專利名稱：一種花生功能性混合短肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物活性肽及其制備方法，特別是涉及一種花生功能性混合短肽及其制備方法。
背景技術(shù)：
在我國(guó)花生的主要用途是油用，全國(guó)花生約有50％被用于榨油，隨著冷榨法、水劑法等先進(jìn)的榨油工藝的推廣，花生中的油和蛋白已經(jīng)可以被同時(shí)利用。我國(guó)花生蛋白的開發(fā)利用起步較晚，精深加工技術(shù)相對(duì)落后，產(chǎn)品品種結(jié)構(gòu)單一，檔次低，加工制品仍以初加工為主，缺乏科技含量高的深加工、高檔次產(chǎn)品。目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上的花生蛋白產(chǎn)品主要是粉狀花生蛋白，其主要用途是作為食品加工中的基礎(chǔ)原料。粉狀花生蛋白在加工中存在著功能性質(zhì)和生理活性較差、吸收較差等缺點(diǎn)，因此研發(fā)具有良好功能性質(zhì)和生理活性的花生蛋白深加工產(chǎn)品勢(shì)在必行。
生物活性肽(biologically active peptides或biopeptides)是指對(duì)生物機(jī)體的生命活動(dòng)有益或具有生理作用的肽類化合物。現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)研究表明蛋白質(zhì)在消化道中消化酶作用下，水解終產(chǎn)物為游離氨基酸和肽，而由數(shù)個(gè)氨基酸殘基組成的短肽能以完整的形式被吸收利用，而非以前人們所認(rèn)為的以游離氨基酸形式被吸收。小肽逆濃度梯度，依據(jù)H+濃度或Ca2+濃度的主動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)過程，具有pH依賴性的非耗能性Na+、H+交換系統(tǒng)，小肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)具有轉(zhuǎn)運(yùn)速度快、耗能低、不易飽和，各肽間吸收無競(jìng)爭(zhēng)性與抑制性的特點(diǎn)。
生物活性短肽的生產(chǎn)制備的途徑有三條一是從自然界的生物體中提取其本身固有的各種天然活性肽類物質(zhì)；二是通過蛋白質(zhì)降解的途徑獲得具有各種生理功能的生物活性肽；三是應(yīng)用合成方法來制備生物活性肽。天然生物體中存在著具有各種生理功能的生物活性肽，但是從天然生物體中提取生物活性肽生產(chǎn)成本較高，而且生物活性肽在生物體內(nèi)的含量普遍很低，很難實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)；合成法可按人們的意愿合成任意活性肽，但成本高、副反應(yīng)多及殘留有毒化合物等問題制約著該技術(shù)的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種花生功能性混合短肽及其制備方法。
本發(fā)明所提供的花生功能性混合短肽，肽的重量百分含量高于80％，灰分含量≤8％，糖含量≤5％，干燥失重≤7％，脂肪≤5％；分子量小于1000Da的短肽含量≥60％；三氯乙酸氮溶解指數(shù)≥99.5％。
該花生功能性混合短肽的制備方法，包括如下步驟1)原料預(yù)處理將花生蛋白粉以水溶解，以堿調(diào)節(jié)pH至堿性以增溶，離心取上清；以酸調(diào)節(jié)上清液pH至酸性，離心收集沉淀；2)酶處理將沉淀以水溶解，加入堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，溫度55-60℃，時(shí)間90-120min，pH7.0-9.0，堿性蛋白酶用量為2500-3500U/g蛋白；然后，加入復(fù)合蛋白酶繼續(xù)處理，溫度55-60℃，時(shí)間40-70min，pH6.0-7.0，復(fù)合蛋白酶用量為1500-2500U/g蛋白；3)酶滅活將酶處理的蛋白溶液升溫至90-95℃，保持10-20min使酶滅活，離心取上清液，即為花生功能性混合短肽原液4)超濾將所得花生功能性混合短肽原液通過截留分子量為5000-3000Da的超濾膜，去除大分子片斷，得到花生功能性混合短肽液；5)脫鹽、干燥將所得花生功能性混合短肽液連續(xù)通過H+型陽離子交換樹脂和OH-型陰離子交換樹脂，流出液經(jīng)濃縮、干燥，得到所述花生功能性混合短肽。
其中，步驟1)花生蛋白粉的粒徑為60-80目?；ㄉ鞍追叟c水的重量比為1∶5-20，以堿液調(diào)節(jié)pH至8-9；以酸調(diào)節(jié)上清液pH至酸性時(shí)，pH為4-5。步驟5)通過離子交換樹脂的流速為10-15倍柱體積/h。
本發(fā)明以粉狀花生蛋白為原料，通過酶水解，膜分離等技術(shù)，制備出花生功能性混合短肽，與粉狀花生蛋白相比，具有良好的溶解性能和穩(wěn)定性能，如粉狀花生蛋白的粘度隨濃度增加而迅速升高，但花生功能性短肽在高濃度下仍保持流動(dòng)性；在溶解性方面，粉狀花生蛋白在其等電點(diǎn)會(huì)形成沉淀，而花生功能性短肽仍會(huì)保持溶解狀態(tài)；隨著體系溫度升高，粉狀花生蛋白會(huì)發(fā)生熱變性而沉淀，而花生功能性短肽則仍保持溶解狀態(tài)。并且，本發(fā)明發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明花生功能性混合短肽具有多種生物學(xué)功能，如抗高血壓和抗氧化等，可將其開發(fā)成相關(guān)的功能食品如降壓飲料、降壓片、活性肽粉等，能廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、日化、發(fā)酵等行業(yè)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、花生功能性混合短肽的制備本發(fā)明花生功能性混合短肽的制備流程如下
原料預(yù)處理→酶處理→滅酶→離心→超濾精制→脫鹽→真空濃縮→干燥。
具體過程為①原料預(yù)處理冷榨花生粕經(jīng)粉碎、過60-80目篩制成花生蛋白粉，再對(duì)花生蛋白粉進(jìn)行進(jìn)一步提純花生蛋白粉→水溶(料水重量比1∶10)→堿提(用NaOH調(diào)節(jié)pH＝8.5，25℃，25min)→離心(800g，5min)→上層清液→酸沉(以鹽酸調(diào)節(jié)pH＝4.5)→離心(4200g，15min)→收集沉淀②酶處理將沉淀配制4％的花生蛋白溶液，先以堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，條件為水解溫度55-60℃，水解時(shí)間90-120min，pH7.0-9.0，酶底比2500-3500U/g蛋白；然后，加入復(fù)合蛋白酶繼續(xù)處理，條件為水解溫度55-60℃，水解時(shí)間40-70min，pH6.0-7.0，酶底比1500-2500U/g蛋白。
③酶滅活快速升溫至90-95℃，保持10-20min使酶滅活，之后4200g離心20-30min，固液分離，得上清液即為花生功能性混合短肽原液。
④超濾精制使花生功能性短肽混合原液通過截留分子量為5000Da的超濾膜，去掉花生功能性混合短肽原液中的大分子片斷，得到花生功能性混合短肽液。
⑤脫鹽去離子交換樹脂于水中浸泡處理24小時(shí)后裝柱，然后分別用7.5％鹽酸或10％NaOH對(duì)其進(jìn)行處理，轉(zhuǎn)化為H+型陽離子交換樹脂和OH-型陰離子交換樹脂，再用水清洗至微酸性或微堿性待用。
將所得花生功能性短肽液，以10倍柱體積/h的流速通過H+型陽離子交換樹脂來脫除陽離子，待流出液pH＝4.0左右時(shí)停止加樣，之后將此流出液以同樣流速通過OH-型陰離子交換樹脂來脫除陰離子，至流出液呈弱酸性時(shí)停止加樣。
⑥濃縮、干燥通過真空濃縮至固形物含量35-40％，經(jīng)噴霧干燥或冷凍干燥制成干粉，產(chǎn)品得率≥50％(以蛋白量計(jì))。
所得花生功能性混合短肽干粉是一種白色或微黃色粉末，肽含量為85％，灰分5％，糖含量5％，干燥失重6％，脂肪4％；三氯乙酸氮溶解指數(shù)(TCA-NSI)為99.7％。所得混合短肽的分子量小于5000，其中分子量小于1000Da的短肽含量≥60％。
溶解性實(shí)驗(yàn)表明，該花生功能性混合短肽在所有pH下都能溶于水；熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明產(chǎn)品對(duì)熱很穩(wěn)定，體系溫度達(dá)100℃也不會(huì)產(chǎn)生沉淀。
實(shí)施例2、花生功能性混合短肽的功能實(shí)驗(yàn)①抗高血壓活性的測(cè)定將100μl樣品加入100μl 0.05M硼酸鹽緩沖液中，緩沖液pH為8.3，其中包括0.3M NaCl、25mU血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)，37℃預(yù)熱10min；加入150μl馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)啟動(dòng)反應(yīng)，37℃反應(yīng)1h，加入1M鹽酸250μl終止反應(yīng)；之后加入1.5ml乙酸乙酯萃取馬尿酸，漩渦混合后進(jìn)行離心(1800g，15min)；吸取1ml乙酸乙酯層移入另一試管中，烘干，冷卻后重新溶于3ml去離子水中，228nm下測(cè)定其吸光值，ACE抑制活性(％)＝(Aa-Ab)/(Aa-Ac)*100％其中Aa不存在抑制劑時(shí)的光密度Ab存在抑制劑與酶時(shí)的光密度Ac抑制劑與酶都不存在時(shí)的光密度②清除超氧陰離子自由基在一系列的試管中加9ml0.05M，pH＝8.2的Tris-Hcl緩沖液，加入樣品溶液100μl，空白組加入同體積的蒸餾水，再加入100μl的0.045M鄰苯三酚(以0.01MHCL配制)，漩渦分散器震蕩三分鐘，加入100μl10％抗壞血酸中止反應(yīng)，立即在325nm處測(cè)吸光值。
清除自由基的能力(SA)＝(A0-AS)/A0*100％其中A0為空白樣測(cè)定值，AS為樣品測(cè)定值③清除羥自由基在試管中依次加入0.5ml 9.1mM水楊酸-乙醇溶液，0.5ml的樣品，0.5ml 9mMFe2+溶液，3.5ml蒸餾水，最后加入5ml 88mM H2O2，顯色搖勻后，在510nm下測(cè)定清除活性。
清除能力＝(A0-As)/AO*100％其中A0(以樣品溶劑代替樣品)為空白樣測(cè)定值，As為樣品測(cè)定值④清除對(duì)二苯代苦味酰(DPPH)自由基1.5ml樣品添加至1.5ml，0.1mM的DPPH95％乙醇溶液中，混合物震蕩后在室溫下放置30min，517nm測(cè)定吸光度。
P＝(1-(A1-A2)/A3)*100％其中A1DPPH+樣品A295％乙醇+樣品A3DPPH+蒸餾水⑤抗氧化10ml具塞玻璃試管中加入1.5ml 0.15M(pH7.0)的磷酸鹽緩沖液，分別加入100μl樣品，100μl 50mM亞油酸-乙醇溶液和50μl 50mM的Fecl2-EDTA溶液，采用漩渦分散器震蕩三分鐘，于50℃暗處水浴保溫一段時(shí)間。
3ml 75％乙醇，100μl上述混合液，100μl 1M的Fecl2的1MHCL溶液，100μl30％KSCN，采用漩渦分散器震蕩三分鐘后，立即在480nm測(cè)定溶液的吸光度。
AA＝(A0-AS)/A0*100％其中抗氧化空白的吸光度為A0，加抗氧化劑是吸光度為AS。
所得花生功能性混合短肽的功能活性檢測(cè)結(jié)果如下抗高血壓活性0.4mg/ml樣品ACE抑制活性為50％；清除超氧陰離子自由基25mg/ml樣品清除率為33.83％；清除羥自由基15mg/ml樣品清除率為64.77％；清除DPPH自由基10mg/ml樣品清除率為71.6％；抗氧化25mg/ml樣品抗氧化活性為42.99％。
權(quán)利要求
1.一種花生功能性混合短肽，其特征在于所述混合短肽中肽的重量百分含量高于80％，灰分含量≤8％，糖含量≤5％，干燥失重≤7％，脂肪≤5％；分子量小于1000Da的短肽含量≥60％；三氯乙酸氮溶解指數(shù)≥99.5％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花生功能性混合短肽，其特征在于所述花生功能性混合短肽按如下過程制備1)原料預(yù)處理將花生蛋白粉以水溶解，加堿提取蛋白，離心取上清；以酸沉淀上清，離心收集沉淀；2)酶處理將沉淀以水溶解，加入堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，溫度55-60℃，時(shí)間90-120min，pH7.0-9.0，堿性蛋白酶用量為2500-3500U/g蛋白；然后，加入復(fù)合蛋白酶繼續(xù)處理，溫度55-60℃，時(shí)間40-70min，pH6.0-7.0，復(fù)合蛋白酶用量為1500-2500U/g蛋白；3)酶滅活將酶處理的蛋白溶液升溫至90-95℃，保持10-20min使酶滅活，離心取上清液，即為花生功能性混合短肽原液；4)超濾將花生功能性混合短肽原液通過截留分子量為5000-3000Da的超濾膜，去除大分子片斷，得到花生功能性混合短肽液；5)脫鹽、干燥將花生功能性混合短肽液連續(xù)通過H+型陽離子交換樹脂和OH-型陰離子交換樹脂，流出液經(jīng)濃縮、干燥，得到所述花生功能性混合短肽。
3.權(quán)利要求1所述花生功能性混合短肽的制備方法，包括如下步驟1)原料預(yù)處理將花生蛋白粉以水溶解，加堿提取蛋白，離心取上清；以酸調(diào)節(jié)上清液pH至酸性，離心收集沉淀；2)酶處理將沉淀以水溶解，加入堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，溫度55-60℃，時(shí)間90-120min，pH7.0-9.0，堿性蛋白酶用量為2500-3500U/g蛋白；然后，加入復(fù)合蛋白酶繼續(xù)處理，溫度55-60℃，時(shí)間40-70min，pH6.0-7.0，復(fù)合蛋白酶用量為1500-2500U/g蛋白；3)酶滅活將酶處理的蛋白溶液升溫至90-95℃，保持10-20min使酶滅活，離心取上清液，即為花生功能性混合短肽原液；4)超濾將所得花生功能性混合短肽原液通過截留分子量為5000-3000Da的超濾膜，去除大分子片斷，得到花生功能性混合短肽液；5)脫鹽、干燥將所得花生功能性混合短肽液連續(xù)通過H+型陽離子交換樹脂和OH-型陰離子交換樹脂，流出液經(jīng)濃縮、干燥，得到所述花生功能性混合短肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟1)花生蛋白粉的粒徑為60-80目。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟1)中，花生蛋白粉與水的重量比為1∶5-20，以堿液調(diào)節(jié)pH至8-9；以酸調(diào)節(jié)上清液pH至酸性時(shí)，pH為4-5。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟5)經(jīng)過H+型陽離子交換樹脂和OH-型陰離子交換樹脂的流速為10-15倍柱體積/h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種花生功能性混合短肽及其制備方法。本發(fā)明所提供的花生功能性混合短肽，肽的重量百分含量高于80％，灰分含量≤8％，糖含量≤5％，干燥失重≤7％，脂肪≤5％；分子量小于1000Da的短肽含量≥60％；三氯乙酸氮溶解指數(shù)≥99.5％。本發(fā)明以粉狀花生蛋白為原料，通過酶水解、膜分離等技術(shù)，制備出花生功能性混合短肽，與粉狀花生蛋白相比，具有良好的溶解性能和穩(wěn)定性能。并且，本發(fā)明的花生功能性混合短肽具有抗高血壓和抗氧化功能，能廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、日化、發(fā)酵等行業(yè)。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1916181SQ200610112479
公開日2007年2月21日 申請(qǐng)日期2006年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月21日
發(fā)明者王強(qiáng), 張宇昊 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所