專利名稱：大白菜橙色葉球的scar標(biāo)記及其用于輔助選擇育種的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)的蔬菜品種選育與生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及白菜的品種選育和分子標(biāo)記輔助選擇育種方法，特別是一種大白菜橙色葉球的SCAR標(biāo)記及其用于輔助選擇育種的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大白菜起源于我國，栽培面積和產(chǎn)量居蔬菜之首，大白菜的品質(zhì)和營養(yǎng)與人民身體健康密切相關(guān)。隨著人們生活水平的提高，對于大白菜品質(zhì)的要求越來越高。目前出現(xiàn)的彩色大白菜，顏色好看，不僅營養(yǎng)價(jià)值較高，而且加工腌制不變色等優(yōu)點(diǎn)很受歡迎。
申請人的園藝學(xué)院蔬菜科學(xué)系于1993年開始彩色大白菜育種，配制的秋大白菜一代雜種“金冠1號”和“金冠2號”彩色大白菜新品種，在2004年已經(jīng)通過陜西省審定，同時(shí)受得了國內(nèi)外媒體的廣泛關(guān)注和大白菜生產(chǎn)者的青睞。由于傳統(tǒng)的葉球顏色表型選擇要在結(jié)球末期，采用田間剖球觀察進(jìn)行，操作起來費(fèi)時(shí)費(fèi)力，很大程度上延緩了育種進(jìn)程。為了加快彩色大白菜的育種速度，采用現(xiàn)代生物技術(shù)，進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種十分迫切。
分子標(biāo)記是近年來研究的熱門領(lǐng)域，它以DNA為研究對象，具有以下優(yōu)越性(1)直接以DNA的形式表現(xiàn)，在植物體的各個(gè)組織、各發(fā)育時(shí)期均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否的問題；(2)數(shù)量極多，遍及整個(gè)基因組，可檢測到的基因座位幾乎是無限的；(3)多態(tài)性高，自然界存在著許多等位變異，不需專門創(chuàng)造特殊的遺傳材料；(4)表現(xiàn)為“中性”，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無必然的連鎖；(5)有許多分子標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性(codominance)，能夠鑒別出純合基因型與雜合基因型，提供完整的遺傳信息，因而現(xiàn)已形成許多分子標(biāo)記系統(tǒng)。
PCR技術(shù)是近年來發(fā)展起來的DNA分子標(biāo)記之一，與RFLP相比，RAPD標(biāo)記具有以下特點(diǎn)(1)RAPD的引物具有通用性，同一套引物可適用于不同生物基因組的分析。相反RFLP標(biāo)記具有種族特異性，只在一定的種屬范圍內(nèi)可相互使用；(2)RAPD技術(shù)簡單成熟，可程序化作業(yè)，特別適于大批量檢測；(3)由于引物的隨機(jī)性，RAPD標(biāo)記幾乎可覆蓋整個(gè)基因組；(4)RAPD標(biāo)記一般表現(xiàn)為顯性遺傳，不能區(qū)分雜合型和純合型；(5)RAPD標(biāo)記一般可以同時(shí)檢測多個(gè)位點(diǎn)，很適于快速構(gòu)建遺傳圖譜和不同材料多態(tài)性篩選；(6)RAPD分析不使用同位素，因而比較安全，也不受特殊地區(qū)規(guī)定限制；(7)RAPD技術(shù)DNA用量少，不受植株生長條件、時(shí)期的限制。所以，RAPD分析非常適于大規(guī)模樣品的植物育種、種群遺傳學(xué)和生物多樣性等眾多研究領(lǐng)域。
SCAR標(biāo)記，即序列特異擴(kuò)增帶，是基于RAPD發(fā)展起來的一類標(biāo)記，在對多態(tài)性RAPD產(chǎn)物測序的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)一對新的引物，特異地?cái)U(kuò)增一個(gè)在遺傳上定義為一個(gè)位點(diǎn)的DNA區(qū)段。在對多態(tài)性RAPD產(chǎn)物測序的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)一對新的引物，特異地?cái)U(kuò)增一個(gè)在特定位點(diǎn)的DNA片段，一般在原RAPD引物的3’與5’端延長14個(gè)堿基，利用兩端各24個(gè)堿基的引物進(jìn)行特異擴(kuò)增，因此，該方法與RAPD相比具有如下優(yōu)點(diǎn)由于使用較長的引物和高退火溫度，因此具有重復(fù)性和穩(wěn)定性好，帶型簡單等優(yōu)點(diǎn)，因此，SCAR標(biāo)記成為分子育種、品種鑒定和種子純度鑒定的首選標(biāo)記。
總之，分子標(biāo)記不受基因表達(dá)時(shí)間、顯隱關(guān)系、環(huán)境因素等條件影響，利用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記可在生育早期階段進(jìn)行選擇，減少了選擇的盲目性，縮短了育種年限，從而可以大大提高育種效率，加快育種進(jìn)程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種大白菜橙色葉球的SCAR標(biāo)記及其用于輔助選擇育種的用途。
本發(fā)明采用RAPD技術(shù)，尋找與橙色葉球性狀緊密連鎖的RAPD分子標(biāo)記，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，為開展大白菜球色分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。
為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案一種大白菜橙色葉球的SCAR標(biāo)記，其特征在于，該SCAR標(biāo)記的特異片斷S82-591全長591bp，其基因序列為GGCACTGAGGATTGGGTTCCTACTAGAATTTAAATAGCTTCTTTGAAGACTTTATCTAAAATAGATGTGAACATGACTACACAAGTCAACTAAAAACTCAACCCATCATTGACTTTTGCGTTTACCTCCCACTATGAGAATAGACCAGTGAGTGCATATCCATCACCTATTAGGTGTCAGCCTCTATGGAGGGGCCTTTGCTACACTCTTAACATTTGTATCCATGTTTGCATTTTATAGATGGGTCGTTAAGAGTTTCAAACAGCACTAACTTTACCAAACATATCATTTTAAAACATAACAAGTCAAACAAAACAACTGATTCTAGAGAGAAATTAAATGGAAAAACAACATAATCATCATGACTGAATCTTGGACATTTTAGTAAGAACGGAAGAAGCTCTGGTTACAAAAGGATCTTAAGCCTTCTCTTCTTCATCTTCTTCAATCTTAGGAGCCAAGTAGTAACGAATGTAACCCATCTCAGCCACCTTATACTCCACCACAACTGGCAGCTCAGACGATAAGCTGATCGTCACTGTGTCCGACAAAGGAGTTGCCTTTGTGAAGGAGTTCATGTACCTCAGTGCC。
上述特異片斷S82-591兩端為S82引物序列為5’GGCA CTGA GG3’，根據(jù)S82-591的測序結(jié)果設(shè)計(jì)的SCAR引物如下fS82-6005’GGCACTGAGGATTGGGTTC 3’rS82-6005’GGCACTGAGGTACATGAAC3’。
上述大白菜橙色葉球的SCAR標(biāo)記，經(jīng)申請人的實(shí)驗(yàn)證明，能夠用于輔助選擇育種的應(yīng)用。
將該SCAR引物進(jìn)行大白菜橙色葉球性狀的輔助選擇育種的方法是，首先進(jìn)行彩色大白菜自交系和受體普通大白菜基因重組群體材料的準(zhǔn)備，接著進(jìn)行DNA提取，SCAR引物的設(shè)計(jì)，SCAR引物擴(kuò)增，SCAR標(biāo)記在分離群體中分離規(guī)律分析，陽性SCAR標(biāo)記單株的選擇，具體包括下列步驟1)基因重組群體材料的準(zhǔn)備以供體彩色大白菜自交系和受體普通大白菜雜交，單株自交，隨機(jī)選取50-100株F2單株和親本種子催芽育苗后移栽至大田，在幼苗期給F2單株編號，于苗期取幼苗嫩葉片提取DNA備用，成株期根據(jù)品種特性鑒定生物學(xué)性狀；2)DNA提取A.在1.5ml的離心管中加入750μL1×CTAB提取液，其中，CTAB 2％，Tris-HCI100mmol/L，EDTA 20mmol/L，NaCl 1.4mol/L，并加入8μL β-巰基乙醇搖勻；B.取0.2g去掉主脈的新鮮嫩葉片，加入液氮研磨至粉末，然后將1.5ml離心管中提取液加入到研缽中，混勻后轉(zhuǎn)入到離心管中，并不斷地?fù)u動離心管；C.隨后將離心管放入65℃水浴中，中間每間隔幾分鐘搖一次，水浴30min；D.取出離心管，加入等體積的酚氯仿異戊醇的混合物，其中，酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1，搖勻10min后，常溫下12000r/min離心10min；E.將上層液相轉(zhuǎn)移到另一離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇，其比例為24∶1，搖勻10min，常溫下12000r/min離心10min；F.取上清加入2倍體積的預(yù)冷的無水乙醇，混勻后，使DNA抱團(tuán)，-20℃條件下沉淀30min，4℃條件下12000r/min離心10min；G.棄上清，加入1ml 75％乙醇洗滌沉淀2～3次，沉淀物室溫晾干；H.加入400～500μL TE緩沖液溶解DNA，加入1.5μL RNaseA(10μg/μL)，使終濃度達(dá)10μg/mL，混勻后37℃保溫30min；I.待DNA完全溶解后，加入3mol/L NaAC溶液40μL～50μL和等體積的異丙醇，搖勻使DNA充分沉淀，冰浴15min；J.在4℃，12000r/m條件下離心10min，棄上清，加入75％的乙醇清洗沉淀1～2次，后加入1200μL DNA貯存液，DNA貯存液由75％乙醇，0.3mol/LNaAC溶液構(gòu)成；提取的DNA，經(jīng)純度檢測，證實(shí)純化較好，一般用滅菌的400～500μLddH2O稀釋，存于4℃中備用；3)SCAR引物設(shè)計(jì)特異標(biāo)記SC82-591的SCAR引物如下fS82-6005’GGCACTGAGGATTGGGTTC 3’rS82-6005’GGCACTGAGGTACATGAAC 3’4)SCAR-PCR擴(kuò)增SCAR-PCR擴(kuò)增在25μL PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行，反應(yīng)體系中有10×PCR緩沖液2.5μL，Taq DNA聚合酶1Unit，MgCl2濃度為2.5mmol/L，上、下游特異性引物濃度分別為0.3μmol/L，4種dNTP濃度各為0.2mmol/L，模板DNA 30～50ng；PCR反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性94℃/4min、94℃/60s、60℃/60s、72℃/90s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min；電泳取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物與2μL的6×Loading buffer混勻，點(diǎn)入含0.5μg/ml EB的1.5％瓊脂糖凝膠中，在120V下電泳1h，經(jīng)EB染色后在凝膠成像議中觀察照相，以DL2000marker為標(biāo)準(zhǔn)分子量；5)SCAR標(biāo)記與橙色葉球性狀的連鎖關(guān)系針對目標(biāo)基因的重組群體，統(tǒng)計(jì)純合型白色葉球的單株、純合型橙色葉球的單株和雜和型白色單株中SCAR標(biāo)記的數(shù)量，根據(jù)Mapmaker Ver.3.0計(jì)算遺傳距離為3.7cM，表明S82-591與橙色基因緊密連鎖，其理論選擇效率為96.3％；
6)SCAR標(biāo)記的特征及其選擇策略SCAR引物在橙色池單株中擴(kuò)增出一條特異標(biāo)記SC82-591；白色池中的單株中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，沒有特異條帶SC82-591，因此對于重組分離群體，只要后代單株中檢測存在特異條帶SC82-591，就一定攜帶橙色葉球基因，而無需等到結(jié)球時(shí)期選擇，即有SCAR標(biāo)記的單株就攜帶有橙色葉球基因，該單株被選留，通過SCAR標(biāo)記間接選擇橙色葉球性狀，能夠起到早期、快速、準(zhǔn)確選擇分子育種。
本發(fā)明對196個(gè)F2群體單株DNA用SCAR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增表明，在45個(gè)純合型白色葉球的單株中有42株未擴(kuò)增到特異條帶SC82-591，3株擴(kuò)增出此帶；39個(gè)純合型橙色葉球的單株中，37株擴(kuò)增出此條帶，而2株沒有擴(kuò)增出此條帶，112個(gè)雜和型白色單株中，有2株沒有擴(kuò)增出此條帶，這一擴(kuò)增結(jié)果與RAPD標(biāo)記的在F2代中的分離結(jié)果相吻合；根據(jù)Mapmaker Ver.3.0計(jì)算遺傳距離其為3.7cM，表明S82-591與橙色基因緊密連鎖，其理論選擇效率為96.3％。。


圖1是CTAB法提取的大白菜基因組DNA檢測圖；圖2是幾個(gè)引物在優(yōu)化后的RAPD體系下的擴(kuò)增結(jié)果圖；圖3-1引物S82對兩基因池的F2單株DNA擴(kuò)增結(jié)果圖，其中MDL2000DNA marker；1～10橙色池中單株；11～20白色池中各單株；圖3-2引物S82對F2橙色單株和白色單株DNA擴(kuò)增結(jié)果圖，其中，MDL2000 DNA marker；21～31橙色單株；32～40白色單株；圖3-3引物S82對F2橙色單株和白色單株DNA擴(kuò)增結(jié)果圖，其中，MDL2000DNA marker；41～50橙色單株；51～62白色單株；圖4是引物SC82-591對混合池單株的擴(kuò)增結(jié)果圖，其中，MDL2000DNAmarker；1橙色池的RAPD擴(kuò)增；2白色池的RAPD擴(kuò)增；3～11白色池中各單株的SCAR擴(kuò)增；12～18橙色池中各單株的SCAR擴(kuò)增；圖5是SC82-591標(biāo)記在F2橙色單株中的擴(kuò)增結(jié)果圖；以下結(jié)合附圖和發(fā)明人給出的利用大白菜橙色葉球的SCAR標(biāo)記進(jìn)行分子輔助選擇育種方法對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明以彩色大白菜自交系和普通大白菜自交系配制了4套F1、F2、BC1材料為研究材料，分別如下(1)母本早皇白-4，父本S941-6，回交親本S941-6；(2)母本S941-1，父本01S160-1，回交親本S941-6；(3)母本S941-7，父本77M-5，回交親本S941-6；(4)母本S941-2，父本01Sb5-1，回交親本S941-6；研究利用RAPD技術(shù)篩選與橙色葉球相關(guān)的特異性引物，進(jìn)一步對特異片段克隆測序，轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，通過F2代分離表現(xiàn)，計(jì)算連鎖距離，將SCAR標(biāo)記應(yīng)用于分子育種。
首先進(jìn)行PCR反應(yīng)體系優(yōu)化，接著進(jìn)行特異性引物篩選，特異性條帶的克隆測序，SCAR引物的設(shè)計(jì)，SCAR引物的驗(yàn)證與分離群體分離規(guī)律分析。
具體如下1.大白菜橙色葉球遺傳規(guī)律在4套材料中，F(xiàn)1群體全部表現(xiàn)為白色葉球。由表2可以看出，4套材料中，F(xiàn)2代群體中橙色葉球單株與白色葉球單株的比例約為1∶3，回交后代群體中橙色葉球單株與白色葉球單株的比例約為1∶1。從田間實(shí)驗(yàn)性狀統(tǒng)計(jì)結(jié)果充分說明橙色性狀為隱性單基因控制的獨(dú)立遺傳，符合孟德爾遺傳規(guī)律。
表1 大白菜F2，BC1的葉球顏色表現(xiàn)型和比例


χ2＝∑[(O-E)2/E]自由度＝2-1 χ0.052＝3.842.小量法DNA提取A.在1.5ml的離心管中加入750μL1×CTAB(CTAB 2％，Tris-HCI(pH8.0)100mmol/L，EDTA 20mmol/L，NaCl 1.4mol/L，)提取液，并加入8μL β-巰基乙醇搖勻。
B.取0.2g去掉主脈的新鮮嫩葉片，加入液氮研磨至粉末，然后將1.5ml離心管中提取液加入到研缽中，混勻后轉(zhuǎn)入到離心管中，并不斷地?fù)u動離心管。
C.隨后將離心管放入65℃水浴中，中間每間隔幾分鐘搖一次，水浴30min。
D.取出離心管，加入等體積的酚、氯仿、異戊醇混合物，其中，酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1，搖勻10min后，常溫下12000r/min離心10min。
E.將上層液相轉(zhuǎn)移到另一離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)后，搖勻10min，常溫下12000r/min離心10min。
F.取上清加入2倍體積的預(yù)冷的無水乙醇，混勻后，使DNA抱團(tuán)，-20℃沉淀30min，4℃下12000r/min離心10min。
G.棄上清，加入1ml 75％乙醇洗滌沉淀2～3次，沉淀室溫晾干。
H.加入400～500μL TE緩沖液溶解DNA，加入1.5μL RNaseA(10μg/μL)，使終濃度達(dá)10μg/mL，混勻后37℃保溫30min(期間輕彈管壁，充分溶解DNA)。
I.待完全溶解后，加入3m0l/L NaAC溶液40~50μL(終濃度達(dá)到0.3mol/L)預(yù)冷的等體積的異丙醇，搖勻使DNA充分沉淀，冰浴15min。
J.在4℃，12000r/m下離心10min，然后棄上清，加入75％的乙醇清洗沉淀1～2次，后加入1200μLDNA貯存液(75％乙醇，0.3mol/L NaAC溶液)。
提取的DNA，經(jīng)純度檢測，證實(shí)純化較好，一般用滅菌的400～500μLddH2O稀釋，存于4℃中備用。
3.優(yōu)化的RAPD體系將提取的大白菜基因組DNA稀釋后，取8μLDNA樣品與1.6μL6×Loading buffer混勻后，經(jīng)含0.5μg/ml EB的0.8％瓊脂糖凝膠中電泳，檢測DNA質(zhì)量。由附圖1可見，采用改進(jìn)的CTAB法提取的DNA片段電泳條帶清晰、無污染、無明顯降解發(fā)生，能保證基因組所攜帶信息量的完整性。表明該方法提取的DNA純度較高，可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要。由附圖2可見，以提取的基因組DNA為模板，采用優(yōu)化之后的RAPD體系進(jìn)行分析，擴(kuò)增條帶清晰、無脫尾現(xiàn)象、且條帶較多、重復(fù)性較好，可滿足RAPD分析需要。
4.多態(tài)性RAPD引物的篩選用400個(gè)隨機(jī)引物，分別對橙色池和白色池進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，結(jié)果80％的隨機(jī)引物均能擴(kuò)增出清晰DNA條帶。
在橙色葉球池和白色葉球池間表現(xiàn)出多態(tài)性的引物有330個(gè)，占所用引物數(shù)量的82.5％。在橙色葉球池中有特征性條帶的引物有13條，在白色池中擴(kuò)增出特征性條帶的引物有6條。其中引物S82經(jīng)多次重復(fù)擴(kuò)增，在兩池間表現(xiàn)穩(wěn)定、一致的差異，引物S82共擴(kuò)出8條帶，除一條帶在兩池間表現(xiàn)出多態(tài)性外，其余條帶在兩混和池間無多態(tài)性，引物S82在橙色池?cái)U(kuò)增出一特異條帶S82-591，而白色池缺失這條帶。
5.S82-591片斷在F2群體中的分離情況用特異性引物S82對F2代群體的各單株進(jìn)行擴(kuò)增，對標(biāo)記進(jìn)一步檢測。構(gòu)建橙色池的10個(gè)單株全部擴(kuò)增到S82-591條帶(附圖3)，構(gòu)建白色池的單株中有9株沒有擴(kuò)增到此條帶，有1株擴(kuò)增到此帶，說明此單株可能是發(fā)生了交換。在整個(gè)196個(gè)F2群體中，在39株橙色葉球單株中，有2株未擴(kuò)到此條帶；在45株基因純合型白色葉球單株中有3株擴(kuò)到了此條帶，而42株未擴(kuò)到此條帶；在112株基因雜合型白色葉球單株中有110株擴(kuò)到了此條帶，有2株沒有擴(kuò)增出此條帶，RAPD鑒定結(jié)果與田間球色記載完全相符。7個(gè)不符單株的出現(xiàn)，可能是由于在自交過程中發(fā)生了基因重組，重組位點(diǎn)正好位于標(biāo)記和橙色葉球基因之間使得標(biāo)記位點(diǎn)與目的基因重組到不同配子中，導(dǎo)致了上述7個(gè)單株的RAPD標(biāo)記與田間株型表現(xiàn)不符。根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果和植株的表現(xiàn)型應(yīng)用Mapmaker Ver.3.0計(jì)算遺傳距離為3.7cM(centimorgan)，表明S82-591與橙色基因緊密連鎖。
表1 S82-591標(biāo)記與橙色基因的遺傳連鎖分析

6.特異片斷的測序及SCAR引物設(shè)計(jì)測序結(jié)果表明特異片斷S82-591全長591bp，如下GGCACTGAGGATTGGGTTCCTACTAGAATTTAAATAGCTTCTTTGAAGACTTTATCTAAAATAGATGTGAACATGACTACACAAGTCAACTAAAAACTCAACCCATCATTGACTTTTGCGTTTACCTCCCACTATGAGAATAGACCAGTGAGTGCATATCCATCACCTATTAGGTGTCAGCCTCTATGGAGGGGCCTTTGCTACACTCTTAACATTTGTATCCATGTTTGCATTTTATAGATGGGT
CGTTAAGAGTTTCAAACAGCACTAACTTTACCAAACATATCATTTTAAAACATAACAAGTCAAACAAAACAACTGATTCTAGAGAGAAATTAAATGGAAAAACAACATAATCATCATGACTGAATCTTGGACATTTTAGTAAGAACGGAAGAAGCTCTGGTTACAAAAGGATCTTAAGCCTTCTCTTCTTCATCTTCTTCAATCTTAGGAGCCAAGTAGTAACGAATGTAACCCATCTCAGCCACCTTATACTCCACCACAACTGGCAGCTCAGACGATAAGCTGATCGTCACTGTGTCCGACAAAGGAGTTGCCTTTGTGAAGGAGTTCATGTACCTCAGTGCC兩端為S82引物序列(5’GGCA CTGA GG3’)，根據(jù)S82-591的測序結(jié)果設(shè)計(jì)的SCAR引物fS82-6005’GGCACTGAGGATTGGGTTC 3’rS82-6005’GGCACTGAGGTACATGAAC 3’7.SCAR引物在F2群體中的擴(kuò)增結(jié)果利用SCAR引物，在F2群體中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在附圖4中，1、2泳道為用引物S82對橙色池和白色池進(jìn)行RAPD擴(kuò)增結(jié)果，從圖中可以看出，SCAR引物擴(kuò)增出一條與S82-591等長的片斷，命名為SC82-591。白色池中的9個(gè)單株未擴(kuò)出特異條帶SC82-591，而橙色池中的這7個(gè)單株均擴(kuò)出特異條帶SC82-591。對196個(gè)F2群體單株DNA用SCAR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(附圖5，部分圖片)，在45個(gè)純合型白色葉球的單株中有42株未擴(kuò)增到特異條帶SC82-591，3株擴(kuò)增出此帶；39個(gè)純合型橙色葉球的單株中，37株擴(kuò)增出此條帶，而2株沒有擴(kuò)增出此條帶，112個(gè)雜和型白色單株中，有2株沒有擴(kuò)增出此條帶，這一擴(kuò)增結(jié)果與RAPD標(biāo)記的在F2代中的分離結(jié)果相吻合。
SC82-591特異片斷核酸序列及SCAR引物序列特異片斷S82-591全長591bp，如下GGCACTGAGGATTGGGTTCCTACTAGAATTTAAATAGCTTCTTTGAAGACTTTATCTAAAATAGATGTGAACATGACTACACAAGTCAACTAAAAACTCAACCCATCATTGACTTTTGCGTTTACCTCCCACTATGAGAATAGACCAGTGAGTGCATATCCATCACCTATTAGGTGTCAGCCTCTATGGAGGGGCCTTTGCTACACTCTTAACATTTGTATCCATGTTTGCATTTTATAGATGGGTCGTTAAGAGTTTCAAACAGCACTAACTTTACCAAACATATCATTTTAAAACATAACAAGTCAAACAAAACAACTGATTCTAGAGAGAAATTAAATGGAAAAACAACATAATCATCATGACTGAATCTTGGACATTTTAGTAAGAACGGAAGAAGCTCTGGTTACAAAAGGATCTTAAGCCTTCTCTTCTTCATCTTCTTCAATCTTAGGAGCCAAGTAGTAACGAATGTAACCCATCTCAGCCACCTTATACTCCACCACAACTGGCAGCTCAGACGATAAGCTGATCGTCACTGTGTCCGACAAAGGAGTTGCCTTTGTGAAGGAGTTCATGTACCTCAGTGCC兩端為S82引物序列(5’GGCA CTGA GG3’)，根據(jù)S82-591的測序結(jié)果設(shè)計(jì)的SCAR引物fS82-6005’GGCACTGAGGATTGGGTTC 3’rS82-6005’GGCACTGAGGTACATGAAC 3’
權(quán)利要求
1.一種大白菜橙色葉球的SCAR標(biāo)記，其特征在于，該SCAR標(biāo)記的特異片斷S82-591全長591bp，其核酸序列為GGCACTGAGGATTGGGTTCCTACTAGAATTTAAATAGCTTCTTTGAAGACTTTATCTAAAATAGATGTGAACATGACTACACAAGTCAACTAAAAACTCAACCCATCATTGACTTTTGCGTTTACCTCCCACTATGAGAATAGACCAGTGAGTGCATATCCATCACCTATTAGGTGTCAGCCTCTATGGAGGGGCCTTTGCTACACTCTTAACATTTGTATCCATGTTTGCATTTTATAGATGGGTCGTTAAGAGTTTCAAACAGCACTAACTTTACCAAACATATCATTTTAAAACATAACAAGTCAAACAAAACAACTGATTCTAGAGAGAAATTAAATGGAAAAACAACATAATCATCATGACTGAATCTTGGACATTTTAGTAAGAACGGAAGAAGCTCTGGTTACAAAAGGATCTTAAGCCTTCTCTTCTTCATCTTCTTCAATCTTAGGAGCCAAGTAGTAACGAATGTAACCCATCTCAGCCACCTTATACTCCACCACAACTGGCAGCTCAGACGATAAGCTGATCGTCACTGTGTCCGACAAAGGAGTTGCCTTTGTGAAGGAGTTCATGTACCTCAGTGCC。
2.權(quán)利要求1所述的大白菜橙色葉球的SCAR標(biāo)記用于大白菜橙色葉球性狀的輔助選擇育種應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，特異片斷S82-591兩端為S82引物序列為5’GGCA CTGA GG3’，根據(jù)S82-591的測序結(jié)果設(shè)計(jì)的SCAR引物如下fS82-6005’GGCACTGAGGATTGGGTTC3’rS82-6005’GGCACTGAGGTACATGAAC3’。
4.如權(quán)利要求2的所述的應(yīng)用，其特征在于，將該SCAR引物進(jìn)行大白菜橙色葉球性狀的輔助選擇育種的方法是，首先進(jìn)行彩色大白菜自交系和受體普通大白菜基因重組群體材料的準(zhǔn)備，接著進(jìn)行DNA提取，SCAR引物的設(shè)計(jì)，SCAR引物擴(kuò)增，SCAR標(biāo)記在分離群體中分離規(guī)律分析，陽性SCAR標(biāo)記單株的選擇，具體包括下列步驟1)基因重組群體材料的準(zhǔn)備以供體彩色大白菜自交系和受體普通大白菜雜交，單株自交，隨機(jī)選取50-100株F2單株和親本種子催芽育苗后移栽至大田，在幼苗期給F2單株編號，于苗期取幼苗嫩葉片提取DNA備用，成株期根據(jù)品種特性鑒定生物學(xué)性狀；2)DNA提取A.在1.5ml的離心管中加入750μL1×CTAB提取液，其中，CTAB 2％，Tris-HCI100mmol/L，EDTA 20mmol/L，NaCl 1.4mol/L，并加入8μLβ-巰基乙醇搖勻；B.取0.2g去掉主脈的新鮮嫩葉片，加入液氮研磨至粉末，然后將1.5ml離心管中提取液加入到研缽中，混勻后轉(zhuǎn)入到離心管中，并不斷地?fù)u動離心管；C.隨后將離心管放入65℃水浴中，中間每間隔幾分鐘搖一次，水浴30min；D.取出離心管，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇的混合物，其中，酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1，搖勻10min后，常溫下12000r/min離心10min；E.將上層液相轉(zhuǎn)移到另一離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇，其比例為24∶1，搖勻10min，常溫下12000r/min離心10min；F.取上清加入2倍體積的預(yù)冷的無水乙醇，混勻后，使DNA抱團(tuán)，-20℃條件下沉淀30min，4℃條件下12000r/min離心10min；G.棄上清，加入1ml 75％乙醇洗滌沉淀2～3次，沉淀物室溫晾干；H.加入400～500μL TE緩沖液溶解DNA，加入1.5μL RNaseA(10μg/μL)，使終濃度達(dá)10μg/mL，混勻后37℃保溫30min；I.待DNA完全溶解后，加入3mol/L NaAC溶液40μL～50μL和等體積的異丙醇，搖勻使DNA充分沉淀，冰浴15min；J.在4℃，12000r/m條件下離心10min，棄上清，加入75％的乙醇清洗沉淀1～2次，后加入1200μL DNA貯存液，DNA貯存液由75％乙醇，0.3mol/LNaAC溶液構(gòu)成；提取的DNA，經(jīng)純度檢測，證實(shí)純化較好，一般用滅菌的400～500μLddH2O稀釋，存于4℃中備用；3)SCAR引物設(shè)計(jì)特異標(biāo)記SC82-591的SCAR引物如下fS82-6005’GGCACTGAGGATTGGGTTC3’rS82-6005’GGCACTGAGGTACATGAAC3’4)SCAR-PCR擴(kuò)增SCAR-PCR擴(kuò)增在25μL PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行，反應(yīng)體系中有10×PCR緩沖液2.5μL，Taq DNA聚合酶1Unit，MgCl2濃度為2.5mmol/L，上、下游特異性引物濃度分別為0.3μmol/L，4種dNTP濃度各為0.2mmol/L，模板DNA 30～50ng；PCR反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性94℃/4min、94℃/60s、60℃/60s、72℃/90s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min；電泳取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物與2μL的6×Loading buffer混勻，點(diǎn)入含0.5μg/ml EB的1.5％瓊脂糖凝膠中，在120V下電泳1h，經(jīng)EB染色后在凝膠成像議中觀察照相，以DL2000marker為標(biāo)準(zhǔn)分子量；5)SCAR標(biāo)記與橙色葉球性狀的連鎖關(guān)系針對目標(biāo)基因的重組群體，統(tǒng)計(jì)純合型白色葉球的單株、純合型橙色葉球的單株和雜和型白色單株中SCAR標(biāo)記的數(shù)量，根據(jù)Mapmaker Ver.3.0計(jì)算遺傳距離為3.7cM，表明S82-591與橙色基因緊密連鎖，其理論選擇效率為96.3％；6)SCAR標(biāo)記的特征及其選擇策略SCAR引物在橙色池單株中擴(kuò)增出一條特異標(biāo)記SC82-591，白色池中的單株中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，沒有特異條帶SC82-591，對于重組分離群體，只要后代單株中檢測存在特異條帶SC82-591，就一定攜帶橙色葉球基因，而無需等到結(jié)球時(shí)期選擇，即有SCAR標(biāo)記的單株就攜帶有橙色葉球基因，該單株被選留，通過SCAR標(biāo)記間接選擇橙色葉球性狀，能夠早期準(zhǔn)確選擇分子育種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大白菜橙色葉球的SCAR標(biāo)記及其該SCAR標(biāo)記用于輔助選擇育種的應(yīng)用。輔助選擇育種方法以彩色大白菜和普通白色大白菜及其雜交二代分離群體的基因組DNA為模板，通過RAPD分析，多次重復(fù)試驗(yàn)，篩選到了與彩色大白菜橙色葉球連鎖的RAPD標(biāo)記，并成功的轉(zhuǎn)化為一個(gè)特異性SCAR標(biāo)記，連鎖分析發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記與橙色葉球的連鎖距離為3.7cm，應(yīng)用這個(gè)SCAR標(biāo)記，可以進(jìn)行大白菜橙色葉球性狀的分子輔助選擇育種。
文檔編號C12Q1/68GK1944678SQ20061010474
公開日2007年4月11日 申請日期2006年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月17日
發(fā)明者張魯剛, 王綺, 張戰(zhàn)風(fēng), 惠麥俠, 張明科 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)