專(zhuān)利名稱(chēng)：一種腐蝕性產(chǎn)酸菌的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于腐蝕與防護(hù)領(lǐng)域中的一種新型腐蝕性產(chǎn)酸菌中的生產(chǎn)培育工藝過(guò)程，特別是一種腐蝕性產(chǎn)酸菌的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
海洋微生物引起的腐蝕對(duì)海洋結(jié)構(gòu)物造成了日益嚴(yán)重的危害，其特征是微生物附著于金屬表面并形成生物膜，微生物的活動(dòng)改變了生物膜內(nèi)的微觀環(huán)境條件(如溶解氧、pH值、各種離子含量等)。海洋中的腐蝕性微生物極易引起或加速破壞性極強(qiáng)的局部腐蝕(如縫隙腐蝕、孔蝕)，因而微生物腐蝕造成的危害是相當(dāng)嚴(yán)重的。
好氧微生物在有氧的條件下，經(jīng)呼吸鏈產(chǎn)生的電子通常被氧分子接收。在發(fā)酵條件下，電子被細(xì)胞內(nèi)其他的高氧化還原電勢(shì)的物質(zhì)接收，從而產(chǎn)生有機(jī)酸(如乙酸、乳酸)或無(wú)機(jī)酸(硫酸)。能夠向胞外分泌無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸的微生物被統(tǒng)稱(chēng)為產(chǎn)酸菌。產(chǎn)酸菌是一類(lèi)重要的腐蝕性微生物。隨著各種實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)微生物腐蝕的認(rèn)識(shí)越來(lái)越深入。Mansfeld等人的研究表明，在生物膜內(nèi)部，產(chǎn)酸菌可使周?chē)植縫H值降低，形成強(qiáng)酸性條件。J.A1hajji證明醋酸菌產(chǎn)生的醋酸和硫氧化菌產(chǎn)生的硫酸對(duì)腐蝕有明顯的促進(jìn)作用。
目前對(duì)產(chǎn)酸菌引起的腐蝕研究多采用實(shí)驗(yàn)室模擬生物腐蝕的實(shí)驗(yàn)方法。即采用人造生物膜和特征性酸性代謝產(chǎn)物相結(jié)合的方法來(lái)模擬產(chǎn)酸微生物的腐蝕行為，研究其腐蝕機(jī)理，這種模擬方法的缺點(diǎn)是與實(shí)際腐蝕過(guò)程差距很大，也不能用來(lái)研制抗菌防腐材料。
因此，從實(shí)際環(huán)境中分離純化、篩選到產(chǎn)酸性能好、在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)可以穩(wěn)定培養(yǎng)的產(chǎn)酸菌菌株，并建立培養(yǎng)方法，對(duì)于研究微生物腐蝕機(jī)理和防護(hù)方法具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)，尋求一種從自然環(huán)境中分離純化高性能產(chǎn)酸菌，并探索該菌株在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)工藝，使其在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)能夠穩(wěn)定、高密度培養(yǎng)，為研究產(chǎn)酸菌的腐蝕機(jī)理、微生物腐蝕的控制技術(shù)以及抗菌材料的研制提供方便有利的研究手段。
為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明涉及產(chǎn)酸菌的分離純化及其保藏與鑒定等內(nèi)容。
產(chǎn)酸菌的分離純化以無(wú)菌操作方式，先從在實(shí)海中浸泡180天的銅鎳合金表面上剝離下生物膜，再在室溫下用2216E培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，富集液按10-1，10-2，10-3，10-4進(jìn)行梯度稀釋后在產(chǎn)酸平板上劃線分離，然后挑取生成清晰透明水解圈的菌落進(jìn)一步純化，重復(fù)此步驟直至得到產(chǎn)酸菌的純培養(yǎng)；最后對(duì)所得純培養(yǎng)進(jìn)行斜面?zhèn)鞔?，選取經(jīng)50次傳代后，產(chǎn)酸性能穩(wěn)定的菌株，進(jìn)行保藏。
產(chǎn)酸平板培養(yǎng)基配方包括蛋白胨5-10g；酵母膏1-5g；葡萄糖10-20g；碳酸鈣6-12g；磷酸高鐵0.01-0.03g；海水1000ml；瓊脂20g；pH7.6。
斜面培養(yǎng)基配方包括酵母膏1-3g；磷酸高鐵0.01-0.05g；蛋白胨5-10g；海水1000ml；瓊脂20g；pH7.6。
液體培養(yǎng)基配方包括酵母膏1-3g；磷酸高鐵0.01-0.05g；蛋白胨5-10g；海水1000ml；pH7.6。
產(chǎn)酸菌的保藏與鑒定本發(fā)明中培養(yǎng)和所用的浸麻類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillus macerans)是一種具有強(qiáng)產(chǎn)酸能力的細(xì)菌，對(duì)銅合金有很強(qiáng)的選擇性腐蝕。該菌株已于2004年9月1日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)典型培養(yǎng)物保藏中心登記，保藏號(hào)為CCTCC NO.M204064。
該菌株在斜面培養(yǎng)基上呈淡黃色，菌落表面光滑。在光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈短桿狀。
對(duì)該菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，將所得產(chǎn)酸菌的生理生化特征列表如下表1產(chǎn)酸菌的生理生化特征


注表中+表示陽(yáng)性，-表示陰性。
將新鮮的產(chǎn)酸菌斜面制成菌懸液后，按4％的接種比例接入液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖床震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速260轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度30℃。24小時(shí)后取菌液10ul滴在產(chǎn)酸平板表面，18小時(shí)后觀察產(chǎn)酸平板上形成直徑為1cm的清晰透明水解圈。產(chǎn)酸平板培養(yǎng)基中含有碳酸鈣鹽，因而整個(gè)培養(yǎng)基為白色混濁固體培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)基遇酸時(shí)，若酸性物質(zhì)能與培養(yǎng)基中的碳酸鈣生成可溶性鈣鹽，則混濁的白色固體變成透明的固體物質(zhì)。所分離菌株的菌液在產(chǎn)酸平板上能夠形成清晰的水解圈。這就表明，產(chǎn)酸菌在其新陳代謝過(guò)程中能夠生成并將酸性物排到細(xì)胞外。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有分離純化工藝方法簡(jiǎn)便，原理性能穩(wěn)定，安全可靠，其培養(yǎng)的菌種純正，應(yīng)用效果優(yōu)良等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明培養(yǎng)成的腐蝕性產(chǎn)酸菌應(yīng)用在加速銅合金腐蝕過(guò)程中能降低極化電阻，降低腐蝕電位，加速局部腐蝕。實(shí)例如下實(shí)施例1產(chǎn)酸菌對(duì)銅鎳合金B(yǎng)10腐蝕電位的影響將培養(yǎng)了24小時(shí)的新鮮菌液，按5％的比例接入新鮮的培養(yǎng)基中，監(jiān)測(cè)B10電位隨時(shí)間的變化，以空白培養(yǎng)基為對(duì)照，恒電位儀為美國(guó)M273A電化學(xué)工作站，B10合金在含有產(chǎn)酸菌的培養(yǎng)基中腐蝕電位負(fù)移很明顯，表明其腐蝕速率顯著增加，發(fā)生局部腐蝕的可能性大大增加。
實(shí)施例2產(chǎn)酸菌對(duì)B10合金極化電阻的影響利用線性極化法監(jiān)測(cè)了B10合金在有、無(wú)產(chǎn)酸菌的培養(yǎng)基中的線性極化曲線。線性極化測(cè)試采用經(jīng)典三電極體系，輔助電極為鉑電極，以飽和甘汞電極為參比電極，工作電極為銅鎳合金B(yǎng)10。恒電位儀為美國(guó)M273電化學(xué)工作站。掃描速度為0.4mv/s。將培養(yǎng)了24小時(shí)的新鮮菌液，按5％的比例接入新鮮的培養(yǎng)基中，監(jiān)測(cè)極化電阻隨時(shí)間的變化。以空白培養(yǎng)基為對(duì)照，B10合金線性極化電阻隨時(shí)間的變化關(guān)系清晰。在含有產(chǎn)酸菌的培養(yǎng)基中，B10合金的極化電阻在初始階段越來(lái)越大，這是因?yàn)楫a(chǎn)酸菌在開(kāi)始時(shí)產(chǎn)生的酸較少，而細(xì)菌附著在電極表面，造成了電阻增大。20天后，合金在有菌培養(yǎng)基中的極化電阻迅速下降，并呈不斷減小的趨勢(shì)，這說(shuō)明隨著酸的不斷積累，合金的腐蝕速率開(kāi)始增大。
實(shí)施例3產(chǎn)酸菌對(duì)B10合金的腐蝕將斜面培養(yǎng)基上的新鮮浸麻類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillus macerans)用接種針取一環(huán)接種于液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后，按5％比例接入已滅菌的液體培養(yǎng)基中。將經(jīng)紫外滅菌的B10合金試樣浸入含菌溶液，24天后取出，清除試樣表面腐蝕產(chǎn)物，腐蝕形貌清晰。B10、B30在含有產(chǎn)酸菌的介質(zhì)中的腐蝕要比在無(wú)菌介質(zhì)中嚴(yán)重的多，腐蝕形貌為麻點(diǎn)狀的坑蝕。
權(quán)利要求
1.一種腐蝕性產(chǎn)酸菌的培養(yǎng)方法，其特征在于產(chǎn)酸菌的分離純化以無(wú)菌操作方式，先從在實(shí)海中浸泡180天的銅鎳合金表面上剝離下生物膜，再在室溫下用2216E培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，富集液按10-1，10-2，10-3，10-4進(jìn)行梯度稀釋后在產(chǎn)酸平板上劃線分離，然后挑取生成清晰透明水解圈的菌落進(jìn)一步純化，重復(fù)此步驟直至得到產(chǎn)酸菌的純培養(yǎng)；最后對(duì)所得純培養(yǎng)進(jìn)行斜面?zhèn)鞔?，選取經(jīng)50次傳代后，產(chǎn)酸性能穩(wěn)定的菌株，進(jìn)行保藏。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腐蝕性產(chǎn)酸菌的培養(yǎng)方法，其特征在于產(chǎn)酸平板培養(yǎng)基配方包括蛋白胨5-10g；酵母膏1-5g；葡萄糖10-20g；碳酸鈣6-12g；磷酸高鐵0.01-0.03g；海水1000ml；瓊脂20g；pH7.6。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腐蝕性產(chǎn)酸菌的培養(yǎng)方法，其特征在于斜面培養(yǎng)基配方包括酵母膏1-3g；磷酸高鐵0.01-0.05g；蛋白胨5-10g；海水1000ml；瓊脂20g；pH7.6。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腐蝕性產(chǎn)酸菌的培養(yǎng)方法，其特征在于液體培養(yǎng)基配方包括酵母膏1-3g；磷酸高鐵0.01-0.05g；蛋白胨5-10g；海水1000ml；pH7.6。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腐蝕性產(chǎn)酸菌的培養(yǎng)方法，其特征在于所分離培養(yǎng)的腐蝕性產(chǎn)酸菌應(yīng)用在加速銅合金腐蝕過(guò)程中能降低極化電阻，降低腐蝕電位，加速局部腐蝕。
全文摘要
本發(fā)明屬于腐蝕與防護(hù)領(lǐng)域中的一種新型腐蝕性產(chǎn)酸菌中的生產(chǎn)培育工藝過(guò)程，特別是一種腐蝕性產(chǎn)酸菌的培養(yǎng)方法。產(chǎn)酸菌的分離純化以無(wú)菌操作方式，先從在實(shí)海中浸泡180天的銅鎳合金表面上剝離下生物膜，再在室溫下用2216E培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，富集液按10
文檔編號(hào)C12N1/20GK1912105SQ200610069888
公開(kāi)日2007年2月14日 申請(qǐng)日期2006年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月15日
發(fā)明者劉光洲, 段東霞, 王軍 申請(qǐng)人:中國(guó)船舶重工集團(tuán)公司第七二五研究所