專利名稱：用金磁微粒純化dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對(duì)DNA進(jìn)行純化的方法。
背景技術(shù)：
DNA純化是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，是下游實(shí)驗(yàn)的前提和基礎(chǔ)， 純化的質(zhì)量將直接關(guān)系到以后實(shí)驗(yàn)的成功與否，如PCR擴(kuò)增、酶切反應(yīng)、從血 液、唾液等樣品中純化DNA用于親子鑒定、刑事犯罪的基因鑒定以及從各種組 織中純化DNA以構(gòu)建文庫等。因此尋求快速、高效、簡(jiǎn)易、低成本的DNA純化 方法一直是人們關(guān)注的方向。
目前常用的幾種DNA提取方法均存在一些缺點(diǎn)。酚-氯仿純化方法，雖然適 用于大多數(shù)生物樣本，但實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間長(zhǎng)、步驟繁瑣、容易造成DNA的污染，也 不利于自動(dòng)化和多個(gè)樣本的同時(shí)純化，對(duì)微量生物樣品DNA純化亦存在困難。此 外，酚、氯仿等有機(jī)試劑易造成環(huán)境污染，有損操作者的健康。Chelex—100方 法簡(jiǎn)單，其原理基于樹脂的絡(luò)合作用，提取的DNA可直接用于PCR擴(kuò)增，但該方 法得到的DNA純度不高而不利于后繼分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，并且這種方法只適 用于微量樣品，不適合大量樣品的操作。玻璃珠法依賴于DNA與玻璃珠表面的靜 電吸附，優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)便，采用物理吸附法純化DNA不需要特殊的設(shè)備。但是 由于玻璃珠比表面積小，純化效率低，而且不能徹底除去抑制劑，限制了其應(yīng) 用的范圍。
磁珠法是近年來發(fā)展迅速的一種DNA純化方法，它具有操作簡(jiǎn)單、純化質(zhì) 量高、無酚、氯仿等有機(jī)試劑的污染等優(yōu)點(diǎn)，因此該方法越來越受到人們的親 睞。專利ZL 02139818.6采用氨基化二氧化硅磁性納米顆?？焖俪樘峒兓疍NA 的方法，專利CN 1370230A采用二氧化硅磁性顆粒對(duì)DNA的分離和專利CN 1535979A用磁性納米復(fù)合材料提取DNA的方法都對(duì)以磁性材料為載體純化DNA 進(jìn)行了公開，但是現(xiàn)有的磁性材料純化技術(shù)中存在純化率低、純度差、操作時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。
組裝型磁性復(fù)合微粒和核/殼型超順磁性復(fù)合微粒的制備方法以及結(jié)構(gòu)組
成已經(jīng)在中國(guó)專利ZL 03153486.4和ZL 03124061.5分別進(jìn)行了公開，但其應(yīng) 用中主要包括分子固定以及相關(guān)檢測(cè)的內(nèi)容，未涉及到對(duì)DNA進(jìn)行純化的內(nèi)容。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種用金磁微粒純化DNA的方法，其解決了現(xiàn)有技術(shù)對(duì) DNA純化效率低、純度差、操作時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。 本發(fā)明的技術(shù)解決方案是-
一種用金磁微粒純化DNA的方法，該方法包括以下步驟
l]制備含有DNA的液態(tài)樣品用裂解液將細(xì)胞或組織等樣品裂解得到含有 DNA的液態(tài)樣品，或者對(duì)DNA分離凝膠進(jìn)行溶解得到含有DNA的液態(tài)樣品，或者 直接使用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有DNA的液態(tài)樣品；
2]將金磁微粒和含有DNA的液態(tài)樣品混合將金磁微粒與含有DNA的液態(tài) 樣品混合，加入偶聯(lián)緩沖液，形成含有金磁微粒一DNA復(fù)合物的混合溶液；所述 偶聯(lián)緩沖液為聚乙二醇和鹽的混合溶液，其中聚乙二醇的分子量在6000 10000 之間，濃度為10% 35%，其中的鹽是氯化鈉、氯化鋰、氯化鋇、氯化鉀、氯化 鈣、氯化鎂或氯化銫，濃度為0.5 M 5.0 M;
3]將金磁微粒一DNA復(fù)合物從混合溶液中分離將混合溶液磁性分離，棄上 清，用清洗緩沖液清洗金磁微粒，重復(fù)磁性分離，直至上清澄清，移除上清， 得金磁微粒一DNA復(fù)合物；所述的清洗緩沖液為50% 100%的乙醇溶液；
4]將吸附在金磁微粒表面的DNA洗脫用洗脫緩沖液對(duì)金磁微粒進(jìn)行洗脫， 磁性分離至上清澄清，所得上清即為純化后的DNA的液態(tài)樣品，所述洗脫緩沖 液為水或pH二7. 0 9. 0的TE緩沖液。
上述方法還包括金磁微粒的預(yù)處理步驟為了去除影響DNA吸附的游離鐵 氧化物，在金磁微粒與含有DNA的液態(tài)樣品混合前，先用預(yù)處理緩沖液對(duì)金磁 微粒進(jìn)行清洗，所述預(yù)處理緩沖液為0.1M 1. 0 M的pH=6. 0 8. 5的EDTA溶液。
上述方法還包括金磁微粒的再生步驟將吸附在金磁微粒表面的DNA洗脫 完畢，磁性分離后的金磁微?？梢灾貜?fù)使用或是保存在預(yù)處理緩沖液中備用。
上述預(yù)處理緩沖液優(yōu)選0. 6 M的pH=7. 6的EDTA;偶聯(lián)緩沖液優(yōu)選25%的 PEG 8000和2.0 M的氯化鈉的混合溶液；清洗緩沖液優(yōu)選75%的乙醇溶液；洗 脫緩沖液優(yōu)選pH=7. 6的TE緩沖液。
上述裂解液包括堿性裂解液、酸性裂解液、碘化鈉裂解液、胍裂解液或SDS
裂解液。
上述堿性裂解液是裂解液I 、裂解液II、裂解液III和RNase A溶液。 上述DNA的液態(tài)樣品包括血液、精液、唾液、微生物、植物、質(zhì)粒、凝膠、 PCR液及動(dòng)物組織。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是
1、 純化率高，DNA的純化率一般在90%左右?，F(xiàn)有技術(shù)采用納米技術(shù)(CN 1535979A)的純化率為80%，本發(fā)明金磁微粒均具有金、銀組成的表面具有較大 的比表面積，因此具有更大的固定容量，在相同條件下，金磁微粒純化相同樣 品時(shí)用量比現(xiàn)有技術(shù)(CN 1535979A)的磁性微粒少，lmg的金磁微粒能夠純化 0.6 mg的基因組DNA。
2、 金磁微粒純化的DNA完整性好金磁微粒表面的金、銀顆粒，因其較大 的比表面積使得在吸附同樣長(zhǎng)度的DNA鏈時(shí)，所需要的金磁微粒數(shù)量少，對(duì)DNA 鏈的破壞小，純化的DNA完整性好。
3、 得到的DNA純度高。本發(fā)明純化的DNA的0D加)/0D28()在1.7 1.9之間， 表明本發(fā)明能夠有效的去除抑制劑和污染物；另外在金磁微粒和DNA形成復(fù)合 物時(shí)加入的偶聯(lián)緩沖液可以促進(jìn)DNA的吸附，同時(shí)減少其他物質(zhì)的吸附；清洗 過程中使用乙醇溶液多次洗滌，可以洗掉一些吸附的雜質(zhì)，尤其是易溶于有機(jī) 試劑的脂類或多糖，由于乙醇易揮發(fā)，不會(huì)留下殘留，所以得到的DNA純度高。 現(xiàn)有技術(shù)(CN 1535979A)的洗滌液成分復(fù)雜，特別是洗滌液II中的乙酸鈉容易 殘留，對(duì)后繼實(shí)驗(yàn)有一定的影響，而且乙酸鈉不易揮發(fā)，導(dǎo)致磁粒干燥時(shí)間長(zhǎng)。
4、 操作方便、快捷。 一支離心管即可完成全過程，整個(gè)過程用時(shí)不到一個(gè) 小時(shí)。偶聯(lián)緩沖液中合適的聚乙二醇(PEG)和鹽濃度可以促進(jìn)DNA在磁粒表面 的吸附。
5、 堿性裂解液相比胍裂解液和酸性裂解液，純化效果好。


圖1為利用本專利方法純化全血中基因組DNA的電泳照片；
圖2為純化前和純化后樣品的UV對(duì)比圖3是利用本專利方法純化全血中基因組DNA與傳統(tǒng)的酚/氯仿提取法相對(duì) 比的電泳圖片；
圖4為利用本專利方法純化的基因組DNA所作的PCR電泳圖片。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1是從全血中快速純化基因組DNA具體過程
l]金磁微粒的預(yù)處理
1. l]充分混勻金磁微粒確保磁粒完全懸浮在溶液中；
1.2]取100 "1金磁微粒于1.5 ml離心管中，把離心管置于磁性分離器上 磁性分離直至上清澄清；分離可在l min內(nèi)完成，移除上清；
1.3]把離心管和磁性分離器分開。向管中加入200 "1預(yù)處理緩沖液，用 移液器吹打混勻，然后重新置于磁性分離器上，移除上清；
1.4]重復(fù)步驟1.3] 1. 4]兩次。然后在離心管中加入200 lU偶聯(lián)緩沖液，
充分混勻。
2]DNA純化步驟
2.1]取200 ul全血加入1.5 ml離心管中，然后在管中加入800 u 1超純 水，充分混合，室溫靜置5 min;
2.2]8000 r/min離心3min。移除上清，在管底留有肉眼可見的白細(xì)胞層； 如果仍有紅細(xì)胞殘留，重復(fù)步驟2. 1] 2.2];
2.3]向管中加入30 iil裂解緩沖液I和60 ul裂解緩沖液II，然后加入l ul RNase A溶液，用移液器吹打混勻；室溫靜置5 min;
2.4]向管中加入45 ul裂解緩沖液III，用移液器吹打混勻；冰浴IO min;
2.5]向管中加入預(yù)處理的金磁微粒，用移液器輕輕吹打混勻；室溫靜置3 min。把離心管置于磁性分離器上磁性分離5 rniri，移除上清；
2.6]把離心管從磁性分離器上取下；向管中加入200 ul清洗緩沖液并用 移液器吹打混勻；離心管重新置于磁性分離器上磁性分離直至上清澄清，移除
上清；
2. 7]重復(fù)步驟2. 6]兩次。
2.8]室溫晾干3min。向管中加入50 u 1洗脫緩沖液，用移液器吹打混勻， 80。C水浴5 min;
2. 9]把離心管重新置于磁性分離器上分離直至上清澄清；把上清轉(zhuǎn)移到另 一離心管中保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2是從細(xì)菌中純化質(zhì)粒DNA的具體過程 l]金磁微粒的預(yù)處理
1. l]充分混勻金磁微粒確保磁粒完全懸浮在溶液中；
1. 2]取500 u 1金磁微粒于1. 5 ml離心管中，把離心管置于磁性分離器上 磁性分離直至上清澄清；分離可在1 min內(nèi)完成，移除上清；
1.3]把離心管和磁性分離器分開。向管中加入200 yl預(yù)處理緩沖液，用
移液器吹打混勻，然后重新置于磁性分離器上，移除上清；
1.4]重復(fù)步驟1.3] 1.4]兩次；然后在離心管中加入200 Ul偶聯(lián)緩沖液，
充分混勻；
2]DNA純化步驟
2. l]取lml過夜培養(yǎng)菌液，最高速離心30 sec,移除上清； 2.2]向管中加入60 U 1裂解緩沖液I和120 "l裂解緩沖液n，然后加入
2 ul RNase A溶液，用移液器吹打混勻；室溫靜置5 min;
2.3]向管中加入90 ul裂解緩沖液III，用移液器吹打混勻；冰浴IO min;
2.4]向管中加入預(yù)處理的金磁微粒，用移液器輕輕吹打混勻；室溫靜置3 iniri;把離心管置于磁性分離器上磁性分離5 min，移除上清；
2.5]把離心管從磁性分離器上取下。向管中加入200 ul清洗緩沖液并用 移液器吹打混勻；離心管重新置于磁性分離器上磁性分離直至上清澄清，移除 上清；
2.6]重復(fù)步驟2.6]兩次。
2.7]室溫晾干3min;向管中加入50 p 1洗脫緩沖液，用移液器吹打混勻， 80。C水浴5 min;
2.8 ]把離心管重新置于磁性分離器上分離直至上清澄清；把上清轉(zhuǎn)移到另
一離心管中，保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例3是從組織中純化基因組DNA的具體過程
1. l]取10mg 100 mg組織高速勻漿加入1. 5 ml離心管中；
1.2]向管中加入30u 1 300 ul裂解緩沖液I和60ul 600 ix 1裂解緩
沖液II，然后加入lii1 10 iil RNase A溶液，用移液器吹打混勻；室溫靜置
5 min;
1.3]向管中加入45u1 450 "l裂解緩沖液III，用移液器吹打混勻；冰浴 10 min;
1.4]向管中加入預(yù)處理的金磁微粒，用移液器輕輕吹打混勻；室溫靜置3 min;把離心管置于磁性分離器上磁性分離5 min，移除上清；
1.5]把離心管從磁性分離器上取下；向管中加入200ii1 1000 ul清洗緩
沖液并用移液器吹打混勻。離心管重新置于磁性分離器上磁性分離直至上清澄 清，移除上清；
1.6]重復(fù)步驟1.5]兩次；
1.7]室溫晾干3min;向管中加入50 u 1洗脫緩沖液，用移液器吹打混勻， 80。C水浴5 min;
1. 8]把離心管重新置于磁性分離器上分離直至上清澄清；把上清轉(zhuǎn)移到另
一離心管中保存?zhèn)溆谩?br> 圖l為利用本專利方法純化全血中基因組DNA的電泳照片；泳道l為Marker; 泳道2 泳道6為相同樣品純化的DNA，體現(xiàn)出重復(fù)性好，純化的片段大等優(yōu)點(diǎn)。
圖2為純化前和純化后樣品的UV對(duì)比圖，曲線l為純化前；曲線2為純化 后。純化前可以看出樣品中包含很多雜質(zhì)，沒有特征峰。而純化后在0026。處有 明顯的特征峰，而且0D湖/0D，在1.7 1.9之間，表明沒有或很少有蛋白質(zhì)和 RNA的污染。
圖3是利用本專利方法純化全血中基因組DNA與傳統(tǒng)的酚/氯仿提取法相對(duì) 比的電泳圖片；泳道l為Marker;泳道2 泳道3為用本發(fā)明純化的DNA;泳 道4 泳道5為相同樣品用傳統(tǒng)方法一酚/氯仿法純化的DNA。圖中表明本發(fā)明 純化的DNA不但量大而且重復(fù)性好。而酚/氯仿法純化的DNA量每次不一致， 重復(fù)性不好，在操作過程中會(huì)因人而異。
圖4為利用本專利方法純化的基因組DNA所作的PCR電泳圖片。泳道1為 Marker,泳道2 泳道5為人類Y染色體片段PCR擴(kuò)增片段所做的電泳圖；泳 道2 泳道3為男性，泳道4 泳道5為女性。圖可表明本發(fā)明純化的DNA純 度可以滿足下游的PCR等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明原理
利用金磁微粒從生物樣品中純化DNA只需通過一步簡(jiǎn)單的磁性分離，就可 對(duì)捕獲至金磁微粒表面的反應(yīng)物進(jìn)行富集、分離和純化。核殼型磁粒在水中有 良好的懸浮性，而且對(duì)外磁場(chǎng)有良好的磁響應(yīng)性，更易于與液態(tài)混合物中的游 離DNA結(jié)合和純化；組裝型金磁微粒的組裝層部分是納米級(jí)的金屬顆粒，因此 有更大的固定容量和更強(qiáng)的對(duì)生物分子的富集能力。因此，金磁微粒在DNA純 化方面極具應(yīng)用價(jià)值。
樣品處理通過某種途徑將樣品變成含有DNA的液態(tài)混合物。樣品為血液、 精液、唾液、微生物、植物、質(zhì)粒、凝膠、PCR液及動(dòng)物組織等包含DNA的物質(zhì)。
形成金磁微粒-DNA的復(fù)合物向含有DNA的液態(tài)混合物中加入偶聯(lián)緩沖液 和金磁微粒。認(rèn)A會(huì)迅速的非特異性的結(jié)合到金磁微粒的表面，形成金磁微粒 -DNA的復(fù)合物
分離收集金磁微粒-DNA的復(fù)合物利用金磁微粒的超順磁性，在外加磁場(chǎng) 的作用下可迅速的分離金磁微粒-DNA復(fù)合物。
偶聯(lián)緩沖液中聚乙二醇的分子量可以是從6000 10000，合適的濃度在 10% 35%之間。鹽可以是氯化鈉、氯化鋰、氯化鋇、氯化鉀、氯化l 、氯化鎂、 氯化銫等，適合的鹽濃度一般在0.5 5.0 M之間。加入含有聚乙二醇(PEG) 和鹽的偶聯(lián)緩沖液。
用75%的乙醇溶液(DNA不溶于75%的乙醇溶液)清洗吸附有DNA的金磁微 粒，以去除殘留在金磁微粒表面的污染物；洗脫緩沖液可以是水、TE緩沖液等 溶液。用乙醇溶液對(duì)金磁微粒-DNA復(fù)合物進(jìn)行清洗。洗脫液可以是水、TE緩沖 液或其他液體。
細(xì)胞或組織等樣品的裂解是采用堿性裂解液，分為裂解液I 、 II 、in和RNase
A溶液。
使用前用預(yù)處理緩沖液對(duì)金磁微粒進(jìn)行清洗，可除影響DNA吸附的鐵氧化 物。
金磁微粒是指以磁性納米粒子或磁性納米粒子的聚集體為核，在核表面包 覆單質(zhì)金、銀等貴金屬殼層形成的磁性復(fù)合微粒，也指以磁性納米粒子或磁性 納米粒子的聚集體為核，在核表面組裝納米金、銀等貴金屬粒子形成的磁性復(fù)
合微粒。所述磁性納米粒子包括Fe:A、 Y- FeA等鐵的氧化物粒子，單質(zhì)Fe、 Co、 Ni粒子，或由Fe與其它金屬元素形成的正鐵酸鹽粒子；磁性納米粒子的聚 集體是指經(jīng)修飾后形成的Fe304、 Y- Fe203等鐵的氧化物粒子聚集體，經(jīng)修飾后 形成的單質(zhì)Fe、 Co、 Ni粒子聚集體，或經(jīng)修飾后形成的Fe與其它金屬元素形 成的正鐵酸鹽粒子聚集體。
權(quán)利要求
1、一種用金磁微粒純化DNA的方法，其特征在于該方法包括以下步驟1]制備含有DNA的液態(tài)樣品用裂解液將細(xì)胞或組織等樣品裂解得到含有DNA的液態(tài)樣品，或者對(duì)DNA分離凝膠進(jìn)行溶解得到含有DNA的液態(tài)樣品，或者直接使用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有DNA的液態(tài)樣品；2]將金磁微粒和含有DNA的液態(tài)樣品混合將金磁微粒與含有DNA的液態(tài)樣品混合，加入偶聯(lián)緩沖液，形成含有金磁微粒-DNA復(fù)合物的混合溶液；所述偶聯(lián)緩沖液為聚乙二醇和鹽的混合溶液，其中聚乙二醇的分子量在6000～10000之間，濃度為10％～35％，其中的鹽是氯化鈉、氯化鋰、氯化鋇、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂或氯化銫，濃度為0.5M～5.0M；3]將金磁微粒-DNA復(fù)合物從混合溶液中分離將混合溶液磁性分離，棄上清，用清洗緩沖液清洗金磁微粒，重復(fù)磁性分離，直至上清澄清，移除上清，得金磁微粒-DNA復(fù)合物；所述的清洗緩沖液為50％～100％的乙醇溶液；4]將吸附在金磁微粒表面的DNA洗脫用洗脫緩沖液對(duì)金磁微粒進(jìn)行洗脫，磁性分離至上清澄清，所得上清即為純化后的DNA的液態(tài)樣品，所述洗脫緩沖液為水或pH＝7.0～9.0的TE緩沖液。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用金磁微粒純化DNA的方法，其特征在于所述 方法包括金磁微粒的再生步驟將吸附在金磁微粒表面的DNA洗脫完畢，磁性 分離后的金磁微粒可以重復(fù)使用或是保存在預(yù)處理緩沖液中備用。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用金磁微粒純化DNA的方法，其特征在于所述 方法包括金磁微粒的預(yù)處理步驟為了去除影響DNA吸附的游離鐵氧化物，在 金磁微粒與含有DNA的液態(tài)樣品混合前，先用預(yù)處理緩沖液對(duì)金磁微粒進(jìn)行清 洗，所述預(yù)處理緩沖液為0. 1M 1. 0 M的pH=6. 0 8. 5的EDTA溶液。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用金磁微粒純化DNA的方法，其特征在于所述 方法包括金磁微粒的再生步驟將吸附在金磁微粒表面的DNA洗脫完畢，磁性 分離后的金磁微粒可以重復(fù)使用或是保存在預(yù)處理緩沖液中備用。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的用金磁微粒純化DNA的方法，其特 征在于所述預(yù)處理緩沖液為0.6M的pH二7.6的EDTA;所述偶聯(lián)緩沖液為25%的PEG 8000和2. 0 M的氯化鈉的混合溶液；所述清洗緩沖液為75%的乙醇溶液; 洗脫緩沖液為pH=7. 6的TE緩沖液。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的用金磁微粒純化DNA的方法，其特 征在于所述裂解液包括堿性裂解液、酸性裂解液、碘化鈉裂解液、胍裂解液或SDS裂解液。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用金磁微粒純化DNA的方法，其特征在于所述 堿性裂解液為裂解液I、裂解液II、裂解液m和RNase A溶液。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的用金磁微粒純化DNA的方法，其特 征在于所述DNA的液態(tài)樣品包括血液、精液、唾液、微生物、植物、質(zhì)粒、 凝膠、PCR液及動(dòng)物組織。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用金磁微粒純化DNA的方法，包括1)制備含有DNA的液態(tài)樣品；2)金磁微粒與含有DNA的液態(tài)樣品混合，形成金磁微粒-DNA復(fù)合物；其中金磁微粒是以磁性納米粒子或磁性納米粒子的聚集體為核，在核表面包覆單質(zhì)金、銀等貴金屬殼層形成的磁性復(fù)合微粒，也是以磁性納米粒子或磁性納米粒子的聚集體為核，在核表面組裝納米金、銀等貴金屬粒子形成的磁性復(fù)合微粒；平均直徑為0.05～100μm；3)施加外磁場(chǎng)將吸附了DNA的金磁微粒與液態(tài)樣品其他組分分離；4)將吸附在磁性材料表面的DNA洗脫。本發(fā)明可有效地從各種樣品中純化DNA，具有純化率高，DNA完整性好、純度高，操作方便快捷的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101165182SQ20061010475
公開日2008年4月23日 申請(qǐng)日期2006年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月19日
發(fā)明者崔亞麗, 曹樹輝, 超 陳 申請(qǐng)人:陜西西大北美基因股份有限公司