專利名稱：改良皮膚癬菌試驗(yàn)培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種真菌顯色培養(yǎng)基，特別涉及一種能將皮膚癬菌與非皮膚癬菌的真菌快速區(qū)分開的改良皮膚癬菌試驗(yàn)培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
皮膚癬菌是一大類真菌，可以引起人和動(dòng)物皮膚、毛發(fā)和甲板的感染。皮膚癬菌病發(fā)病率十分高，在我國患者總數(shù)估計(jì)高達(dá)數(shù)億之多。在臨床治療前，醫(yī)生常常要為患者進(jìn)行真菌化驗(yàn)，在明確確是真菌感染而且是何種真菌感染以后，才能選擇有效抗真菌藥物進(jìn)行徹底治療。而真菌培養(yǎng)是診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。影響真菌培養(yǎng)的速度和準(zhǔn)確度的關(guān)鍵因素之一就是培養(yǎng)基。
皮膚癬菌試驗(yàn)培養(yǎng)基(dermatophyte test medium，DTM)是一種選擇性培養(yǎng)基，其組成如下

pH5.5±0.1DTM培養(yǎng)基將皮膚癬菌和非皮膚癬菌區(qū)分開的原理為1.皮膚癬菌優(yōu)先利用培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)肽類，產(chǎn)堿，pH升高，培養(yǎng)基(含指示劑酚紅)變紅；大多數(shù)非皮膚癬菌優(yōu)先利用培養(yǎng)基中的葡萄糖，產(chǎn)酸，pH降低，培養(yǎng)早期顏色基本不變，這可能與皮膚癬菌的嗜角質(zhì)性有關(guān)。2.DTM培養(yǎng)基中所含的抗生素和放線菌酮可抑制大部分非皮膚癬菌的生長，而皮膚癬菌的生長不受影響。
DTM培養(yǎng)基有較高的實(shí)用價(jià)值，因?yàn)?、近年來，真菌感染的發(fā)病率在逐年升高，此類疾病的診治是政府衛(wèi)生部門和醫(yī)患雙方關(guān)注的焦點(diǎn)；2、不同抗真菌藥物的抗菌譜不盡相同，某些真菌感染性疾病如甲真菌病治療療程較長，費(fèi)用較高，且藥物均有潛在的不良反應(yīng)，因此菌種鑒定和有針對(duì)性的合理治療對(duì)此類疾病尤為重要；3.傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)鑒定方法對(duì)檢驗(yàn)者的經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)要求較高，目前在國內(nèi)僅有少數(shù)醫(yī)院開展此項(xiàng)目，而且一般需要培養(yǎng)2周左右時(shí)間，而DTM培養(yǎng)基產(chǎn)生陽性結(jié)果的時(shí)間不足一周，且結(jié)果直觀，非專業(yè)人員也能報(bào)告結(jié)果。雖然僅根據(jù)顏色變化，不能將真菌鑒定到種，但對(duì)治療藥物的選擇已提供了足夠的信息。
DTM培養(yǎng)基由Taplin等在“一種新的培養(yǎng)基(BTM)對(duì)皮膚癬菌分離和鑒定的研究”一文首先報(bào)道(Taplin D，Zaias N，Rebell G，等.，皮膚病學(xué)文獻(xiàn)，1969，99203-209.)，在國外已應(yīng)用三十余年，是多項(xiàng)與皮膚癬菌有關(guān)的疾病如甲真菌病的流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室研究等選用的培養(yǎng)基之一。國外已有商品化的DTM培養(yǎng)基，國內(nèi)尚未見此培養(yǎng)基的應(yīng)用報(bào)道。美國幾項(xiàng)關(guān)于DTM的大規(guī)模研究(Pariser D，Opper C.可于診室操作的皮膚癬菌檢測(cè)方法-全國甲真菌病調(diào)查研究。治療雜志，2002，11(3)43-8.)提示臨床醫(yī)生使用該培養(yǎng)基，在診室里就完全可以完成從取材到報(bào)告結(jié)果的全過程，節(jié)約了患者的醫(yī)療費(fèi)用(DTM培養(yǎng)方法$1，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法$25)，有較好的推廣應(yīng)用前景。
但DTM培養(yǎng)基也有其不足之處，主要表現(xiàn)為1.敏感性仍有待提高。申請(qǐng)人對(duì)臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果表明皮膚癬菌的開始變色時(shí)間，即結(jié)果報(bào)告的時(shí)間平均為7.32±0.41d，雖比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法提前1周，若能進(jìn)一步提前，將有利于患者的及時(shí)治療。2.結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)有待改進(jìn)。傳統(tǒng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)為在7d之內(nèi)變色的一般為皮膚癬菌，非皮膚癬菌則與之相反。但我們?cè)谂R床標(biāo)本的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，若按此標(biāo)準(zhǔn)，錯(cuò)判率可＞50％；國外也有研究發(fā)現(xiàn)按此標(biāo)準(zhǔn)有不同程度的假陽性率(Scherer WP，Kinmon K.皮膚癬菌試驗(yàn)培養(yǎng)基與傳統(tǒng)真菌實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)方法的對(duì)比-100例疑似甲真菌病老年患者的研究。美國足病協(xié)會(huì)雜志，2000，90(9)450-9；Salkin，I.F.皮膚癬菌試驗(yàn)培養(yǎng)基對(duì)非皮膚癬菌的鑒定。應(yīng)用微生物學(xué)，1973，26134-137；Salkin IF，Padhye AA，Kemna ME.一種可以鑒別皮膚癬菌的新的培養(yǎng)基。臨床微生物學(xué)雜志，1997，352660-2662.)。3.培養(yǎng)基中的抗生素(金霉素)不耐高溫，需在高壓消毒后才能加入，較為繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的就是DTM培養(yǎng)基所存在的上述不足之處，為人們提供一種改良皮膚癬菌試驗(yàn)培養(yǎng)基。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明應(yīng)用正交設(shè)計(jì)等方法對(duì)現(xiàn)有的DTM培養(yǎng)基進(jìn)行改良，其具體組成如下

pH5.5±0.1本發(fā)明除具備傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和原DTM培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)外，還具有如下優(yōu)點(diǎn)1.將培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分(葡萄糖和大豆蛋白胨)的含量減半，對(duì)變色時(shí)間無顯著影響，對(duì)批量生產(chǎn)較有利，可節(jié)約成本；2.將指示劑由0.02％酚紅替換為0.05‰溴百里酚藍(lán)(BTB)，BTB是一種在微生物培養(yǎng)基中應(yīng)用較廣的酸堿指示劑，其pH值范圍為6.0～7.6，酚紅則為6.8～8.4，而培養(yǎng)基的初始pH值為5.5±0.1，因此BTB比酚紅能更快地指示由酸至堿的變化，且酚紅的變色過程一般為橙黃→淡紅→紅，BTB為黃→綠→藍(lán)，在此培養(yǎng)基上BTB比酚紅更易于人的視覺對(duì)色差的感知，使敏感性提高，結(jié)果報(bào)告時(shí)間提前。對(duì)臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果表明其結(jié)果報(bào)告時(shí)間平均為5.83±0.39d，而原DTM培養(yǎng)基為7.32±0.41d；3.用氯霉素替換原有抗生素，氯霉素是目前真菌實(shí)驗(yàn)室常用培養(yǎng)基-沙氏培養(yǎng)基選用的抗生素，抗菌譜廣，價(jià)廉，而且可在高壓前與其他成分同時(shí)加入，使配制更為簡便；4.將原來DTM配方中放線菌酮的濃度降低一半，即節(jié)約了成本(放線菌酮十分昂貴且不易得到，進(jìn)口管制很嚴(yán)，因?yàn)閷賱《酒?，也起到了對(duì)非皮膚癬菌生長的限速作用；5.根據(jù)非皮膚癬菌的變色明顯滯后于生長，而皮膚癬菌的生長與變色基本同步的特點(diǎn)，我們將判斷標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為開始變色時(shí)菌落直徑≤5mm的為皮膚癬菌，反之則為非皮膚癬菌。對(duì)臨床標(biāo)本的檢測(cè)研究結(jié)果表明用此標(biāo)準(zhǔn)可提高診斷的準(zhǔn)確性，與專業(yè)真菌實(shí)驗(yàn)室的鑒定結(jié)果有高度一致性(Kappa＞0.9)，誤判率控制在5％以內(nèi)，明顯少于以開始變色時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)(P＜0.01)。
可見，本發(fā)明不僅能方便、準(zhǔn)確地區(qū)分皮膚癬菌和非皮膚癬菌，而且敏感性進(jìn)一步提高，判讀結(jié)果的準(zhǔn)確率提高，報(bào)告時(shí)間提前，其配方更經(jīng)濟(jì)，配制更簡便，有利于及時(shí)、合理的抗真菌治療，有較好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
1.培養(yǎng)基配制成分大豆蛋白胨5g葡萄糖5g氯霉素0.0625g放線菌酮 0.1g0.1％溴百里酚藍(lán) 25mL瓊脂 18gHCL(1.0N) 4.6-5.0mL水加至1000mLpH5.5±0.1制法將大豆蛋白胨、葡萄糖和瓊脂加至水中，加熱溶解；邊攪拌，邊加溴百里酚藍(lán)液，用1N Hcl調(diào)節(jié)pH；將放線菌酮、氯霉素加入培養(yǎng)基；121℃10分鐘高壓滅菌。
2.結(jié)果報(bào)告標(biāo)本接種按常規(guī)真菌培養(yǎng)方法，每日定時(shí)觀察培養(yǎng)基變色及菌株生長情況，開始變色時(shí)如果菌落直徑≤5mm，則有95％的可能性為皮膚癬菌，反之則為非皮膚癬菌。
實(shí)施例21.培養(yǎng)基配制成分大豆蛋白胨5g葡萄糖5g氯霉素0.125g放線菌酮 0.3g0.1％溴百里酚藍(lán) 50mL瓊脂 19gHCL(1.0N) 4.6-5.0mL水加至1000mL
pH5.5±0.1制法將大豆蛋白胨、葡萄糖和瓊脂加至水中，加熱溶解；邊攪拌，邊加溴百里酚藍(lán)液，用1N Hcl調(diào)節(jié)pH；將放線菌酮、氯霉素加入培養(yǎng)基；121℃10分鐘高壓滅菌。
2.結(jié)果報(bào)告標(biāo)本接種按常規(guī)真菌培養(yǎng)方法，每日定時(shí)觀察培養(yǎng)基變色及菌株生長情況，開始變色時(shí)如果菌落直徑≤5mm，則有95％的可能性為皮膚癬菌，反之則為非皮膚癬菌。
實(shí)施例31.培養(yǎng)基配制成分大豆蛋白胨5g葡萄糖5g氯霉素0.25g放線菌酮 0.5g0.1％溴百里酚藍(lán) 100mL瓊脂 20gHCL(1.0N) 4.6-5.0mL水加至1000mLpH5.5±0.1制法將大豆蛋白胨、葡萄糖和瓊脂加至水中，加熱溶解；邊攪拌，邊加溴百里酚藍(lán)液，用1N HCL調(diào)節(jié)pH；將放線菌酮、氯霉素加入培養(yǎng)基；121℃10分鐘高壓滅菌。
2.結(jié)果報(bào)告標(biāo)本接種按常規(guī)真菌培養(yǎng)方法，每日定時(shí)觀察培養(yǎng)基變色及菌株生長情況，開始變色時(shí)如果菌落直徑≤5mm，則有95％的可能性為皮膚癬菌，反之則為非皮膚癬菌。
權(quán)利要求
1.改良皮膚癬菌試驗(yàn)培養(yǎng)基，其特征在于由5g/L大豆蛋白胨、5g/L葡萄糖、0.0625～0.25g/L氯霉素、放線菌酮0.1～0.5g/L、0.025～0.1g/L溴百里酚藍(lán)、瓊脂20g/L、1NHCL4.6-5.0mL配制而成。
2.如權(quán)利要求1所述的改良皮膚癬菌試驗(yàn)培養(yǎng)基，其特征在于其pH值為5.5±0.1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種改良皮膚癬菌試驗(yàn)培養(yǎng)基，由5g/L大豆蛋白胨、5g/L葡萄糖、0.0625～0.25g/L氯霉素、放線菌酮0.1～0.5g/L、0.025～0.1g/L溴百里酚藍(lán)、瓊脂20g/L、1N HCL4.8mL配制而成，其pH5.5±0.1。本發(fā)明具備傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和原DTM培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)，且判讀結(jié)果的準(zhǔn)確率提高，報(bào)告時(shí)間提前，價(jià)廉，簡便易行，有利于及時(shí)、合理的抗真菌治療，有較好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。將來一旦開發(fā)成功，成為醫(yī)院檢驗(yàn)科或真菌室的常規(guī)試劑，定有廣闊的商品化的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P1/04GK1900293SQ20061008832
公開日2007年1月24日 申請(qǐng)日期2006年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月11日
發(fā)明者劉維達(dá), 李筱芳, 沈永年, 呂桂霞, 陳偉 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所