(duì)苯二酸酯樹(shù)脂、Y-丁內(nèi)酯和斯潘德克斯彈 性纖維等等。由于它的如此廣泛的用途，國(guó)際市場(chǎng)上的需求在不斷高漲。特別是 環(huán)境上的考慮，作為液體燃料添加劑在當(dāng)今世界內(nèi)引起了更加重視。細(xì)菌類微生物發(fā)酵生產(chǎn)2.3-丁二醇的代謝途徑研究得已非常清楚(附圖1)， 主要涉及到乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸脫羧酶、3-羥基丁酮還原酶和3-羥基丁酮 氧化酶等關(guān)鍵酶，這為微生物發(fā)酵生產(chǎn)2.3-丁二醇提供了很好的理論依據(jù)。以葡 萄糖作為初始底物細(xì)菌微生物發(fā)酵生產(chǎn)2.3-丁二醇的終產(chǎn)品除2.3-丁二醇外，通 常還伴有3-羥基丁酮、乙酸、乙醇、乳酸和琥珀酸等。其中3-羥基丁酮經(jīng)3-羥 基丁酮還原酶還原可生成2.3-丁二醇，該反應(yīng)是可逆的。2.3-丁二醇有三種立體 異構(gòu)體右旋(dextro-)、左旋(levo-)和中間(meso-)異構(gòu)體形式。通常，不同微生 物能產(chǎn)生其中的兩種立體異構(gòu)體形式。目前廣泛報(bào)道產(chǎn)2.3-丁二醇的菌種有克雷伯氏菌(尺/^wW^)、枯草芽孢桿菌 (及& &//的、多粘類芽孢桿菌CB.尸ofy/^;c")、地衣芽孢桿菌(及//c/2ew/0/vw的、產(chǎn) 氣氣桿菌(Aerobacter aerogenes)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraeroyenes)、沙雷氏菌、 嗜7K氣單胞菌04erawowos /^ra/ Ma)、產(chǎn)氣氣桿菌(/iera6a"eA" aeragewe力、陰溝 腸桿菌(五"fe/^a"^ c/oacae)以及沙雷氏菌屬(& ra"a)和假單胞菌屬 (尸ww^wwo"必)的一些微生物。其中克雷伯氏桿菌(^/^^//" ; "ew ww^)和多粘類 芽孢桿菌(5^///^; 0/;^>0:")產(chǎn)2.3-丁二醇能力和潛力較大，因而研究得也較廣泛 (Yu&Saddler, appl. Environ. Microbiol., 1982,777-784.)。但這些研究大多是直接以 葡萄糖或者以纖維素的酸/堿/酶法水解糖液作為碳源，未見(jiàn)到有能直接利用纖維 素作碳源的研究報(bào)道。目前大多利用液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)2.3-丁二醇，由于發(fā)酵液含水量很大而2.3-丁二 醇沸點(diǎn)又很高，所以這給后續(xù)的提取工藝帝來(lái)了很大的困難。如全蒸發(fā)、膜蒸 餾、真空膜蒸餾以及有機(jī)溶劑萃取等等(M丄Syu. AppL Microbiol. Biotechnol.，2001，55: 10-18)。因而本發(fā)明在本課題有著多年來(lái)固態(tài)發(fā)酵相關(guān)研究 的深刻認(rèn)識(shí)和良好基礎(chǔ)上，采用固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)2.3-丁二醇。盡管以天然可再生資源的木質(zhì)纖維廢棄物作為碳源具有很強(qiáng)的經(jīng)濟(jì)可行性，但 由于纖維素酶的昂貴價(jià)格以及理化預(yù)處理導(dǎo)致水解物中的發(fā)酵抑制物等問(wèn)題，使纖 維質(zhì)類可再生資源通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)2.3-丁二醇難以工業(yè)化。鑒于此，本發(fā)明公 開(kāi)了一種直接以秸稈作為唯一碳源，在不外加纖維素酶的條件下通過(guò)微生物液體和 固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)2.3-丁二醇的方法，能夠解決生產(chǎn)2.3-丁二醇時(shí)，必須外加纖維素酶 或用理化預(yù)處理常常導(dǎo)致糖液中存在發(fā)酵抑制物的問(wèn)題；通過(guò)固態(tài)發(fā)酵還能夠解決 液態(tài)發(fā)酵時(shí)2.3-丁二醇濃度低，難以蒸餾提取和提取成本偏高的問(wèn)題。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述2.3-丁二醇研究開(kāi)發(fā)中的技術(shù)難點(diǎn)和存在的問(wèn) 題，提供一種利用一株具有分泌纖維素酶能力的芽孢桿菌，在不外加纖維素酶條 件下，直接利用秸稈發(fā)酵產(chǎn)2.3-丁二醇的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明提供的直接酶解植物秸稈發(fā)酵制備2.3-丁二醇的方法，該方法為提 供一具有分泌纖維素酶能力的芽孢桿菌；以秸稈類或木質(zhì)纖維素作唯一碳源，使 用該芽孢桿菌在培養(yǎng)基不外加纖維素酶的條件下，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)2.3-丁二醇；
其具體步驟如下1) 取山東榮城造紙廠漂白車間附近的污染土，分離得到具有高纖維素酶活并具產(chǎn)2. 3-丁二醇能力的芽孢桿菌，該芽孢桿菌在結(jié)晶纖維素平板上37'C培養(yǎng)40h，菌落特征為表面無(wú)光澤、橢圓型、黃白色黏液狀、有香味，易挑起，生 長(zhǎng)旺盛；2) 堿處理秸稈粉在植物秸稈粉料中加入質(zhì)量百分比濃度為2%的NaOH溶液得植物秸稈堿 液，并在85'C水浴中處理lh，水洗至中性，60'C烘干得堿處理后的秸稈粉料，備用；所述植物秸稈堿液中的固液質(zhì)量比l: 5;3) 將堿處理后的秸稈粉料進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)或者固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)制備2.3-丁二醇所述的將堿處理后的秸稈粉料進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)制備2.3-丁二醇步驟如下從步驟1)芽孢桿菌的保藏斜面上，挑取一環(huán)接種在種子培養(yǎng)基上，30-37 'C， 160-220rpm震蕩條件下培養(yǎng)12-24h后制得芽孢桿菌種子液；所得芽孢桿菌種子液按體積比7-12%的比例轉(zhuǎn)接于未經(jīng)優(yōu)化的液體發(fā)酵培 養(yǎng)基中，30-37°C , 160-220rpm震蕩發(fā)酵培養(yǎng)96-144h;之后，發(fā)酵液經(jīng)100-120 目過(guò)濾除去發(fā)酵液中殘?jiān)玫降倪^(guò)濾液在4000-8000轉(zhuǎn)/min，離心5-20min后 獲得上清液，上清液再在40-60'C進(jìn)行減壓蒸餾；蒸餾的冷凝回收液再通過(guò)精餾， 收取175-183'C餾分即為2.3-丁二醇；所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成及配比為NaC15g，蛋白胨5g，堿處理后的麥 草秸稈粉50g，自來(lái)水1000ml，攪拌混勻后調(diào)pH6.5-7.0， 12rC滅菌20min;所述將堿處理后的秸稈粉料進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)制備2.3-丁二醇的步驟如下 從步驟1)芽孢桿菌的保藏斜面上，挑取一環(huán)接種在種子培養(yǎng)基上，30-37 。C， 160-220rpm震蕩條件下培養(yǎng)12-24h后制得芽孢桿菌種子液；所得芽孢桿菌種子液按重量比的7-10%的比例轉(zhuǎn)接于未經(jīng)優(yōu)化的固態(tài)發(fā)酵 培養(yǎng)基中，30-37。C， 180-220rpm震蕩培養(yǎng)培養(yǎng)120-144h;固態(tài)發(fā)酵完畢后，再 在索氏抽提器中用正丁醇、醋酸正丁醇或醋酸乙酯有機(jī)溶劑，反復(fù)抽提6h,循 環(huán)回流4-6次/h，得到的粗提液再在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上經(jīng)40-6(TC下減壓濃縮至體積不變時(shí)即得2.3-丁二醇；所述的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成及配比為堿處理植物秸稈粉250g，無(wú)機(jī)鹽溶液1L，所述無(wú)機(jī)鹽溶液中含KH2P04 4g， (NH4)2S04 16g，和MgS04 lg，攪拌混勻后調(diào)pH6.5-7.0， 12rC滅菌20min。所述的植物秸稈為麥草、稻草或玉米秸稈。 本發(fā)明的具高纖維素酶活和2. 3-丁二醇產(chǎn)生能力菌株的選擇1) 取至山東榮城造紙廠漂白車間附近的污染土，經(jīng)平板涂布和反復(fù)劃線培 養(yǎng)，分離到具有纖維素酶活的芽孢桿菌。2) 兼具高纖維素酶活和2.3-丁二醇產(chǎn)生能力菌株的選擇。對(duì)步驟l)得到 的芽孢桿菌，通過(guò)乙酰甲基甲醇反應(yīng)試驗(yàn)來(lái)初步確定能產(chǎn)2.3-丁二醇的菌株，然 后對(duì)這些菌株進(jìn)行纖維素剛果紅培養(yǎng)基試驗(yàn)，通過(guò)透明圈大小進(jìn)一步選擇高產(chǎn)纖 維素酶獲的菌株，選取透明圈較大的菌株編號(hào)保藏。3) 步驟2)所獲得的編號(hào)菌株進(jìn)行液體發(fā)酵試驗(yàn)，通過(guò)定期間隔取樣來(lái)檢 測(cè)纖維素濾紙酶活和2.3-丁二醇含量，通過(guò)比較從而獲得了一株兼具高纖維素 酶活和2. 3-丁二醇產(chǎn)生能力的菌株。4) 步驟3)所獲得菌株進(jìn)行液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵2,3-丁二醇。在未經(jīng)優(yōu)化的情 況下，步驟3)獲得的芽孢桿菌株直接進(jìn)行液體或固態(tài)搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵條件 30-37°C， 160-220rpm搖瓶培養(yǎng)96-144h。檢測(cè)方法為纖維素酶活用纖維素酶 濾紙酶活力來(lái)表示，定義為每分鐘水解濾紙條(lx6cm)纖維素生成ljxmol葡萄糖 的lml發(fā)酵液中的酶量為一個(gè)酶活力單位(IU): 2. 3-丁二醇的測(cè)定方法為比色法 (Westerfeld, 1945. J. Biol. Chem， 161:495-502; Speckman & Collins, 1968. Anal. Biochem， 22:154-160)和氣相色譜法。本發(fā)明提供的直接酶解植物秸稈發(fā)酵生產(chǎn)2.3-丁二醇的方法，具有如下優(yōu)點(diǎn)以秸稈類可再生資源代替石油作原料，原料豐富，再生循環(huán)迅速，環(huán)境友好，原料成本大大降低；秸稈類生物質(zhì)作為發(fā)酵用碳源不需酶解或酸堿等預(yù)處 理，降低了預(yù)處理成本的同時(shí)縮短了生產(chǎn)周期；采用固態(tài)發(fā)酵體系，提高了單位 體積發(fā)酵液中目的產(chǎn)物含量，便于產(chǎn)品的提取分離；固態(tài)發(fā)酵體系在提取分離時(shí) 有利于節(jié)約能耗和化學(xué)試劑消耗。總之，本發(fā)明針對(duì)石油資源短缺和價(jià)格飛漲， 開(kāi)發(fā)石油替代，利用秸稈類可再生資源通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)關(guān)鍵性平臺(tái)化合物
-2.3-丁二醇，實(shí)現(xiàn)秸稈類生物質(zhì)的高值化利用；克服目前微生物發(fā)酵產(chǎn)2.3-丁二 醇方法中存在的不能直接利用纖維素作碳源和理化預(yù)處理易產(chǎn)生發(fā)酵抑制物的 問(wèn)題以及液態(tài)發(fā)酵導(dǎo)致提取難的問(wèn)題。


附圖1葡萄糖作碳源產(chǎn)2.3-丁二醇的代謝途徑及2.3-丁二醇循環(huán)；灰色部分 是常見(jiàn)的細(xì)菌產(chǎn)2.3-丁二醇的路線(參見(jiàn)Juni E, Heym GA (1956). J Bacteriol 71:425-432);附圖2培養(yǎng)40hCMC平板上一株具有多粘類芽孢桿菌菌落特征照片具體實(shí)施方式
篩選分離本發(fā)明的能分泌纖維素酶和產(chǎn)2.3-丁二醇能力的芽孢桿菌株，步驟 如下1) 菌株的分離從山東榮城造紙廠漂白車間附近采土樣10g，放入己滅菌的盛有90ml水和 玻璃珠的三角瓶中，搖瓶劇烈震蕩30min;沸水浴中保持10min后，以無(wú)菌水進(jìn) 行梯度稀釋(10義10—s)，分別取0.2ml加入分離平板中均勻涂布完畢后，于37。C 培養(yǎng)16-24h，挑取菌落形態(tài)差異明顯的單菌落再在平板上進(jìn)行反復(fù)劃線培養(yǎng)3-4 次，即獲得純株芽孢桿菌。該芽孢桿菌在結(jié)晶纖維素平板上30-37'C培養(yǎng)24-40h， 菌落特征為表面無(wú)光澤、橢圓型、黃白色黏液狀、有香味，易挑起，生長(zhǎng)旺盛。2) 從步驟1)獲得的芽孢桿菌中，選擇具備有氧發(fā)酵產(chǎn)2.3-丁二醇能力的菌 株并保存；通過(guò)乙酰甲基甲醇反應(yīng)(V.P.反應(yīng))對(duì)上述芽孢桿菌進(jìn)行初步定性鑒定(這 是由于乙酰甲基甲醇(3-羥基丁酮)為2.3-丁二醇的前體化合物一如附圖l所述 的代謝途徑，可經(jīng)在相關(guān)代謝途徑中廣泛存在的3-羥基丁酮還原酶還原為2.3-丁二醇，因此，此定性測(cè)定方法被廣泛采用)從步驟1)分離獲得的芽孢桿菌 斜面上，挑取一環(huán)接種在乙酰甲基甲醇反應(yīng)(V.R反應(yīng))培養(yǎng)基中37'C靜置培養(yǎng) 24-48h，鑒別出V.P.反應(yīng)陽(yáng)性的芽孢桿菌，其中一部分菌株在發(fā)酵液面上形成菌 膜；挑取在液面上形成漂浮菌膜的菌株再進(jìn)行搖瓶V. R反應(yīng)試驗(yàn)24-48h，進(jìn)一
步獲得了搖瓶V. R反應(yīng)陽(yáng)性的菌株。這樣就獲得了能有氧發(fā)酵產(chǎn)2.3-丁二醇的菌 株，編號(hào)保存。所述乙酰甲基甲醇反應(yīng)(V. P.反應(yīng))培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨5，葡萄糖5， NaC15，自來(lái)水1L， pH7.0-7.2， 121。C滅菌15min;所述菌種保藏培養(yǎng)基(g/L): KH2P04 1，蛋白胨5，酵母膏5，葡萄糖1， 瓊脂20，自來(lái)水1L, pH7.0-7.2， 121。C滅菌15min;3)兼具高纖維素酶活和2.3-丁二醇產(chǎn)生能力菌株的獲得以接種環(huán)在步驟2)所獲得的菌株斜面上輕輕粘一下，然后在結(jié)晶纖維素平 板上劃線培養(yǎng)12-40h，挑取生長(zhǎng)良好的單菌落就獲得了初步具有纖維素酶活的菌 株，把該菌株再點(diǎn)接在纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12-40h后，觀察菌落周圍 的透明圈情況，透明圈的大小可大致反映菌株產(chǎn)纖維素酶活的高低；選取透明圈 較大的菌株進(jìn)行液體和固態(tài)搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，通過(guò)定期間隔取樣以進(jìn)一步檢測(cè)纖維 素濾紙酶活和2. 3-丁二醇含量。通過(guò)比較，獲得了一株兼具高纖維素酶活和2. 3-丁二醇產(chǎn)生能力的菌株，編號(hào)保藏；步驟3)所述的檢測(cè)方法為纖維素酶活用纖維素酶濾紙酶活力來(lái)表示，定 義為每分鐘水解濾紙條(lx6cm)纖維素生成lpmol葡萄糖的lml發(fā)酵液中的酶量 為一個(gè)酶活力單位(IU); 2. 3-丁二醇的測(cè)定方法為比色法(Westerfeld, 1945. J. Biol. Chem， 161:495-502; Speckman & Collins, 1968. Anal. Biochem， 22:154-160) 和氣相色譜法。所述結(jié)晶纖維素平板培養(yǎng)基(g/L):結(jié)晶纖維素2，蛋白胨5， Na2HPO40.1， KH2PO40.5, MgS(V7H2O0,5， NaCLl，水洗3-4遍的瓊脂粉15，自來(lái)水1L。 pH 7.0-7.5， 115°C /20min滅菌;所述纖維素剛果紅培養(yǎng)基(g/L): KH2PO40.5， MgSO40.25，纖維素粉1.88， 剛果紅0.2，瓊脂20，明膠2.0' pH7.0;所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L): NaC15，蛋白胨5，堿處理后的麥草秸稈粉50， 自來(lái)水1L， pH6.5-7.0， 12rC滅菌20min;所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):堿處理麥草粉250,無(wú)機(jī)鹽溶液1L(其中含 KH2P04 4, (NH4)2S04 16， MgS041);堿處理秸稈粉粉碎并過(guò)60目篩分后的秸稈粉，以固液質(zhì)量比1: 5加入 2。/oNaOH溶液在85。C水浴中處理lh，水洗至中性，60'C烘干備用。 下面通過(guò)具體實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明 實(shí)施例1從篩選得到的能分泌纖維素酶和產(chǎn)2.3-丁二醇能力的芽孢桿菌株保藏斜面 上，挑取一環(huán)接種在25ml種子培養(yǎng)基上(三角瓶體積為100ml)， 30-37°C， 160-220rpm震蕩條件下培養(yǎng)12-24h后，按接種量7-12%轉(zhuǎn)接入堿處理后的秸稈 為唯一碳源的50ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基中(三角瓶體積為250ml)震蕩發(fā)酵培養(yǎng)， 培養(yǎng)條件為30-37°C， 160-220rpm培養(yǎng)96-144h;每隔24h取樣測(cè)纖維素酶濾 紙酶活和2J-丁二醇含量；其纖維素酶最大濾紙酶活可達(dá)0.18-0.26IU/ml; 2.3-丁二醇產(chǎn)量在0.14-0.24g/L;發(fā)酵培養(yǎng)完畢，首先進(jìn)行100-120目過(guò)濾以除去發(fā)酵液中殘?jiān)?，過(guò)濾液經(jīng)進(jìn) 一步離心(4000-8000轉(zhuǎn)/min， 5-20min)后，在40-60。C減壓蒸餾，得到的冷凝 回收液再進(jìn)行精餾，回流比控制在3-4:1，收取175-183X:餾分，即為2.3-丁二醇；所獲得2.3-丁二醇0.12-0.23g,純度大于卯％。所述種子培養(yǎng)基與乙酰甲基甲醇反應(yīng)(V.R反應(yīng))培養(yǎng)基相同實(shí)施例2從菌種試管斜面上挑取--環(huán)接種在25ml種子培養(yǎng)基上三角瓶(三角瓶體積 為lOOml)，震蕩(160-220rpm, 30-37。C)培養(yǎng)12-24h后，按接種量10-13%轉(zhuǎn)接入 堿處理秸稈為唯一碳源的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中三角瓶(三角瓶體積為250ml)震蕩 培養(yǎng)，在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上裝樣量10g堿處理麥草+40ml無(wú)機(jī)鹽溶液，培養(yǎng)條 件30-37°C， 180-220rpm搖瓶(體積為250ml)培養(yǎng)120-144h，每隔24h取樣 測(cè)纖維素酶濾紙酶活和2.3-丁二醇含量纖維素酶濾紙酶活可達(dá)2.1-4.7IU/g干 料，2. 3-丁二醇產(chǎn)量可在0.026-0.067g/g干料；固態(tài)發(fā)酵完畢后，再在索氏抽 提器中用正丁醇、醋酸正丁醇或醋酸乙酯等有機(jī)溶劑，反復(fù)抽提6h,循環(huán)回流 4-6次/h，得到的粗提液再在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上經(jīng)40-60。C下減壓濃縮至體積不變時(shí)即 得2.3-丁二醇0.27-0.8lg，純度為80-卯0/0。本發(fā)明所提供的利用微生物直接發(fā)酵秸稈類生物質(zhì)生產(chǎn)2.3-丁二醇的方法 具有原料價(jià)廉易得、發(fā)酵產(chǎn)2.3-丁二醇濃度高，產(chǎn)品便于提取等優(yōu)點(diǎn)。
權(quán)利要求
1、一種直接酶解植物秸稈發(fā)酵制備2.3-丁二醇的方法，該方法為提供一具有分泌纖維素酶能力的芽孢桿菌；以秸稈類或木質(zhì)纖維素作唯一碳源，使用該芽孢桿菌在培養(yǎng)基不外加纖維素酶的條件下，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)2.3-丁二醇；其具體步驟如下1)取山東榮城造紙廠漂白車間附近的污染土，分離得到具有高纖維素酶活并具產(chǎn)2.3-丁二醇能力的芽孢桿菌，該芽孢桿菌在結(jié)晶纖維素平板上37℃培養(yǎng)40h，菌落特征為表面無(wú)光澤、橢圓型、黃白色黏液狀、有香味，易挑起，生長(zhǎng)旺盛；2)堿處理秸稈粉在植物秸稈粉料中加入質(zhì)量百分比濃度為2％的NaOH溶液得植物秸稈堿液，并在85℃水浴中處理1h，水洗至中性，60℃烘干得堿處理后的秸稈粉料，備用；所述植物秸稈堿液中的固液質(zhì)量比1∶5；3)將堿處理后的秸稈粉料進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)或者固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)制備2.3-丁二醇所述的將堿處理后的秸稈粉料進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)制備2.3-丁二醇步驟如下從步驟1)芽孢桿菌的保藏斜面上，挑取一環(huán)接種在種子培養(yǎng)基上，30-37℃，160-220rpm震蕩條件下培養(yǎng)12-24h后制得芽孢桿菌種子液；所得芽孢桿菌種子液不經(jīng)優(yōu)化，按體積比7-12％的比例將該芽孢桿菌種子液轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30-37℃，160-220rpm震蕩發(fā)酵培養(yǎng)96-144h；之后，發(fā)酵液經(jīng)100-120目過(guò)濾除去發(fā)酵液中殘?jiān)玫降倪^(guò)濾液在4000-8000轉(zhuǎn)/min，離心5-20min后獲得上清液，上清液再在40-60℃進(jìn)行減壓蒸餾；蒸餾的冷凝回收液再通過(guò)精餾，收取175-183℃餾分即為2.3-丁二醇；所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成及配比為NaCl 5g，蛋白胨5g，堿處理后的麥草秸稈粉50g，自來(lái)水1000ml，攪拌混勻后調(diào)pH6.5-7.0，121℃滅菌20min；所述將堿處理后的秸稈粉料進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)制備2.3-丁二醇的步驟如下從步驟1)芽孢桿菌的保藏斜面上，挑取一環(huán)接種在種子培養(yǎng)基上，30-37℃，160-220rpm震蕩條件下培養(yǎng)12-24h后制得芽孢桿菌種子液；所得芽孢桿菌種子液不經(jīng)優(yōu)化，按重量比的7-10％的比例轉(zhuǎn)接于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，30-37℃，180-220rpm震蕩培養(yǎng)培養(yǎng)120-144h；固態(tài)發(fā)酵完畢后，再在索氏抽提器中用正丁醇、醋酸正丁醇或醋酸乙酯有機(jī)溶劑，反復(fù)抽提6h，循環(huán)回流4-6次/h，得到的粗提液再在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上經(jīng)40-60℃下減壓濃縮至體積不變時(shí)即得2.3-丁二醇；所述的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成及配比為堿處理植物秸稈粉250g，無(wú)機(jī)鹽溶液1L，所述無(wú)機(jī)鹽溶液中含KH2PO4 4g，(NH4)2SO4 16g，和MgSO4 1g，攪拌混勻后調(diào)pH6.5-7.0，121℃滅菌20min。
全文摘要
本發(fā)明涉及直接酶解植物秸稈發(fā)酵生產(chǎn)2.3-丁二醇的方法從山東榮城造紙廠漂白車間附近的污染土中，分離得到具有高纖維素酶活并具產(chǎn)2.3-丁二醇能力的芽孢桿菌，以秸稈類或木質(zhì)纖維素作唯一碳源，使用該芽孢桿菌在培養(yǎng)基不外加纖維素酶的條件下，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)2.3-丁二醇。本發(fā)明針對(duì)石油資源短缺和價(jià)格飛漲，開(kāi)發(fā)石油替代，利用秸稈類可再生資源通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)關(guān)鍵性平臺(tái)化合物-2.3-丁二醇，實(shí)現(xiàn)秸稈類生物質(zhì)的高值化利用；克服目前微生物發(fā)酵產(chǎn)2.3-丁二醇方法中存在的不能直接利用纖維素作碳源和理化預(yù)處理易產(chǎn)生發(fā)酵抑制物的問(wèn)題以及液態(tài)發(fā)酵導(dǎo)致提取難的問(wèn)題。
文檔編號(hào)C12P7/18GK101153291SQ200610113390
公開(kāi)日2008年4月2日 申請(qǐng)日期2006年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月26日
發(fā)明者孫付保, 陳洪章 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所